文獻回顧

2-1 B. henselae之命名

1990 年從 human immunodeficiency virus (HIV) 病人身上分離出來，

經 由 分 析 其 細 胞 膜 脂 肪 酸 組 成 發 現 與 Rochalimaea quintana ( 即 為 Bartonella quintana) 類似，但其 genomic DNA 經 EcoRV 作用後產生的圖

譜和 R. quintana 不盡相同[13]，而經由 16S rRNA 分析確認其為新種，故 命名為 Rochalimaea henselae[14]。於 1993 年，經由更進一步的 16S rRNA 序列分析，顯示 Bartonella bacilliformis 與包括 Rochalimaea henselae 的四 種分離株相似度更高，故將 R. henselae 改為 B. henselae[15]。

2-2 B. henselae 之染色體序列

B. henselae 的完整序列於 2003 年由 Alsmark 等人定序完成[16]，

GenBank 編號為 BX897699，NCBI RefSeq 編號為 NC_005956。其染色體 共有 1,931,047 base pair (bp)，共有 1,491 個基因。在 B. henselae 染色體中，

有特殊的高重複性序列 (high fraction of repeated genes) 或部分重複序列 (partially repeated genes)。並於序列分析中發現了 128 個 pseudogenes。B.

henselae 的基因功能可分為，表面蛋白 (surface proteins)、第四型輸出蛋 白系統(type IV secretion system ; TFSS)、質體及 phage genes。

2-3 B. henselae 之 genotype

於 1996 年，經由 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 分析 16S-23S rRNA gene spacer region，將 B. henselae 分成 genotype I 及 II。

genotype I 及 II 之序列有三個 bp 不同[17]。2002 年的研究發現，genotype I 轉錄 35-kDa protein 及 Pap31 protein 的基因序列，與 genotype II 不完全 相同，35-kDa protein 有 8 個 bp 在 genotypes 間不同，而 Pap31 protein 則 有 18 個 bp 的不同。2004 年的研究指出，genotype I 帶有的 virB4 基因的 序列與 genotype II 的也不盡相同[18]。2003 年的研究指出，感染 genotype I 的貓，再以 genotype II 的細菌攻毒 (challenge)，會有 cross-protection 的 作用[19]；然而，感染 genotype II 的貓，再以 genotype I 的細菌攻毒，則 不會有 cross-protection 的作用[20]。因此，genotype 雖然以 16S-23S rRNA gene spacer region 中的 3 個 bp 分型，但在血清學上或染色體中其他基因 序列或表現上亦有所不同。

荷蘭研究團隊指出，貓抓熱病人的淋巴結中，以分離到 genotype I 為 主，故推斷 genotype I 致病力較 genotype II 強[17]。但於另一項德國的研 究卻呈現相反的結果，分離的細菌以 genotype II 為主[21]。故經由上述研 究結果可推論，genotypes 的分佈可能與地域性有關[22]。於 2002 年的研 究發現，不同部位的病灶分離之細菌基因型會有所不同。於肝臟及脾臟 易分離出 genotype I，而於皮膚及淋巴結易分離出 genotye II [23]，另外也

有研究指出，人類的貓抓熱病例通常易分離出 genotype I，而在貓身上卻 較易分離出 genotype II [24]。在上述的研究中可發現，genotype I 之菌株 可能對 B. henselae 所造成的疾病，扮演較重要的角色。但 genotype 間之 差異，對 B. henselae 所造成的確定影響至今仍未有定論。

2-4 B. henselae之生物學特性

B. henselae 為革蘭氏陰性菌，缺乏oxidase 故為厭氧細菌[25]。培養於

巧克力培養基，初代培養需要經過 5-15 天，繼代之後長出菌落則需要 4 天[13]。保菌者為貓，並存在紅血球中[26]，經由貓蚤傳播[1]，於人類造 成貓抓熱[2]、BA 及 BP 等病症[4, 5]。

2-5 B. henselae感染症之研究 2-5-1 臨床症狀及組織病理病變

Bartonella所造成的疾病，在具有免疫力的人會引起貓抓熱[2]，其症

狀為發燒、頭痛與顫抖，症狀可能持續7-14天[27, 28]，並會引起心內膜 炎，患者會發燒與產生皮膚紅疹[3]。在免疫不全的人則會造成血管瘤桿 菌病BA和BP，其症狀為在肝及脾臟會出現血管增生進而形成血管瘤[4, 5]。在免疫不全的病人身上也容易併發其他病症造成病患死亡，例如：

peliosis hepatis [4]。就組織病變上來看，BA 病變有三個特色，(1)小血管 的 增 生 伴 隨 著 多 層 的 增 大 的 內 皮 細 胞 － 上 皮 樣 血 管 瘤 (epithelioid

hemangioma) ; (2)混和著發炎細胞包括嗜中性球及淋巴球包圍在未潰瘍 區 的 血 管 或 較 深 的 已 潰 瘍 區 的 血 管 外 ， 此 現 象 稱 為 化 膿 性 肉 芽 腫 (pyogenic granuloma) ; (3) 可 用 Warthin-Starry staining 看 到 群 聚 的 Bartonella 桿菌。

2-5-2 感染及傳播途徑

保菌者為貓，並存在紅血球中[26]。細菌感染的動物，經由節肢動物 傳播[29]，再因貓抓使帶有細菌之排泄物經傷口而感染人類[1, 30]。從 Bartonella spp.感染老鼠的動物實 驗可發現，細菌經 吸血的節肢動 物

(arthropod)，特別是貓蚤 (Ctenocephalides felis)，在宿主血管內皮細胞上 群聚，經過5天即可進入血流中並結合於紅血球上，進一步入侵紅血球並 大量增殖(圖一)[30, 31]。

2-5-3 B. henselae之流行病學調查

B. henselae的感染在世界各地都曾經被報導過[32]，在亞洲國家，日

本的血清流行率 (seroprevalence) 為9.1-15.1%，菲律賓為68%，新加坡為 48%，而印度為54% [33]。1998年，臺灣出現第1個貓抓熱病例[34]。2006 年臺灣的研究指出，獸醫相關職業的人 (veterinary-associated individuals) 在295人中有血清陽性反應 (seropositive) 的比例為1.7% [33]，獸醫相關 職業的人屬於感染的高危險群，但比例僅1.7%，低於日本的15% [35]。此 研究中亦指出，在台灣有50%感染B. henselae的貓，屬於genotype I及

genotype II的交叉感染，這個比例較世界其他國家高，如泰國的9% [36]。

雖然臺灣獸醫相關職業的人其血清流行率並不高，但因一般人日常生活 中可能常會接觸這些動物，包括貓、狗等，故還是必須小心被感染。

2-6 B. henselae 之致病性因子 (Virulence factors )

近代經由分子生物學的研究，已於 B. henselae 中發現數個重要的致病 性因子[37, 38]。BadA (Bartonella adhesin A) / Vomp (variably expressed outer-membrane proteins) 為 非 纖 毛 性 的 黏 著 因 子 (non-fimbrial adhesion)，使細菌本身自我聚集 (autoaggregation)，並使細菌可黏附於細 胞外基質 (extracellular matrix protein)，進一步造成旁分泌型前血管增生 反應 (paracrine pro-angiogenic response) [39, 40]。在動植物及人的病源菌 中均存在第四型輸出蛋白的系統 (TFSS)，此系統與纖毛組成的通過內膜 及外膜的蛋白通道極為類似。TFSS 可以運送大的分子如 DNA 及蛋白質 等，而研究較多的 TFSS 是 Agrobacterium tumefaciens 的系統 [41]。在 B. henselae 亦有TFSS 的表現－VirB/VirD4，並與 A. tumefaciens 之輸出蛋 白系統類似[42]，可將 BepA–BepG (Bartonella-translocated effector protein) 藉由此系統運送入細胞內。BepA–BepG 進入內皮細胞後，改變內皮細胞 的 表 現 ， 包 括 刺 激 細 胞 增 生 、 抑 制 細 胞 凋 亡 及 使 發 炎 因 子 表 現 (pro-inflammatory activation) ( 圖 二 ) [30, 43] 。 這 些 都 是 造 成 血 管 瘤

(vascular tumour formation) 的原因[44]。

2-7 B. henselae 感染之分子機轉

B. henselae會感染紅血球，細菌在宿主血管內皮細胞上群聚，經過一

段時間後進入血流中並結合於紅血球上，進一步入侵紅血球並大量增 殖，而造成菌血症[30]。B. henselae亦會群聚在巨噬細胞上，刺激其分泌 hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) [45]， 促使血 管生成 因子 (vascular endothelial growth factor；VEGF) 表現，進而啟動血管新生的機制造成內 皮細胞的增生[8, 46]。B. henselae群聚於細胞表面形成菌落，透過侵入體 (invasome)之構造感染進入血管內皮細胞[47]，此步驟被認為是造成血管 增生的重要步驟[48]。在內皮細胞，B. henselae經由活化NF-κB而使細胞 黏著分子 (adhesion molecule) E-selectin及ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) 表現；此外活化NF-κB亦可使IL-8的表現量增加，受感染的 內皮細胞，會產生自泌性(autocrine)的IL-8 [49]，分泌IL-8可使淋巴球穿入 血管內皮細胞，進而引發免疫反應[50]。在human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) 的細胞實驗，經由測試caspase 3 / 7 的活性，發現 B.

henselae 感染後caspase 3 / 7 的活性降低，故可使細胞凋亡現象被抑制 [10, 11]。2005年的研究指出，B. henselae 可抑制Mono Mac 6細胞的凋 亡，並藉由促進cellular inhibitor of apoptosis proteins-1 (cIAP-1) 及-2

(cIAP-2)。在正常情況下的細胞，cIAP可抑制細胞凋亡路徑，並於2001年 有研究指出，cIAP-1及cIAP-2的表現可抑制caspase 3 和9 [51]。B. henselae 感染後可促使cIAP-1及cIAP-2的表現，故caspase 3 和9的表現會降低，達 成抑制細胞凋亡的目的。這可部分解釋B. henselae在體內促進血管增生的 原因，但其詳細訊息傳遞路徑仍不清楚[10, 30]。故我們實驗的目的就是 要釐清，4株不同之B. henselae感染內皮細胞後，其確定引發之訊息傳遞 路徑及與caspase 3 和9的直接關係和表現差異，進一步探討caspase 3 和9 與其上下游的蛋白質，如：Bad、Bcl-xL及cytochrome c等的關連。