細胞反應研究

第三章

第三章 第三章 研究 研究 研究 研究結果 結果 結果 結果

第一節 細胞反應研究

1-1 不同 B. henselae 分離株刺激細胞增生之能力不同

以 B. henselae 的不同分離株感染 HMEC-1 細胞 24、48 和 72 小時後，

由顯微鏡觀察並計數細胞。可發現 Hous 分離株於感染細胞後 48 小時具 有最好的促進增生能力，並在 MOI50 及 100 約為其他分離株的 1.3 倍(圖 三)，且有顯著差異 (p<0.05)；而 JK40 分離株於感染細胞後 72 小時，MOI 為 50 的時候，使細胞增生的能力較其他分離株強 1.4 倍 (圖三)，U-4 分 離株則在 MOI 為 100 的時候，較其他分離株強 1.5 倍 (圖三)，JK40 及 U-4 與其他分離株比較均有顯著差異(p<0.05)。經感染的 HMEC-1 細胞其 增生的數目及密度都較未感染的細胞明顯增加 (圖四)。

1-2 B. henselae 經由抑制細胞凋亡途徑刺激細胞增生

使用西方墨點轉漬法以 MOI50 的 B. henselae 感染細胞 48 小時後的凋 亡相關蛋白質的表現量分析其訊息傳遞之調控路徑，發現 B. henselae 的 感染可調控粒線體的內在凋亡路徑 (mitochondria intrinsic pathway) 中相 關蛋白質之表現。在 Hous 及 JK40 感染的細胞中，Bad、cytochrome c、

caspase 9 及 caspase 3 的表現量都會較 U-4 及 JK47 感染的細胞少。而抗 凋亡蛋白質，Bcl-xL，其在 Hous 感染的細胞中的表現量會較其他菌株感

染的細胞高，而 JK47 感染的細胞則有最少的表現量(圖五)。從量化結果 中可明顯地發現，Bad、cytochrome c 及 caspase 3 在感染 U-4 及 JK47 的 細胞中表現量均比未感染及感染 Hous、JK40 的細胞高約 1.2 倍。JK47 感染的細胞其 caspase 9 表現量為未感染及感染 Hous、JK40 的細胞高約 1.6 倍，而 U-4 感染的細胞則為 1.2 倍。Hous 感染的細胞的 Bcl-xL 表現 量較未感染及感染 U-4、JK40 的細胞高，JK47 感染細胞的表現量最差，

為未感染的 0.6 倍，且均具有顯著差異 (p<0.05) (圖五)。從上述實驗可發 現，B. henselae 促進細胞增生，是經由抑制細胞粒線體內在凋亡路徑 (圖 六)，且 4 分離株促進細胞增生能力皆不同，所以我們想了解，其抑制細 胞凋亡的能力是否也有差異。B. henselae 的不同分離株感染 HMEC-1 細 胞後，以 actinomycin D 刺激其細胞凋亡，於刺激凋亡 24、48 和 72 小時 後，由顯微鏡觀察並計數細胞。Hous 分離株於刺激細胞凋亡 48 小時後，

且 MOI 為 100 的情況下，明顯地較其他分離株有較強的抑制凋亡能力，

約為對照組 (只加入 actinomycin D) 的 1.4 倍 (p<0.05) (圖七)。而於刺激 細胞凋亡 72 小時後，JK40 及 U-4 分離株於 MOI50 及 100 均能有效地抑 制細胞凋亡，比 Hous 及 JK47 分離株強 1.5 倍 (p<0.05) ( 圖七 )。經 B.

henselae 感染的細胞其細胞數目及密度都較只加入actinomycin D 的高

( 圖八 )。我們亦曾以 actinomycin D 刺激細胞凋亡後，再感染 B. henselae 並觀察其抑制細胞凋亡的能力，但 HMEC-1 細胞卻會大量減少，推測這

個結果可能因為加入 actinomycin D 後已破壞細胞某些功能，加入 B.

henselae 感染後，細胞無法負荷其所引起的細胞反應而導致死亡。

1-3 B. henselae 之細胞結合能力與 Genotype 相關

結合能力實驗分為 2 部份，貼附能力及侵入能力。觀察細菌在巧克力 膠上菌落生長情況並計數，菌落數量較多之分離株，代表其細胞貼附能 力或侵入較強 (圖九、圖十) 。實驗結果發現，感染後 48 小時且 MOI100 時，U-4 之貼附能力較 Hous 強 179 倍，而為 JK47 的 3.7 倍，JK40 之貼 附能力較 Hous 強 116 倍，而為 JK47 的 2.4 倍。感染後 72 小時且 MOI50 時，U-4 貼附能力較 Hous 強 16 倍，而 JK40 較 JK47 強 21 倍，於 MOI100 時，U-4 貼附能力較 Hous 強 4 倍，而 JK40 較 JK47 強 3 倍 (圖十一)，整 體而言，U-4 及 JK40 (genotype II) 較 Hous 及 JK47 (genotype I) 具有較好 的貼附能力; 而侵入能力部分，感染後 72 小時，BH 分離株於 MOI50 時 較其他分離株強 5 倍，而 MOI100 時則為 6.8 倍 (圖十二)。感染後 48 小 時且 MOI50 時，Hous 侵入指數為其他分離株的 36 倍，而 MOI100 時為 256 倍。感染後 72 小時，Hous 侵入指數為 JK47 的 3 倍，卻是 U-4 及 JK40 的 22 倍( 圖十三 )，故 Hous 分離株在侵入能力及侵入指數部分有較好的 表現。

1-4 不同 B. henselae 分離株刺激細胞產生細胞激素與抗氧化能力之比較

以 ELISA 測定細胞激素 IL-8 値以評估細胞發炎反應的程度。實驗結 果發現，Hous 及 JK47 分離株會引起較強的細胞發炎反應，約為 U-4 及 JK40 的 1.5 倍 ( 圖十四 )，genotype I 的組別均較 genotype II 的組別表現 量大，且具有顯著差異 (p<0.05)，而同一 genotype 之分離株間對引發 IL-8 表現之能力並無顯著差異。並經由測定 SOD (superoxide dismutase) 之酵 素活性，來觀察細胞因感染所受到的氧化壓力。實驗結果發現，除 JK47 分離株激激感染細胞氧化反應的能力較弱外 (約為控制組之 1.3 倍)，其 餘分離株會使細胞產生顯著的氧化反應，為 JK47 的 1.3 倍且為控制組的 1.7 倍以上(圖十五)，並具有顯著差異(p<0.05)。