研究方法

2-1 細胞反應實驗

2-1-1 B. henselae 細菌感染實驗

將HMEC-1細胞以含5% PSA (penicillin，streptomycin，amphotericin) 之M200培養液培養在96孔培養盤內，每個培養孔內培養10⁴ 個細胞，隔 天換成不含抗生素的M200培養液，以multiplicity of infection (MOI) 50及 100 的 比 例 分 別 感 染 0.5×10⁶ 及 10⁶ 的 菌 數 ， 並 在 72 小 時 後 以 phosphate-buffered saline (PBS) 清洗2次，再加入0.05% trypsin使細胞從培 養皿上分離，並吸取懸浮液至1.5ml微量離心管中，以待細胞計數。於抑 制 細 胞 凋 亡 實 驗 中 ， 細 胞 感 染 後 24小 時加入250nM的 actinomycin D (Sigma-aldrich，USA)，以人工方式刺激細胞凋亡，而後於24、48、及72 小時收取細胞，並以相同方式收集與計數細胞。

2-1-2 細胞之觀察與計數

本實驗將利用倒立式顯微鏡觀察細胞生長情形，並利用typan blue染 劑 (Biological Industries，Israel) 以10:1之比例與細胞混合均勻後，注入 細胞計數器上以倒立式顯微鏡觀察之，可以初步的鑑別細胞的完整性，

並且計數細胞數量。

2-1-3 細菌貼附能力實驗

用 96 孔培養盤以 MOI50 及 MOI100 的 B. henselae 分別感染 1×10⁴個 HMEC-1 細胞，每組實驗為 3 重複。72 小時後以 PBS 清洗兩次，再加入 0.05% trypsin 反應 3 分鐘使細胞懸浮，取部分懸浮液分別稀釋成 2×10^-3 及 2×10^-4倍，並均勻塗抹在巧克力培養基上，於 37℃培養箱中厭氧培養 5 到 7 天至菌落長出，計算菌落數目。由於該數目中同時計算了貼附在細 胞表面與侵入細胞的菌數，因此必須將菌數減去侵入菌數，進而推算出 細菌貼附能力。表示方式為貼附比例 (adherence rate)，即為細菌貼附數 目除以 HMEC-1 細胞數目後，所得之數值為 1 個細胞所貼附的細菌數量。

2-1-4 細菌侵入能力實驗

用 96 孔培養盤以 MOI50 及 MOI100 的 B. henselae 分別感染 1×10⁴個 HMEC-1 細胞，每組實驗為 3 重複。72 小時後，移除上清液後，加入 100µl/ml gentamicin (GIBCO，USA) 反應 2 小時，2 小時後，以 PBS 清 洗 2 次，再加入 0.05% trypsin 反應 3 分鐘使細胞懸浮，取部分懸浮液分

別稀釋成 2x10^-2及 2x10^-1倍，並均勻塗抹在巧克力培養基上，於 37℃培 養箱中厭氧培養 5 到 7 天至菌落長出，進而推算出細菌侵入能力。表示 方式為侵入比例 (invasion rate)，即為細菌侵入數目除以 HMEC-1 細胞數 目，所得之數值為 1 個細胞中侵入的細菌數量。我們以侵入係數 (invasion index) 評估細菌侵入與貼附的比例，其計算方式為侵入比例除以貼附比 例之百分比。

2-2 細胞激素及抗氧化能力之測定

2-2-1 酵 素 結 合 免 疫 吸 附 分 析 法 (enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA)

用6孔培養盤以MOI500的B. henselae感染1×10⁶個HMEC-1細胞，6小時 後，收集上清液於1.5ml微量離心管。使用human IL-8/NAP-1 module set (Bender MedSystems Inc.，USA)。首先配置coating solution，將coating antibody加入PBS，使其濃度為5µg/ml，將coating solution以每孔100µl的體 積加入96孔盤，而後放置4℃隔夜。次日將96孔盤取出，用wash buffer (0.05% Tween 20於PBS) 清洗1次之後進行blocking的步驟，每孔加入 250µl的assay buffer (0.05% BSA，0.05% Tween 20於PBS) 於室溫搖晃2小 時。而後製備標準品，將3µl之IL-8標準品 (200ng/ml) 加入297µl assay buffer使其濃度為2000pg/ml，然後進行序列稀釋使標準品濃度分別為：

1000 pg/ml、500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、63 pg/ml、32 pg/ml和16

pg/ml。Blocking後先將96孔盤以wash buffer清洗2次，再依序加入不同濃 度之標準品，然後加50µl sample diluent，而後將50µl之樣本注入與sample diluent 混 合 。 標 準 品 及 樣 本 皆 注 入 完 成 後 ， 即 可 於 每 孔 加 入 50µl 之 biotin-conjugate (以assay buffer稀釋1000倍) 後於室溫搖晃反應2小時。反 應後以wash buffer清洗3次，每孔加入100µl之streptavidin-HRP (以assay buffer稀釋1000倍) 後於室溫搖晃反應1小時，作用後以wash buffer清洗3 次，每孔加入100µl tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution 後置於室 溫避光約5分鐘直至樣本呈色，而後立即加入100µl 4N硫酸並於OD450下偵 測讀值，每一反應重複3次並取平均值做計算，利用標準品算出濃度對應 公式，樣本讀值經該公式計算後可得IL-8濃度。

2-2-2 抗氧化酵素Superoxide dismutase (SOD) 之測定

用 6 孔培養盤以 MOI500 的 B. henselae 感染 1×10⁶個 HMEC-1 細胞，

6 小時後，收集上清液於 1.5ml 微量離心管。使用 SOD assay kit (Fluka，

Switzerland) 檢測 superoxide dismutase (SOD) 酵素的活性。SOD 可使超 氧化物(O2

-)轉變成過氧化物(H2O2)及氧(O2)，而 kit 中的 water-soluble

tetrazolium salt (WST solution)經超氧化物還原後會產生 water-soluble formazan dye，並可於 OD450偵測。故吸光值愈低表示超氧化物產生較少，

而其 SOD 活性相對較高。首先將 20µl 樣本加入樣本孔及 blank 2，並於 blank 1 及 3 各加入 20µl DDW (double distilled water) 。每孔加入 200µl

WST working solution (1ml WST solution 於 19ml buffer solution)。於 blank 2 及 3 加入 20µl dilution buffer，樣本孔及 blank 1 加入 20µl enzyme working solution (15µl enzyme solution 於 2.5ml dilution buffer)。置於 37°C 反應 20 分鐘，以 ELISA reader 在 OD450下進行測定，每一反應重複 3 次並取平 均值做計算，利用 blank 讀值套入對應公式如下：

SOD activity (%) = {[(Ablank1-Ablank3)-(Asample-Ablank2)] / (Ablank1-Ablank3)} × 100 A：Absorbance

blank 1 中包括 DDW，WST working solution 及 enzyme working solution。

blank 2 中包括 sample solution，WST working solution 及 dilution buffer。

blank 3 中包括 DDW，WST working solution 及 dilution buffer。

經公式計算後可得 SOD 酵素活性，以 SOD activity (%)表示之。

2-3 凋亡相關蛋白質表現量 2-3-1細胞之總蛋白質抽取

細 胞 以 PBS (pH7.4) 清 洗 2 次 後 ， 加 入 200µl lysis buffer (0.5M Tris-HCl，pH7.4，10% SDS，0.5M DTT) 使之與細胞反應5分鐘，將此細 胞溶液抽取至1.5ml微量離心管中，以95℃加熱5分鐘，立刻置於冰上冷 卻，並儲存於-20℃。

2-3-2 蛋白質之定量分析

採用bovine serum albumin (BSA) 製作蛋白質之標準品檢量線，並以

Bradford當染劑反應5分鐘，以分光光度計在OD590下進行蛋白質測定。

2-3-3 西方墨點轉漬法分析 (Western blot assay)

首先進行sodium dodecyl sulfate (SDS) 電泳分析。將預先鑄好的10%

sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel (SDS-PAGE) 從冰箱中取出 後進行電泳，先在於電泳槽入running buffer (0.3% Tris，1.44% Glycine，

0.1% SDS)，注入定量過之經上述方式純化之細胞蛋白質樣品後 (30µg)，

固定120伏特 2小時進行電泳，分析後利用半乾式轉漬 (Hofer TE 22，

Amersham Biosciences ， UK) 將 膠 上 之 蛋 白 質 轉 漬 (transfer) 至 PVDF 膜 (polyvinylidene fluoride) (Hybond-P，Amersham Biosciences，UK) 上，並 將transfer buffer (0.242% Tris，1.44% glycine，15% methanol) 注入轉漬 器，條件為100伏特2小時。轉漬後之濾紙浸於2.5% gelatin，室溫搖晃1小 時 後，將以 Tris-buffered saline (TBS)稀釋1000倍之一級抗體 (β-actin [Chemicon，USA]、cytochrome c、caspase-3、caspase-9 [BioLegend，USA] 、 Bcl-xL [Santa Cruz，USA]或Bad [Cell Signaling，USA] ) 加入轉漬後之 PVDF 膜，並置於4℃隔夜。次日以TBST (TBS，5% Tween 20) 於室溫搖 晃 清 洗 3 次 ， 每 次 皆 為 10 分 鐘 ， 再 以 TBS 稀 釋 10000 倍 之 二 級 抗 體 (anti-mouse IgG與anti-rabbit IgG [Amersham Biosciences，UK] ) 加入 PVDF膜，並於室溫下作用1小時，作用後以TBST搖晃清洗3次，每次皆 為10分鐘；處理後將PVDF膜加入Immobilon (Millipore，USA ) 以反應出

冷光，使用冷光照相系統 (FUJIFILM LAS-3000) 拍照並分析影像。

2-4 二維電泳 (Two dimension-gel electrophoresis ; 2-DE) 2-4-1 樣本製備

將培養4天的1×10⁹菌量收集後，加入550µl lysis buffer (7 M urea，2 M thiourea，4 % CHAPS，0.1% protease inhibitor [Amersham Biosciences，

UK ] )，然後以13000rpm離心30分鐘取上清液，即為蛋白質。並以2-D Quant Kit (Amersham Biosciences，UK) 測量蛋白質濃度後，置於-80 °C 保存。

2-4-2 二維電泳系統分析

使用 2-D Clean-Up Kit (Amersham Biosciences，UK) 純化由上述方法 備製之 600 µg 蛋白質，然後重新懸浮在 350 µl 的 rehydration buffer (7 M urea，2 M thiourea，4 % CHAPS，20 mM DTT，1 % IPG buffer，0.002 % bromophenol blue) 。第一維膠體電泳使用 18 公分且 pH 值為 3-10 之 IPG strips (Amersham Biosciences，UK)，使用 Ettan IPGPhor II (Amersham Biosciences，UK) ，先以 30V rehydration 16 小時，並於以下的 program 進行 IEF (isoelectric focusing)：電壓 500V，時間 1 小時；電壓 1000V，

時間 1 小時；電壓 8000V，時間 8 小時。經 IEF 後將 strip 放入平衡緩衝 溶液 (6 M urea，2 % SDS，50 mM Tris-Cl pH 8.8，含有 1 % DTT 之 20 %

glycerol) 使其作用 15 分鐘，其後再轉移到含有 2.5 % iodoacetamide 之 平衡緩衝溶液，同樣作用 15 分鐘。第二維膠體電泳使用 12 % SDS-PAGE gel，將 IPG (immobilized pH gradient，Amersham Biosciences，UK) strip 放入膠體後使用 PROTEAN II xi cell tank (Bio-Rad，USA) 以 35 mA 進行 電泳。完成第二維膠體電泳後以 coomassie brilliant blue R250 染色，使用 Powerlook 1120 (UMAX ， USA) 照 膠 系 統 ， 影 像 分 析 系 統 則 使 用 ImageMaster^TM 2D Platinum version 5.0 (Amersham Biosciences，UK)。將 有差異的蛋白質點取下後，進行 matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) - time of flight (TOF) -TOF 分析，所得之序列使用 MASCOT 資 料庫分析。

2-5 RNA表現量之測定 2-5-1 細菌之total RNA抽取

首先將lysozyme (GeneMark，USA) 溶於TE buffer (10mM Tris-Hcl pH 7.5，1mM EDTA pH8 )使其濃度為4mg/ml。刮取2盤 (生長4天) B. henselae (約2×10⁸個菌) 至500µl lysozyme solution，並置於室溫反應30分鐘。加入 1ml Trisolution (GeneMark，USA)後於4°C以12000×g離心10分鐘，將上清 液抽取到新的1.5ml微量離心管，加入200µl chloroform搖晃15秒，並置於 室溫3分鐘，然後於4°C以12000×g離心15分鐘，將上清液抽取到新的1.5ml

40 個循環 微量離心管，加入500µl isopropenol (Scharlau，Spain)，並置於室溫10分 鐘 ， 然 後 於 4°C以12000×g離心10分鐘，移 除上清 液後加入1ml 70%

ethanol，再於4°C以12000×g離心5分鐘，移除ethanol後風乾10分鐘，加入 30µl diethylpyrocarbonate (DEPC) water，以65°C乾浴20分鐘，抽取之RNA 存放於-20°C。而感染後細菌的RNA收集方法為，用6孔培養盤以MOI50 的B. henselae感染1×10⁶個HMEC-1細胞，分別於24、48和72小時收取 RNA。使用分光光度計在OD260下測定，RNA濃度可經由下列公式而得：

RNA濃度(ng/µl)= OD260 × 稀釋倍數 × 40 (ng/µl)

2-5-2 即 時 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Real-time polymerase chain reaction ; RT-PCR)

使用 two-step RT-PCR 的方式。使用 high capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems，USA)，將 random primers 加入 RNA 樣本使總體積為 20µl，並置於 37℃ 2 小時反應。加入 2X SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems，USA)、forward (F)和 reverse (R)引子後進 行定量 PCR。定量 PCR 的設定條件為：

1. 50℃ 2 分鐘 2. 95℃ 10 分鐘 3. 95℃ 15 秒 4. 60℃ 1 分鐘

所有的步驟皆使用 Applied Biosystems 7300 real-time PCR system，並使用 Comparative CT method 分析。實驗使用之 internal control 為 B. henselae 16S rRNA，而所有引子序列如表一。

2-6 基因序列之比較

2-6-1 Genomic DNA 之抽取

使用 DNA clean / extraction Kit (GeneMark，Taiwan) 抽取 genomic DNA。刮取 1 盤 B. henselae (約 1×10⁸個菌) 至 1.5ml 微量離心管，加入 200µl extraction solution 回溶，再加入 20µl 的 protease K 混合均勻後，置 於 56℃培養箱反應 3 小時。反應後加入 200µl binding solution 並混合均 勻，於 70℃水浴槽反應 10 分鐘，反應後加入 200µl 99.8% ethanol 並混合，

將混合液移入已套入收集管之 spin column 中，以 13000rpm 離心 1 分鐘，

移除收集管中的液體後，再加入 300µl binding solution，以 13000rpm 離 心 1 分鐘，移除收集管中的液體後，再加入 700µl wash solution，以 13000rpm 離心 1 分鐘，移除收集管中的液體，這個步驟重複 2 次。將 spin column 與收集管以 13000rpm 離心 3 分鐘，將 spin column 套入新的 1.5ml 微量離心管，分 2 次加入預熱的(70℃) 150µl elution buffer，以 13000rpm 離心 3 分鐘，微量離心管中收集之液體即為 genomic DNA，存放於-20℃。

2-6-2 聚合酶連鎖反應 (PCR)

將表二中之引子以四分離株之 genomic DNA 為模板 (template)，及

使用 PCR Master Mix (GeneMark，Taiwan)，於循環控溫儀 (Mastercycler gradient 5331，Germany) 中進行聚合酶連鎖反應。

反應管成分如下：

模板 DNA 5µl F 引子(10µm/ml) 1µl R 引子(10µm/ml) 1µl PCR Master Mix 10µl DDW 13µl 總體積 25µl

反應條件如下：

1. 95℃ 2 分鐘 2. 95℃ 1 分鐘

3. 50℃ 1 分鐘 35 個循環 4. 72℃ 1 分鐘

5. 72℃ 15 分鐘 2-6-3 基因定序及比對

聚合酶連鎖反應後所得的產物，委託明欣生物科技股份有限公司代為 定序，使用之機型為 ABI3730，利用 Sanger Method ( dideoxynucleotide chain termination ) 之實驗原理進行核酸定序。以 BLAST 比對定序後，使

用 Vector NTI8 ( InforMax, Inc.，USA) 軟體進行各分離株間序列之比對。

2-7 統計學分析

實驗結果之數據分析使用軟體 JMP^® 7.0 (SAS Institute Inc.，USA) 之單 因子變異數分析 (One-Way ANOVA Procedure) 進行統計學分析。各組間 之 p 值小於 0.05 即判定具有顯著差異。

第三章 第三章

第三章 第三章 研究 研究 研究 研究結果 結果 結果 結果

第一節 細胞反應研究

1-1 不同 B. henselae 分離株刺激細胞增生之能力不同

以 B. henselae 的不同分離株感染 HMEC-1 細胞 24、48 和 72 小時後，

由顯微鏡觀察並計數細胞。可發現 Hous 分離株於感染細胞後 48 小時具 有最好的促進增生能力，並在 MOI50 及 100 約為其他分離株的 1.3 倍(圖 三)，且有顯著差異 (p<0.05)；而 JK40 分離株於感染細胞後 72 小時，MOI 為 50 的時候，使細胞增生的能力較其他分離株強 1.4 倍 (圖三)，U-4 分 離株則在 MOI 為 100 的時候，較其他分離株強 1.5 倍 (圖三)，JK40 及

由顯微鏡觀察並計數細胞。可發現 Hous 分離株於感染細胞後 48 小時具 有最好的促進增生能力，並在 MOI50 及 100 約為其他分離株的 1.3 倍(圖 三)，且有顯著差異 (p<0.05)；而 JK40 分離株於感染細胞後 72 小時，MOI 為 50 的時候，使細胞增生的能力較其他分離株強 1.4 倍 (圖三)，U-4 分 離株則在 MOI 為 100 的時候，較其他分離株強 1.5 倍 (圖三)，JK40 及