文獻回顧

1.3.1 微生物表面顯示發展與應用之相關文獻

微生物細胞表面顯示技術應用範圍廣泛，Valls (2000)等人將 mouse metallothionein I (MT) 蛋白質基因片段融合在 Neisseria gonorrhoeae IgA protease 的 beta-domain，成功顯示在耐重金屬菌，Ralstonia eutropha CH34 strain 的表面，並能夠增強固定化 Cd²⁺ (Figure 1-2) ⁸ 。

Figure 1- 2 (A)藉 Neisseria gonorrhoeae IgA 表現 metallothionein I (MT) 蛋 白質之示意圖⁸。(B)表現 MT 的 R. eutropha MTB 及 R. eutropha CH34 wild type, 分別在含有不同濃度 Cd²⁺ 的培養基中，累積 Cd²⁺的能力⁸。

Wei Wei (2012) 等人將來自 Samonella typhimurium 的 gol regulon 中的 gold-specific sensory protein, GolS 編入 E. coli 中，並在其下游加上紅色螢 光蛋白，使重組的 E. coli 對 Au³⁺離子具有高靈敏性及選擇性的偵測外，接 著利用 Lpp-OmpA 將在 gol regulon 中，對於 Au⁺離子具有專一性的 putative gold-chaperone, GolB 顯示在細胞表面(Figure 1-3(i))，表現 GolB 的 E. coli 可以有效在含有不同金屬離子的培養基中，選擇性的吸附 Au³⁺離子((Figure 1-3(ii)、(iii))，並且利用一個 cysteine-specific 蛋白酶, papain, 即可以將 E.

coli 表面吸附的金粒子回收，且 E. coli 可以再繼續使用⁹。

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Figure 1- 3 (i) gold(I)-specific protein GolB 經由外膜蛋白 OmpA 顯示在 E.coli 細胞表面之示意圖⁹。(ii) 箭頭處為 Au 粒子沉積在 GolB 顯示於大腸 桿菌表面之 TEM 圖⁹。iii) GolB 未顯示在誘導後的大腸桿菌表面之 TEM 圖⁹。(ii & iii 皆培養於含有 50mM HAuCl4 (Au³⁺)的培養基中)

Soma (2012) 等人，將來自 Thermobifida fusca YX (Tfu0937) 的 BGL 蛋白融合到錨定蛋白 BLC (Tfu0937/Blc)的不同融合位點，並調查纖維二糖 的消耗；將異丙醇合成途徑引入 E. coli，調查這些菌株並比較異丙醇生產 過程中，葡萄糖的含量，基於試驗結果，TA212/pTA411 菌株被選定為能 從纖維二糖直接生產異丙醇，其發酵 21 小時能夠生產 69.0 ± 11.6 mM 的異 丙醇¹⁰。

Park (2013) 等人發展一個以 Bacillus anthracis 的 exosporal 蛋白質，

BclA，作為錨定區域的細胞表面顯示平台，將兩個不同大小的蛋白質，分 別是來自 Bacillus sp. 的 endoxylanase (XynA, 21.2 kDa) 及 monooxygenase (P450 BM3m2, 120 kDa) 融合在 BclA 的 C 端區域，實驗結果顯示，其中 BAN 平台能夠成功將上述兩個不同大小的蛋白質分泌並顯示於 E. coli 的 表面，且蛋白質仍具有高效率及穩定性¹¹。

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Figure 1- 4 (A)BclA 在細菌表面示意圖，NTD 為 BclA 的 N 端區域，CLR 為 GXX 三重複 collagen-like 區域，CTD 為 BclA 的 C 端區域¹¹。(B)表面 錨定載體(pTJ1-BAN, pTJ1-BANC 及 pTJ1-BAF)、BclA 蛋白質的結構域 (NTD, 灰色部分; CLR, 黑色部分, CTD, 斜線部分) 及目標蛋白質(白色部 分). (Ptac; tac promoter, POI; protein of interes) ¹¹。 (C)免疫螢光共軛焦顯微 鏡圖像，E. coli 藉 BAN 平台表現 XynA 蛋白質¹¹。 (D) 免疫螢光共軛焦 顯微鏡圖像，E. coli 藉 BAN 平台表現 BM3 蛋白質。細胞染色藉由 FITC conjugated anti-FLAG-antibody¹¹.。(scale bar = 3 μm)

1.3.2 生物合成金屬奈米粒子之相關文獻

利用微生物作為合成金屬奈米粒子反應器已廣泛的被研究，除了使用

本身具有合成金屬奈米粒子特性的微生物外，也有許多利用重組菌株的方 式，讓微生物合成出最佳化及理想化的金屬奈米粒子。

自 然 界 中 有 許 多 蛋 白 質 或 胜 肽 被 發 現 能 夠 結 合 重 金 屬 ， 如 oligoglutathione peptide Phytochelatin (PC)，已被應用於移除重金屬，而不 同尺寸的 PC 能夠藉由 phytochelatin synthase (PCS)合成，且其與銅、銀、

鉛及汞等重金屬能夠形成金屬錯合物。Chen (2008) 等人利用 E. coli 表現

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Schizosaccharomyces pombe 的 PCS 產生 PCs，並透過控制 PCs 的 population，

E. coli 能夠產生尺寸均勻的 CdS 奈米晶^12,13。

除了 PC 外，Metallothionein (MT)也是能夠直接結合銅、鎘及鋅的蛋 白質。Park (2010) 等人利用重組 E. coli 表現 Arabidopsis thaliana 的 PCS (AtPCS)及/或 Pseudomonas putida MT (PpMT)，並合成出多種的金屬奈米 粒子，如半導體金屬奈米粒子(Cd、Se、Zn、Te)；磁性金屬奈米粒子(Fe、

Co、Ni、Mn)以及貴重金屬奈米粒子(Au、Ag)等，並發現金屬離子的濃度 可以控制金屬奈米粒子的尺寸，合成出的奈米粒子仍具有其特性，如磁性 金屬奈米粒子仍具有磁性¹³。

Figure 1- 5 多種的半導體金屬奈米粒子 a) CdZn, b) CdSe, c) CdTe 及 d) SeZn 藉由表現 AtPCS 的重組 E.coli 合成；e) CdZn, f) CdSe, g) CdTe 及 h) SeZn 藉由表現 PpMT 的重組 E.coli 合成；i) CdZn, j) CdSe, k) CdTe 及 l) SeZn 藉由 AtPCS 及 PpMT 兩者都表現的重組 E.coli 合成。每個 HRTEM 圖像上顯示的距離是奈米粒子晶格的面間距¹³。

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Kamiya (2011) 等 人 藉 由 E. coli 表 現 GLD-mediated cofactor regeneration 系統，此系統藉由外加丙三醇讓 E. coli 產生 electron-donating cofactor，nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)，將 Au³⁺ 離子還原成尺 寸範圍在 7.2-29 nm，平均直徑在 19.5 ± 5.8 nm (n=100) 的 Au 奈米粒子，

使 E. coli 做為一個能在細胞內合成 Au 奈米粒子的反應器 (Figure 1-6)¹⁴。

Figure 1- 6 (A)重組 E. coli 藉由 cofactor regeneration 系統合成 Au 奈米粒子；

(B)TEM 分析(a)合成金奈米粒子的重組 E. coli 及(b)、(c)其合成的 Au 奈米 粒子¹⁴。

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