結論

微生物細胞表面顯示技術應用範圍廣泛，而本實驗藉由來自 FhuA、截 短的 OmpA 及 IgA protease 作為載體蛋白，將乘客胜肽顯示於 R. eutrpha 之表面。根據實驗結果分析，證實此三種載體蛋白，無論於 E.coli 或 R.

eutropha 中，皆成功易位於細胞外膜，同時能顯示異源性胜肽，gold-binding peptide 於 R. eutropha 表面，並能夠將 13.3 nm Au 奈米粒子結合於細胞表 面上，且在顯示之成效方面以 FhuA 及 IgA protease 較為顯著。進一步以 FhuA-passenger 系統將 Pt-{100} binding peptide (T7) 及 Pt-{111} binding peptide (S7)顯示於細胞表面，發現兩種胜肽顯示於 R. eutropha 表面並仍具 合成 Pt nanoparticles 之功能，雖無法如 Chiu (2011)等人利用此兩種胜肽分 別合成出由 6 個{100}面組成的立方體 Pt nanocrystal，及由 4 個{111}面組 成的四面體 Pt nanocrystal ²⁵，但仍可嘗試其他條件，表示使用 E.coli FhuA 作為載體蛋白之策略適合顯示異源性胜肽在細胞表面的生物工程應用。

由於生物性的合成方法具有無毒並對環境友好性的特質，因此，利用

微生物作為合成金屬奈米粒子反應器已廣泛的被研究。本實驗藉帶有 melA 基因片段的重組 E.coli，表現 tyrosinase 並催化 L-DOPA，產生出黑色素並 合成 Au、Cu、Mn、Pt 及 Ni 等多種金屬奈米粒子外，亦能合成 AgCu 合 金奈米粒子，且 AgCu 合金奈米粒子在抗菌測試中，比起等量之 Ag 奈米 粒子有較好的抗菌效果。進一步將 FhuA-GBP 系統使用於 R. etli 及帶有 melA 基因片段之大腸桿菌，使其能將合成之 Au 奈米粒子顯示於細胞表面 上。

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實驗方法與材料

微生物表面顯示系統之發展與應用

細菌菌株、生長條件及 cloning

所有 R. eutropha 細胞在 28℃，轉速 200rpm 下，生長於含 50μg/mL kanamycin 的 LB 培養基中 overnight，在稀釋(1:1000)於含有 0.2% arabinose 的 LB 培養基中。本研究使用之菌株及質體、Primers 皆列於 Table S1 及 Table S2、Table S3 中。標準的 conjugation 操作步驟及 E. coli S17 用於產生 R.

eutropha H16 菌株。Cloning 使用程序進行在 E. coli 中(Figure S2)。

螢光顯微鏡分析

細胞使用 0.2% arabinose 誘引紅色螢光蛋白 6 至 12 小時後，固定於以 PBS medium 配製之 1% agarose 的薄層上，Phase contrast 及螢光顯微鏡圖 以 ZEISS Axio Scope.A1 Microscope，EC Plan-NEOFLUAR 100×/1,3 oil Ph3 觀察。

分析 gold-binding peptide 顯示於 R. eutropha 表面之成效

以 0.2% arabinose 誘引之細胞 300 L 於 1000 L 15 nM 金奈米粒子中 培養 2-3 小時，在以 8000 rpm 轉速離心 1 分鐘，丟棄上清液後，以已滅菌 之去離子水清洗三次。取已清洗之細胞約 3 L 於鍍碳銅網之暗面，放置 2-3 分鐘後以濾紙之尖處輕觸銅網，將多餘溶液分離。本研究所使用之 TEM 為 JEOL JEM-1200EX II。

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利用 FhuA-passenger 系統顯示不同的胜肽

細胞加入 0.2% arabinose 及 1mM Pt⁴⁺ 離子溶液誘 12 小時後，離心並將上 清液保留，細胞則以 PBS buffer 清洗三次。取上清液及已清洗之細胞各約 3 L 於鍍碳銅網之暗面，放置 2-3 分鐘後以濾紙之尖處輕觸銅網，將多餘 溶液分離。本研究所使用之 TEM 為 JEOL JEM-1200EX II。

合成 13.3 nm 球形金奈米粒子

13.3 nm球形金奈米粒子藉由citrate還原HAuCl₄。HAuCl₄水溶液 (1 mM, 250 mL) 在加裝有迴流裝置之圓底燒瓶中攪拌並加熱至劇烈沸騰後，

快速加入 trisodium citrate (38.8 mM, 25 mL)，並繼續加熱15分鐘，期間溶 液顏色會由淡黃色轉變至深紅色，在以室溫狀態下持續攪拌至冷卻。金奈 米粒子之尺寸由TEM (JEOL JEM-1200EX II)區分，平均尺寸為13.3nm，以 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek)測量吸收值並根據Beer’s law 在波 長520 nm，extinction coefficient 為 ，金奈米粒子溶液 濃度為15nM。

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利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子與應用

細菌菌株、生長條件及 cloning

所有 Rhizobium etli 細胞在 28℃，轉速 200rpm 下，生長於 TY 培養基 中生長於 overnight，在稀釋(1:1000)於含有 0.2% arabinose 的 TY 培養基中。

E. coli DH5 strains 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於含有 kanamycin (50

g/mL) LB 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM

再稀釋(1:1000)於含有 1mM 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine (L-DOPA)的 TY 培養基中 12 小時後，直接加入 1mM Au³⁺ (HAuCl₄．3H₂O, Acros Organics)，或以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，上清液加入 1mM Au³⁺。

利用重組大腸桿菌合成不同的金屬奈米粒子

重組 E. coli DH5 strains, YCY_203, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長 於含有 kanamycin (50 g/mL) LB 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM L-DOPA 的 M9 或 LB 培養基中約 12 小時後直到產 生約 50.71  3.40 g/mL 黑色素，以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，

上清液分別加入 2.0 mM Au³⁺ (HAuCl₄．3H₂O, Acros Organics), Cu²⁺ (CuCl₂, Acros Organics), Mn²⁺ (MnCl₂．4H₂O, Acros Organics ), Ag⁺(AgNO₃, Acros

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Organics), Pt⁴⁺ (H₂PtCl₆．6H2O, Acros Organics), and Ni²⁺ (NiSO₄．6H2O, Acros Organics) 及 Ag⁺、Cu²⁺ 比例為 1:1 mM。

調控金屬奈米粒子之大小

重組 E. coli DH5 strains, YCY_203, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長 於含有 kanamycin (50 g/mL) M9 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM L-DOPA 的 M9 培養基中約 12 小時後直到產生約 50.71  3.40 g/mL 黑色素，以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，上 清液分別加入 2.0 ，1.0，0.5 mM Au³⁺ (HAuCl₄．3H₂O, Acros Organics), Cu²⁺

(CuCl₂, Acros Organics)，及將 50.71  3.40 g/mL 黑色素稀釋為 25 及 10 μg/mL，並分別與 2.0 mM Au³⁺ (HAuCl₄．3H₂O, Acros Organics), Cu²⁺

(CuCl₂, Acros Organics)進行反應。

金屬奈米粒子之應用

重組 E. coli DH5 strains, YCY_203, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長 於含有 kanamycin (50 g/mL) 的 LB 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含 有 100nM IPTG 與 L-DOPA 的 LB 培養基中約 12 小時後直到產生約 50.71

 3.40 g/mL 黑色素，以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，上清液加 入 Ag⁺、Cu²⁺ 比例為 1:1 mM 進行反應。將反應所得之銀銅奈米粒子離心 並以滅菌水清洗三次並乾燥。E. coli DH10B strains, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於 LB 培養基 overnight，稀釋(1:1000) LB 培養基中 4 小時後，添 加 100 與 150 g/mL 銀，銀銅合金奈米粒子繼續培養 8 小時，再將各菌液 分別做 10、100 倍等之稀釋並取 8L 點於 LB-agar 盤上。

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顯示重組大腸桿菌合成的金奈米粒子於細胞表面

重組 Rhizobium etli, YCY_202, 在 28℃，轉速 200rpm 下，生長於 TY 培養基中 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 1mM L-DOPA 及 0.2% arabinose 的 TY 培養基中 12 小時後，直接加入 1mM Au³⁺並進一步生長 2-3 小時，

以 13500rpm 離心 1 分鐘並以去離子水清洗三次。

重組 E. coli DH5 strains, YCY_201, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長 於含有 kanamycin (50 g/mL)及 clro(g/mL )的 M9 培養基中 overnight，稀 釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM L-DOPA 的 M9 培養基中約 12 小時 後直到產生約 50.71  3.40 g/mL 黑色素，直接加入 1mM Au³⁺並進一步生 長 2-3 小時，以 13500rpm 離心 1 分鐘並以去離子水清洗三次。

穿透式電子顯微鏡(TEM)與元素分析

上述之樣品取 3-5L 於鍍碳銅網之暗面，放置 2-3 分鐘後以濾紙之尖 處輕觸銅網，將多餘溶液分離。本研究所使用之 TEM 為 JEOL JEM-1200EX II 。 各 奈 米 粒 子 之 元 素 分 析 ， 使 用 場 發 射 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (JEOL JSM-7600F)附 INCA X-Max EDS 測量，上述之樣品取 10L 於矽晶片上，

並以高溫使溶液快速揮發即得之；而銀銅(1:1)及銀銅(0.25:1)奈米粒子則為 乾燥後之樣品直接置於碳膠帶上進行測試。

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各奈米粒子平均直徑之計算

各奈米粒子之平均直徑皆使用軟體 image J 做計算，選擇要計算之圖 像檔案後，先設定該圖像原先之 scale bar，裁切出要計算的部分並調整圖 像之明亮及對比，再使用”Threshold”功能將不要的背景移除，只留下奈米 粒子，再以”Analyze particles”功能得到奈米粒子之尺寸。利用下列公式即 可計算出奈米粒子之直徑。(d=diameter, A=area)

d = √𝐴/𝜋

標準品黑色素之定量

取 1mg 之黑色素(Sigma)溶解於 1N NaOH 調整至 pH 值=12 的 M9 培養基 中，再分別稀釋為 2、20、35、50、70 及 100 μg/mL，以 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek)測量吸收波長 280 nm 之吸收值，並以測得之吸收值做 線性回歸。

Figure S1 1mg 之黑色素溶解於以 1M NaOH 調整至 pH=12 的 M9 培養基中，

再分別稀釋為 2、20、35、50、70、100 ug/mL，以吸收波長 280nm 測得 之吸收值並做線性回歸。

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Figure S2Cloning project flowchart.

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Table S 1 Bacterial strains used in this study

Strain Relevant genotype Construction and source

R. eutropha H16 Wild type DSM 428

pYCY_ R. eutropha pBAD-rfp bbr

pYCY_037 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_052 R. eutropha

pBAD-rfp-gbp bbr

pYCY_038 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_050 R. eutropha

pBAD-fhua bbr

pYCY_013 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_067 R. eutropha pBAD-fhua-gbp bbr pYCY_063 conjugated

into R. eutropha H16 pYCY_107 R. eutropha

pBAD-fhua-rfp bbr

pYCY_027 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_051 R. eutropha

pBAD-fhua-rfp-gbp bbr

pYCY_039 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_060 R. eutropha

pBAD-ompa-gbp bbr

pYCY_049 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_080 R. eutropha

pBAD-ompa-rfp bbr

pYCY_082 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_079 R. eutropha

pBAD-ompa-rfp-gbp bbr

pYCY_081 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_068 R. eutropha

pBAD-ss-rfp-iga bbr

pYCY_007 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_073 R. eutropha

pBAD-ss-gbp-iga bbr

pYCY_071 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_263 R. eutropha

pBAD-fhua-t7 bbr

pYCY_226 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_264 R. eutropha

pBAD-fhua-s7 bbr

pYCY_225 conjugated into R. eutropha H16 E. coli DH10B

pYCY_037 E. coli DH10B pBAD-rfp bbr

pYCY_037 transformed into E. coli DH10B pYCY_027 E. coli DH10B

pBAD-fhua-rfp bbr

pYCY_027 transformed into E. coli DH10B.

pYCY_007 E. coli

pBAD-ss-rfp-iga protease bbr

pYCY_007 transformed into E. coli DH10B.

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Strain Relevant genotype Construction and source E. coli DH5

pYCY_038 E. coli

pBAD-rfp-gbp bbr

pYCY_038 transformed into E. coli DH5α.

pYCY_039 E. coli

pBAD-fhua-rfp-gbp bbr

pYCY_039 transformed into E. coli DH5α.

pYCY_082 E. coli

pBAD-ompa-rfp bbr

pYCY_082 transformed into E. coli DH5α.

pYCY_081 E. coli

pBAD-ompa-rfp-gbp bbr

pYCY_081 transformed into E. coli DH5α.

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Table S 2 Plasmids used in this study

Strain Relevant genotype Construction and source pYCY_037 pBBRMCS plasmid with

pBAD-rfp

pYCY_020 pBBRMCS plasmid with 2494 pBbE5K-rfp

pYCY_004 pBBRMCS plasmid with pTrc-ss-gbp-iga protease pYCY_033 pBBRMCS plasmid with

2494-rfp-gbp

PCR fragments were amplified with primers 11 and 12, pYCY_037 as template. The PCR

products were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_020.

pYCY_038 pBBRMCS plasmid with pBAD-rfp-gbp

rfp-gbp fragments were treated with EcoRI and BamHI from pYCY_033, and cloned into plasmid pYCY_037.

pYCY_013 pBBRMCS plasmid with pBAD-fhuA

PCR fragments were amplified with primers 09 and 10, pYCY_027 as template. The PCR

products were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_037.

pYCY_063 pBBRMCS plasmid with pBAD-fhuA-gbp

gbp fragments were amplified with primers 35 and 36 by annealing. The gbp fragments were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_027.

pYCY_027 pBBRMCS plasmid with pBAD-fhuA-rfp

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Strain Relevant genotype Construction and source pYCY_039 pBBRMCS plasmid with

pBAD-fhuA-rfp-gbp

PCR fragments were amplified with primers 11 and 12, pYCY_037 as template. The PCR

products were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_027.

pYCY_049 pBBRMCS plasmid with pBAD-ompA-gbp

PCR fragments were amplified with primers 23 and 24, E. coli colony as template. The PCR

products were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_037.

pYCY_082 pBBRMCS plasmid with pBAD-ompA-rfp

PCR fragments were amplified with primers 41 and 42, pYCY_049 as template. The PCR

products were treated with NdeI and BglII, and cloned into plasmid pYCY_037.

pYCY_081 pBBRMCS plasmid with pBAD-ompA-gbp-rfp

PCR fragments were amplified with primers 40 and 42, pYCY_049 as template. The PCR

products were treated with NdeI and BglII, and cloned into plasmid pYCY_037.

pYCY_007 pBBRMCS plasmid with pBAD-ss- rfp-iga protease

42

Strain Relevant genotype Construction and source pYCY_071 pBBRMCS plasmid with

pBAD-ss- gbp-iga protease

pbad fragments were treated with PstI and EcoRI from pYCY_037, and cloned into plasmid pYCY_004.

pYCY_226 pBBRMCS plasmid with pBAD-fhua-t7

t7 fragments were amplified with primers 109 and 110 by annealing.

The t7 fragments were treated with NdeI and XhoI, and cloned into plasmid pYCY_027.

pYCY_225 pBBRMCS plasmid with pBAD-fhua-s7

s7 fragments were amplified with primers 111 and 112 by annealing.

The s7 fragments were treated with NdeI and XhoI, and cloned into plasmid pYCY_027.

43

Table S 3 Primers used in this study

Primers Sequence

009_FhuA EcoRI fw TTTTgaattcaaaagatctagatcttttaagaaggagatataatggc 010_FhuA XhoI rv TTTTCTCGAGtcaagagtccggagaagagccagaaacgaagcgg

aa

011_RFP NdeI fw TTTTcatatggcgagtagcgaagacgttatcaaaga

012_RFP GBP BamHI rv TTTTggatccttaagagtccggagaagagccagaaacagcaccggtgg a

023_ OmpA NdeI fw TTTTCATatgaaaaagacagctatcgcgattgcagt 024_OmpA159GBP

SmaI BamHI rv

036_GBP oligo com NdeI/BamHI

gatccttaagagtccggagaagagccagaaacca

040_ompA gbp rfp NdeI rv TTTTcatatgagagtccggagaagagccagaa 041_ompA rfp NdeI rv TTTTcatatggttgtccggacgagtgccgatg

042_ompA gbp rfp BglII fw TTTTAgatcttttaagaaggagatataatgaaaaagacagctatcgcgatt g

109_T7 oligo NdeI/XhoI tatgaccttaaccacgttaaccaactaac 110_T7 oligo NdeI/XhoI tcgagttagttggttaacgtggttaaggtca 111_S7 oligo NdeI/XhoI tatgtcgtcctttccgcagccgaactaac 112_S7 oligo NdeI/XhoI tcgagttagttcggctgcggaaaggacgaca

44

Table S 4 Strains used in this study

Strain Relevant genotype Construction and source E. coli DH5α F80 lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)

U169 endA1 recA1 hsdR17 (rk

-, mk+

) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1

Purchased from Protech Technology

YCY_201 E. coli

pbBe1k-melA and pKT-fhuA-gbp

pYCY_195 and

Rhizobium etli Wild type Purchased from BCRC

(bioresource collection and research center, Taiwan)

YCY_202 Rhizobium etli pBAD-fhuA-gbp bbr

pYCY_063 conjugated into Rhizobium etli

45

Table S 5 Plasmids used in this study

Plasmids Relevant genotype Construction and source pYCY_002 pBBRMCS plasmid with colE1,

pTrc-rfp, kan^R

pYCY_077 Broad host-range plasmid IncQ group, cm^R

pYCY_203 pYCY_002 derivative, pBbe1k-melA kan^R

PCR fragments were amplified with primers 77-1 and 78-1, pTrc-melA from as template. The PCR products were treated with NdeI and XhoI, and cloned into plasmid pYCY_002.

pYCY_063 pBBRMCS plasmid with BBR1, pBAD-fhuA-gbp, kan^R

gbp fragments were amplified with primers 35 and 36 by annealing. The gbp fragments were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_027.

pYCY_195 pYCY_077 derivative, pKT-fhuA-gbp

fhua-gbp fragments were treated with EcoRI and BamHI from pYCY_063, and cloned into plasmid pYCY_077.

Table S 6Primers used in this study

Primers Sequence

077-1_melARe NdeI fw TTTTCATatgccgtggctggtcggcaagc

078-1_melARe_XhoI rv TTTTCTCGAGttaggcggacactatggctatttctagctttgc

46

參考文獻

1. Kotrba, P.; Rulíšek, L.; Ruml, T., Bacterial Surface Display Surface display of Metal-Binding Sites. 2011, 249-283.

2. Lee, S. Y.; Choi, J. H.; Xu, Z., Microbial cell-surface display. Trends in biotechnology 2003, 21 (1), 45-52.

3. Schröfel, A.; Kratošová, G., Biosynthesis of Metallic Nanoparticles and Their Applications. 2011, 5, 373-409.

4. Reith, F.; Etschmann, B.; Grosse, C.; Moors, H.; Benotmane, M. A.;

Monsieurs, P.; Grass, G.; Doonan, C.; Vogt, S.; Lai, B.; Martinez-Criado, G.;

George, G. N.; Nies, D. H.; Mergeay, M.; Pring, A.; Southam, G.; Brugger, J., Mechanisms of gold biomineralization in the bacterium Cupriavidus metallidurans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106 (42), 17757-62.

5. Pimprikar, P. S.; Joshi, S. S.; Kumar, A. R.; Zinjarde, S. S.; Kulkarni, S. K., Influence of biomass and gold salt concentration on nanoparticle synthesis by the tropical marine yeast Yarrowia lipolytica NCIM 3589. Colloids and

5. Pimprikar, P. S.; Joshi, S. S.; Kumar, A. R.; Zinjarde, S. S.; Kulkarni, S. K., Influence of biomass and gold salt concentration on nanoparticle synthesis by the tropical marine yeast Yarrowia lipolytica NCIM 3589. Colloids and

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