第一章 緒論
1.4 研究動機與目的
1.4.1 微生物細胞表面顯示系統之開發與應用
微生物細胞表面顯示系統即是藉由載體蛋白將乘客蛋白/胜肽暴露在
細胞表面，根據菌種之不同，不同的膜外蛋白被使用。outer membrane protein (OmpA)已廣泛地被應用於細胞表面顯示系統，如胜肽庫之篩選、
胜肽之表現及疫苗發展等15。Verhoeven (2009) 等人的實驗中，由於 OmpA 錨定於細胞壁的週質區域是不想要的，於是以 OmpA 的跨膜區域代替全長 的 OmpA，根據其標記結果，未誘導的細胞，無論是攜帶 OmpA-177 FLAG (loop3) 或完整長度的 OmpA-FLAG (loop3)，兩者對於抗體接近其表面的 FLAG 抗原之水平相當16。
Figure 1- 7(A) OmpA(OmpA-177)的跨膜區域模型。螢光標記細胞表現 FLAG 於(B)OmpA-177 之 loop3，及(C) OmpA 之 loop 3。16
另 一 種 也 廣 泛 地 被 使 用 的 載 體 蛋 白 為 Neisseria gonorrhoeae 的 immunoglobulin A protease (IgA protease) ， 屬 於 一 種 自 轉 運 蛋 白 (Autotransporter protein)，其分泌機制牽涉到大量的蛋白質前驅物，包含一 N 端 信 號 肽 指 示 其 傳 輸 通 過 內 膜 (IM) 到 週 質 ， 接 著 藉 由 其 C 端 區 域 (β-domain)插入外膜(OM)並形成一個兩性的β-barrel，讓N端區域及伴隨的
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乘客蛋白通過外膜，藉由將IgA1 protease的編碼區域置換成感興趣的重組 蛋白，便可應用於E. coli中重組蛋白質的轉運並顯示於E. coli表面 17,18。
Figure 1- 8 自轉運蛋白之分泌機制。(A) polyprotein precursor 的結構，(B)重組 乘客之轉運，透過信號肽，一個前體蛋白穿過內膜運輸，到達週質，前體的 C-末端部分的折疊為孔蛋白樣的結構，即所謂的β- barrel 在外膜並將乘客傳遞到細 胞表面。(SP 為信號肽，IM 為內膜，PP 為週質，OM 為外膜) 18
FhuA 是一個 outer membrane iron transporter protein，Yeh (2013) 等人 利用 bacteriophage T5 的 phage pb5 對 FhuA 之間的相互作用，讓活體細胞 功能化，且無論是在其原生菌 E. coli 或是表現在 R. eutropha，兩者之間的 相互作用仍在，證實 FhuA-pb5 相互作用可以被沿用並功能化其他革蘭氏 陰性菌的表面19。
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Figure 1- 9 R. eutropha 表現分別只有 RFP 及融合 FhuA-RFP 的細胞，選擇 性成像螢光顯微鏡圖。(Scale bar = 1 μm) 19
本實驗目的即發展一個可以使用於不同菌種及顯示不同異源性乘客蛋
白/胜肽的細胞表面顯示平台，以利於更多之應用，藉由三個不同的外膜蛋 白，分別為來自 E. coli 的 FhuA、OmpA 以及來自 N. gonorrhoeaen 的 IgA protease 作為載體蛋白，將乘客胜肽暴露於一革蘭氏陰性菌，R. eutrpha 之 表面 (Figure 1-10)。
Figure 1- 10 R. eutropha 分別藉載體蛋白，FhuA、OmpA 及 IgA protease 顯 示乘客蛋白/胜肽於細胞表面示意圖。
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1.4.2 利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子
微生物本身就具有在細胞內或細胞外合成金屬奈米粒子的特性，在目
前研究中，許多利用重組菌株的方式以合成更多樣化的金屬奈米粒子。Apte (2013) 等人利用酵母菌 Yarrowia lipolytica 產生的黑色素合成 Au，Ag 奈米 粒子 20。在黑色素的合成路徑中，牽涉到 tyrosinase，為 copper-containing dioxygen activating enzymes，能將 phenolic 及 diphenolic compound 催化形 成 quinone，如 tyrosine、L-DOPA 等，再經過一連串非酵素反應形成黑色
素20,21。在自然界中，許多細菌都含有 tyrosinase，其中，一革蘭氏陰性菌，
Rhizobium etli，是一種根瘤菌，其特殊的固氮作用有利植物生長，故而常 與植物以共生之方式存在，其所含的 melA 基因序列被證實為 tyrosinase 的 基因序列，且被使用於重組大腸桿菌並藉由外加的 tyrosine 或 L-DOPA 產
生黑色素22,23。
本實驗將藉由帶有 melA 基因片段的重組 E. coli，表現 tyrosinase 並催 化 L-DOPA，產生出黑色素並合成多種的金屬奈米粒子 (Figure 1-11)。
Figure 1- 11 帶有 melA 基因片段的重組 E. coli，表現 tyrosinase 並催化 L-DOPA，產生出黑色素並合成多種的金屬奈米粒子示意圖。
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