微生物細胞表面顯示系統及合成多樣化金屬奈米粒子的開發與應用

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(1)國立臺灣師範大學化學系 Department of Chemistry National Taiwan Normal University. 碩士論文. 微生物細胞表面顯示系統及合成多樣化金屬奈米粒子的開發與應用 Development and Application of Cell Surface Display and Biosynthesis of Diverse Metal Nanoparticles by Microorganisms. 指導教授：葉怡均博士研究生：蔡宜蓉. 中華民國 103 年 06 月.

(2) 摘要微生物細胞表面顯示(Microbial cell-surface display)，即利用暴露在細胞表面的蛋白質作為載體蛋白 (carrier protein) ，將乘客蛋白或胜肽 (passenger protein/peptide)顯示在細胞表面的技術。因此，載體蛋白能夠有效並成功地將乘客蛋白顯示於細胞表面是極為重要的。本實驗藉由來自 Escherichia coli 的 outer membrane iron transporter protein (FhuA) 作為載體蛋白，發展一個可以使用於不同菌種及顯示不同的異源性乘客蛋白/胜肽的細胞表面顯示平台，同時比較來自 E. coli，截短的 outer membrane protein (OmpA)，以及來自 Neisseria gonorrhoeae 的 immunoglobulin A protease (IgA protease)作為載體蛋白，將乘客胜肽顯示於一革蘭氏陰性菌，Ralstonia eutrpha 之表面。透過實驗分析，三種載體蛋白無論於 E. coli 或 R. eutropha 中，皆成功易位於細胞外膜，並將不同的乘客胜肽顯示於細胞表面，而乘客胜肽之功能依舊，表示此使用 E. coli，FhuA 作為載體蛋白之策略適合顯示異源性胜肽在細胞表面的生物工程應用。在自然界中，許多微生物本身就具有在細胞內或細胞外合成金屬奈米粒子的特性。由於生物性的合成方法具有無毒並對環境友好性的特質。因此，利用微生物作為合成金屬奈米粒子反應器已廣泛的被研究，除了使用本身具有合成金屬奈米粒子特性的微生物外，也有許多利用重組菌株的方式以合成更多樣化的金屬奈米粒子。Rhizobium etli，是一種固氮菌，其所含的 melA 基因序列被證實為 tyrosinase 的基因序列，且被使用於重組 E. coli 並藉由外加的 L-DOPA 產生黑色素。本實驗藉由帶有 melA 基因片段的重組 E. coli，表現 tyrosinase 並催化 L-DOPA，產生出黑色素並合成多種的金屬奈米粒子。關鍵字: 細胞表面顯示、青枯桿菌、大腸桿菌、奈米粒子、根瘤菌、黑色素 I.

(3) Abstract Microbial cell-surface display allows the passenger protein/peptide to be displayed on the surface of microbial cells by fusing them with the carrier protein. Therefore, it’s important that carrier proteins display passenger proteins/peptides efficiently and successfully on the cell surface. In this study, a system for the display of heterologous passenger proteins/peptides on the surface of different strain was developed using the Escherichia coli outer membrane iron transporter protein (FhuA) as a carrier protein. Simultaneously, a truncated outer membrane protein A (OmpA) from E. coli and a immunoglobulin A protease (IgA protease) from Neisseria gonorrhoeaen were compared in a Gram-negative bacteria, Ralstonia eutropha. Through the experimental analysis, the three carrier proteins and different passenger peptides are located and displayed on the cell surface in both E. coli and R. eutropha. These results suggest that the strategy employing the E. coli FhuA as a carrier protein is suitable for the display of heterologous peptides on the cell surface for biotechnical applications. In nature, microorganisms are capable of reducing the metal ions to form metal nanoparticles intracellularly or extracellularly. Biosynthesis of metal nanoparticles has been studied extensively because of their unique properties such as non-toxicity and environmental friendly. The protein encoded melA by the nitrogen-fixing bacterium, Rhizobium etli, is a tyrosinase. It has been shown that recombinant E. coli produced melanin with melA gene from R. etli. In the present study, we demonstrate that the melanin biosynthesis pathway in R. etli can be exploited for the in vivo synthesis of metal nanoparticles with the inexpensive L-DOPA using recombinant E. coli. II.

(4) Key word: cell-surface display, Ralstonia eutrpha, Escherichia coli, nanoparticles, Rhizobium etli, melanin. III.

(5) 謝誌近八百天的日子，非常充實，能夠完成此論文，需感激的人很多，雖不能一一致謝，卻銘記在心。感謝指導教授葉怡均老師的細心指導及肯定，讓我出乎意料地得以完成研究，也學了許多，開了眼界。以及陳頌方老師及台灣大學黃筱鈞老師於實驗及論文口試期間的鼓勵及指教，讓我受益良多。感謝黃文彰老師、陳家俊老師及生命科學系蘇銘燦老師於實驗室創立初期的幫助，能順利開始研究生生活。感謝台灣大學積學館電子顯微鏡室的簡佳盈小姐及紀素貞小姐的幫忙，使得研究結果更加完整。感謝曾學瑋同學這些日子以來的包容及幫助，很高興能與你作為同一個實驗室的夥伴，一起得以順利完成學業。感謝學弟，歐陽淳宇、馬士元、、顏家禾、蔡東育、林于寬、莊立維；及學妹，楊子瑩、陳姵璇、黃妤君等於實驗上(室)之幫助，也因為與你們的相處，學到了許多。最後，對家人的感謝，文字敘說已無法完整詮釋，謹以此論文獻給我親愛的家人、師長及好友。. IV.

(6) 目錄摘要 ...................................................................................................................... I Abstract ............................................................................................................... II 謝誌 .................................................................................................................... IV 目錄 ..................................................................................................................... V 圖目錄................................................................................................................ VII 表目錄................................................................................................................. XI 第一章緒論 ........................................................................................................ 1. 1.1 微生物細胞表面顯示 (Microbial cell-surface display) ................... 1 1.2 生物合成法製備金屬奈米粒子 .......................................................... 3 1.3 文獻回顧 .............................................................................................. 4 1.3.1 微生物表面顯示發展與應用之相關文獻 ...................................... 4 1.3.2 生物合成金屬奈米粒子之相關文獻 ............................................. 6. 1.4 研究動機與目的 .................................................................................. 9 1.4.1 微生物細胞表面顯示系統之開發與應用 ...................................... 9 1.4.2 利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子 ........................................12 第二章研究結果與討論 .....................................................................................13. 2.1 微生物細胞表面顯示系統之發展及應用 ........................................ 13 2.1.1 細菌表面顯示系統之建立 ...........................................................13 2.1.2 分析 gold-binding peptide 顯示於 R. eutropha 表面之成效 ........16 2.1.3 利用 FhuA-passenger 系統顯示不同的胜肽 ..............................19. 2.2 利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子與應用 ................................. 20 V.

(7) 2.2.1 藉由 Rhizobium etli 生成之黑色素合成 Au 奈米粒子 ................20 2.2.2 利用重組大腸桿菌合成不同的金屬奈米粒子 .............................21 2.2.3 調控金屬奈米粒子之大小 ...........................................................26 2.2.4 金屬奈米粒子之應用 ..................................................................27 2.2.5 顯示重組 E. coli 合成之 Au 奈米粒子於細胞表面 ......................28 第三章結論 .......................................................................................................30 實驗方法與材料 ..................................................................................................31. 微生物表面顯示系統之發展與應用 ....................................................... 31 利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子與應用 ....................................... 33 參考文獻 .............................................................................................................46. VI.

(8) 圖目錄 Figure 1- 1 微生物細胞表面顯示之示意圖(A)及應用(B)2。 ......................... 2 Figure 1- 2 (A) 藉 Neisseria gonorrhoeae IgA 表現 metallothionein I (MT) 蛋白質之示意圖 8。(B)表現 MT 的 R. eutropha MTB 及 R. eutropha CH34 wild type, 分別在含有不同濃度 Cd2+ 的培養基中，累積 Cd2+的能力 8。 ....................................................................................................... 4 Figure 1- 3 (i) gold(I)-specific protein GolB 經由外膜蛋白 OmpA 顯示在 E.coli 細胞表面之示意圖 9。(ii) 箭頭處為 Au 粒子沉積在 GolB 顯示於大腸桿菌表面之 TEM 圖 9。iii) GolB 未顯示在誘導後的大腸桿菌表面之 TEM 圖 9。(ii & iii 皆培養於含有 50mM HAuCl4 (Au3+)的培養基中) ..................................................................................................................... 5 Figure 1- 4 (A)BclA 在細菌表面示意圖，NTD 為 BclA 的 N 端區域，CLR 為 GXX 三重複 collagen-like 區域，CTD 為 BclA 的 C 端區域 11。(B) 表面錨定載體(pTJ1-BAN, pTJ1-BANC 及 pTJ1-BAF)、BclA 蛋白質的結構域 (NTD, 灰色部分; CLR, 黑色部分, CTD, 斜線部分) 及目標蛋白質(白色部分). (Ptac; tac promoter, POI; protein of interes) 11。 (C)免疫螢光共軛焦顯微鏡圖像，E. coli 藉 BAN 平台表現 XynA 蛋白質 11。 (D) 免疫螢光共軛焦顯微鏡圖像，E. coli 藉 BAN 平台表現 BM3 蛋白質。細胞染色藉由 FITC conjugated anti-FLAG-antibody11.。(scale bar = 3 μm) ..................................................................................................................... 6 Figure 1- 5 多種的半導體金屬奈米粒子 a) CdZn, b) CdSe, c) CdTe 及 d) SeZn 藉由表現 AtPCS 的重組 E.coli 合成；e) CdZn, f) CdSe, g) CdTe VII.

(9) 及 h) SeZn 藉由表現 PpMT 的重組 E.coli 合成；i) CdZn, j) CdSe, k) CdTe 及 l) SeZn 藉由 AtPCS 及 PpMT 兩者都表現的重組 E.coli 合成。每個 HRTEM 圖像上顯示的距離是奈米粒子晶格的面間距 13。.......... 7 Figure 1- 6 (A)重組 E. coli 藉由 cofactor regeneration 系統合成 Au 奈米粒子； (B)TEM 分析(a)合成金奈米粒子的重組 E. coli 及(b)、(c)其合成的 Au 奈米粒子 14。 .............................................................................................. 8 Figure 1- 7 (A) OmpA(OmpA-177)的跨膜區域模型。螢光標記細胞表現 FLAG 於(B)OmpA-177 之 loop3，及(C) OmpA 之 loop 3。16 .............. 9 Figure 1- 8 自轉運蛋白之分泌機制。(A) polyprotein precursor 的結構，(B) 重組乘客之轉運，透過信號肽，一個前體蛋白穿過內膜運輸，到達週質，前體的 C-末端部分的折疊為孔蛋白樣的結構，即所謂的 β- barrel 在外膜並將乘客傳遞到細胞表面。(SP 為信號肽，IM 為內膜，PP 為週質，OM 為外膜) 18 ................................................................................... 10 Figure 1- 9 R. eutropha 表現分別只有 RFP 及融合 FhuA-RFP 的細胞，選擇性成像螢光顯微鏡圖。(Scale bar = 1 μm) 19 .......................................... 11 Figure 1- 10 R. eutropha 分別藉載體蛋白，FhuA、OmpA 及 IgA protease 顯示乘客蛋白/胜肽於細胞表面示意圖。 .................................................. 11 Figure 1- 11 帶有 melA 基因片段的重組 E. coli，表現 tyrosinase 並催化 L-DOPA，產生出黑色素並合成多種的金屬奈米粒子示意圖。 ......... 12 Figure 2- 1 (A) RFP，(B) FhuA-RFP，(C) OmpA-RFP 及(D) RFP-IgA protease 之質體結構。…………………………………………………………………………………………13 Figure 2- 2 R. eutropha 表現分別只有 RFP， FhuA-RFP ， OmpA-RFP 及 VIII.

(10) RFP-IgA protease 之螢光顯微鏡圖像。(Scale bar = 2 μm ) .................. 14 Figure 2- 3 (A) RFP-GBP，(B) FhuA-RFP-GBP 及(C) OmpA-RFP-GBPprotease，之質體結構。 ............................................. 15 Figure 2- 4 R. eutropha 表現分別只有 RFP-GBP， FhuA-RFP-GBP ， OmpA-RFP-GBP 之螢光顯微鏡圖像。(Scale bar = 2 μm ) ................... 15 Figure 2- 5 有無 GBP 顯示之重組 R. eutropha 表面結合金奈米粒子(H)之 TEM 圖像，(A) FhuA，(B) FhuA-GBP，(C) RFP-IgA protease，(D) GBP-IgA protease，(E) OmpA-RFP，(F) OmpA-GBP。(Scale bar = 200nm) ................................................................................................................... 18 Figure 2- 6 R. eutropha 藉載體蛋白，FhuA，顯示 Pt-{100} binding peptide (T7) 及 Pt-{111} binding peptide (S7)於細胞表面示意圖。 .......................... 19 Figure 2- 7 重組 R. eutropha 合成 Pt 奈米粒子之 TEM 圖像，(A) FhuA，(B) FhuA-S7 (PBS wash) 及(C) FhuA-T7 上清液。(Scale bar = 0.5 μm) .. 20 Figure 2- 8 R. etli 與 1 mM L-DOPA 在 TY 培養液中(28°C, 200rpm)培養 12 小時後並將菌分離後，上清液加入 1mM Au3+離子溶液後，(A)顏色變化及(B) Au 奈米粒子的生成。(scale bar = 20 nm)；(C) R. etli 與 1 mM L-DOPA 在 28°C, 200rpm 轉速下培養 12 小時加入 Au3+離子溶液之狀況。(scale bar = 200 nm) ............................................................. 21 Figure 2- 9 重組 E. coli 與 100nM IPTG 及 1 mM L-DOPA 在 M9 培養液中(37°C, 250rpm)培養約 12hr，直到產生依不同濃度的黑色素標準品與吸收波長 280nm 之關係(Figure S1)所得約 50.17  3.40 μg/mL 的黑色素後，將菌分離，上清液加入 2 mM 離子溶液合成的 (A) Au，(B) Cu， IX.

(11) (C) Mn，(D) Pt，(E) Ni ，及 Ag、Cu 比例(F) 1:1 mM 所合成的 AgCu 奈米粒子。 (scale bar = 20 nm) .............................................................. 25 Figure 2- 10 不同濃度及奈米粒子處理過的細胞之生長 (由上至下，細胞 10 倍連續稀釋)，定量細胞在不同濃度及奈米粒子存在下之存活率。 ................................................................................................................... 27 Figure 2- 11 (A) FhuA-GBP R. etli 於 TY 培養基中與 1 mM L-DOPA 及 0.2% arabinose 在 28°C, 200rpm 轉速下培養 12 小時及(B) R. etli wild type 於同樣條件，但未加入 0.2% arabinose 之下，加入 1mM Au3+ 並培養 2-3 小時；(C) pbBe1k-melA & FhuA-GBP E. coli 於培養基中與 1 mM L-DOPA、100nM IPTG 及 0.2% arabinose 在 37°C, 250rpm 轉速下培養小時，(D) pbBe1k-melA & FhuA-GBP E. coli 於同樣條件，但未加入 0.2% arabinose 之下，加入 1mM Au3+ 並培養 2-3 小時之 TEM 圖像。(scale bar 200 nm) ....................................................................... 29 Figure S 1 1mg 之黑色素溶解於以 1M NaOH 調整至 pH=12 的 M9 培養基中，再分別稀釋為 2、20、35、50、70、100 ug/mL，以吸收波長 280nm 測得之吸收值並做線性回歸。………………………………………………………………36 Figure S 2 Cloning project flowchart. .............................................................. 37. X.

(12) 表目錄 Table 2- 1 Au 奈米粒子結合於細胞表面效率之定量。 ............................... 18 Table 2- 2 重組 E. coli 合成的(A)Au，(B) Cu，(C) Mn，(D)Pt，(E) Ni，及 Ag、 Cu 比例(F)1:1 mM 所合成的 AgCu 奈米粒子(Figure 2-7)的平均直徑。 ................................................................................................................... 25 Table 2- 3 重組 E. coli 分別加入(A) 0.5 、1 、2 mM 離子溶液合成的 Au3+ 所合成的奈米粒子平均直徑，(B) 將所得約 50.17  3.40 μg/mL 的黑色素稀釋為約 10、25 μg/mL 並加入 2 mM Au3+ 離子溶液所得的奈米粒子平均直徑。 ......................................................................................... 26 Table S 1 Bacterial strains used in this study…………………………………37 Table S 2 Plasmids used in this study............................................................... 40 Table S 3 Primers used in this study................................................................. 43 Table S 4 Strains used in this study .................................................................. 44 Table S 5 Plasmids used in this study............................................................... 45 Table S 6 Primers used in this study................................................................. 45. XI.

(13) 第一章緒論 1.1 微生物細胞表面顯示 (Microbial cell-surface display) 自然界中，大多數的微生物會產生特定的蛋白質並暴露在細胞表面，這些蛋白質可能會位於質膜或細胞壁上並提供多種功能，可能是結構組件、傳輸及信號接收等 1。微生物細胞表面顯示即是利用暴露在細胞表面的蛋白質作為載體蛋白 (carrier protein) ，將乘客蛋白或胜肽 (passenger protein/peptide)顯示在細胞表面的技術。(Figure 1-1 A) 不同的載體蛋白對宿主菌株會有不同的生理影響，因此，一個成功的載體蛋白，應具有一有效的訊號肽或傳輸訊號，讓先形成的乘客蛋白/胜肽先通過內膜，並且要具有很強的錨定結構(anchoring motif)，使乘客蛋白/ 胜肽及其本身不容易脫離細胞表面，而本身與被插入或融合的外源序列應具相容性，並要能夠抵抗在週質或培養基中蛋白酶的攻擊。不同的宿主菌株，有其適用的載體蛋白，如以細菌來說，革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌之細胞膜結構不同，所以各自適合的載體蛋白種類亦不同 2。微生物細胞表面顯示技術應用範圍廣泛，包含疫苗的開發、生物吸附、抗體之生產、胜肽庫之篩選、全細胞催化劑及生物感測器等(Figure 1-1 B)，因此，依不同之應用可以選擇適合的乘客蛋白/胜肽，但是，乘客蛋白/胜肽的特性、摺疊結構或胺基酸序列帶有許多電荷或疏水性殘基也可能影響易位過程及最後的表面顯示結果 2，所以在選擇乘客蛋白/胜肽之性質也須列入考慮。. 1.

(14) Figure 1- 1 微生物細胞表面顯示之示意圖(A)及應用(B)2。. 2.

(15) 1.2 生物合成法製備金屬奈米粒子奈米材料的廣泛定義為，材料的三個維度中，其中一維度屬於奈米尺度(1-100nm)，即稱之為奈米材料。當材料的尺寸所小至奈米等級時，會造成小尺寸效應，表面效應及量子穿隧效應，使材料的光、磁等物理性質有所改變，應用更為廣泛。奈米材料的製成方法可以分為物理性、化學性及生物性方法。物理性方法製成的奈米顆粒尺寸分布較小，但是設備費用高且能源消耗大，生產速率也較慢；而化學性方法，雖然成本較低且操作簡單，但是化學品的毒性會對人體造成危害，且在反應過程中也可能產生具危險性的副產物 3。生物性方法具有無毒並對環境友好性的特質，而在自然界中，許多微生物本身就具有在細胞內或細胞外合成金屬奈米粒子的特性，目前，許多微生物如細菌、酵母菌或真菌等，已被發現具有合成金屬奈米粒子之能力，例如：Cupriavidus metallidurans. 為土壤菌，能夠將 Au3+ 離子還原成 Au 奈. 米粒子 4；而酵母菌 Yarrowia lipolytica NCIM3589 能夠合成 Au 奈米粒子外，也發現其細胞數目和 Au3+離子濃度的不同，對 Au 奈米粒子的尺寸會造成影響 5；在金塊材表面被發現的 Delftia acidovorans，其能夠產生一個二次代謝物，透過此二次代謝物產生固態金以保護自己 6 及一種新的海洋菌株，Stenotrophomonas 被發現其細胞外分泌物能夠合成 Au、Ag 奈米粒子 7 等。. 3.

(16) 1.3 文獻回顧 1.3.1 微生物表面顯示發展與應用之相關文獻微生物細胞表面顯示技術應用範圍廣泛，Valls (2000)等人將 mouse metallothionein I (MT) 蛋白質基因片段融合在 Neisseria gonorrhoeae IgA protease 的 beta-domain，成功顯示在耐重金屬菌，Ralstonia eutropha CH34 strain 的表面，並能夠增強固定化 Cd2+ (Figure 1-2) 8 。. Figure 1- 2 (A)藉 Neisseria gonorrhoeae IgA 表現 metallothionein I (MT) 蛋白質之示意圖 8。(B)表現 MT 的 R. eutropha MTB 及 R. eutropha CH34 wild type, 分別在含有不同濃度 Cd2+ 的培養基中，累積 Cd2+的能力 8。. Wei Wei (2012) 等人將來自 Samonella typhimurium 的 gol regulon 中的 gold-specific sensory protein, GolS 編入 E. coli 中，並在其下游加上紅色螢光蛋白，使重組的 E. coli 對 Au3+離子具有高靈敏性及選擇性的偵測外，接著利用 Lpp-OmpA 將在 gol regulon 中，對於 Au+離子具有專一性的 putative gold-chaperone, GolB 顯示在細胞表面(Figure 1-3(i))，表現 GolB 的 E. coli 可以有效在含有不同金屬離子的培養基中，選擇性的吸附 Au3+離子((Figure 1-3(ii)、(iii))，並且利用一個 cysteine-specific 蛋白酶, papain, 即可以將 E. coli 表面吸附的金粒子回收，且 E. coli 可以再繼續使用 9。. 4.

(17) Figure 1- 3 (i) gold(I)-specific protein GolB 經由外膜蛋白 OmpA 顯示在 E.coli 細胞表面之示意圖 9。(ii) 箭頭處為 Au 粒子沉積在 GolB 顯示於大腸桿菌表面之 TEM 圖 9。iii) GolB 未顯示在誘導後的大腸桿菌表面之 TEM 圖 9。(ii & iii 皆培養於含有 50mM HAuCl4 (Au3+)的培養基中). Soma (2012) 等人，將來自 Thermobifida fusca YX (Tfu0937) 的 BGL 蛋白融合到錨定蛋白 BLC (Tfu0937/Blc)的不同融合位點，並調查纖維二糖的消耗；將異丙醇合成途徑引入 E. coli，調查這些菌株並比較異丙醇生產過程中，葡萄糖的含量，基於試驗結果，TA212/pTA411 菌株被選定為能從纖維二糖直接生產異丙醇，其發酵 21 小時能夠生產 69.0 ± 11.6 mM 的異丙醇 10。. Park (2013) 等人發展一個以 Bacillus anthracis 的 exosporal 蛋白質， BclA，作為錨定區域的細胞表面顯示平台，將兩個不同大小的蛋白質，分別是來自 Bacillus sp. 的 endoxylanase (XynA, 21.2 kDa) 及 monooxygenase (P450 BM3m2, 120 kDa) 融合在 BclA 的 C 端區域，實驗結果顯示，其中 BAN 平台能夠成功將上述兩個不同大小的蛋白質分泌並顯示於 E. coli 的表面，且蛋白質仍具有高效率及穩定性 11。. 5.

(18) Figure 1- 4 (A)BclA 在細菌表面示意圖，NTD 為 BclA 的 N 端區域，CLR 為 GXX 三重複 collagen-like 區域，CTD 為 BclA 的 C 端區域 11。(B)表面錨定載體(pTJ1-BAN, pTJ1-BANC 及 pTJ1-BAF)、BclA 蛋白質的結構域 (NTD, 灰色部分; CLR, 黑色部分, CTD, 斜線部分) 及目標蛋白質(白色部分). (Ptac; tac promoter, POI; protein of interes) 11。 (C)免疫螢光共軛焦顯微鏡圖像，E. coli 藉 BAN 平台表現 XynA 蛋白質 11。 (D) 免疫螢光共軛焦顯微鏡圖像，E. coli 藉 BAN 平台表現 BM3 蛋白質。細胞染色藉由 FITC conjugated anti-FLAG-antibody11.。(scale bar = 3 μm). 1.3.2 生物合成金屬奈米粒子之相關文獻利用微生物作為合成金屬奈米粒子反應器已廣泛的被研究，除了使用本身具有合成金屬奈米粒子特性的微生物外，也有許多利用重組菌株的方式，讓微生物合成出最佳化及理想化的金屬奈米粒子。. 自然界中有許多蛋白質或胜肽被發現能夠結合重金屬，如 oligoglutathione peptide Phytochelatin (PC)，已被應用於移除重金屬，而不同尺寸的 PC 能夠藉由 phytochelatin synthase (PCS)合成，且其與銅、銀、鉛及汞等重金屬能夠形成金屬錯合物。Chen (2008) 等人利用 E. coli 表現 6.

(19) Schizosaccharomyces pombe 的 PCS 產生 PCs，並透過控制 PCs 的 population， E. coli 能夠產生尺寸均勻的 CdS 奈米晶 12,13。. 除了 PC 外，Metallothionein (MT)也是能夠直接結合銅、鎘及鋅的蛋白質。Park (2010) 等人利用重組 E. coli 表現 Arabidopsis thaliana 的 PCS (AtPCS)及/或 Pseudomonas putida MT (PpMT)，並合成出多種的金屬奈米粒子，如半導體金屬奈米粒子(Cd、Se、Zn、Te)；磁性金屬奈米粒子(Fe、 Co、Ni、Mn)以及貴重金屬奈米粒子(Au、Ag)等，並發現金屬離子的濃度可以控制金屬奈米粒子的尺寸，合成出的奈米粒子仍具有其特性，如磁性金屬奈米粒子仍具有磁性 13。. Figure 1- 5 多種的半導體金屬奈米粒子 a) CdZn, b) CdSe, c) CdTe 及 d) SeZn 藉由表現 AtPCS 的重組 E.coli 合成；e) CdZn, f) CdSe, g) CdTe 及 h) SeZn 藉由表現 PpMT 的重組 E.coli 合成；i) CdZn, j) CdSe, k) CdTe 及 l) SeZn 藉由 AtPCS 及 PpMT 兩者都表現的重組 E.coli 合成。每個 HRTEM 圖像上顯示的距離是奈米粒子晶格的面間距 13。. 7.

(20) Kamiya (2011) 等人藉由 E. coli 表現 GLD-mediated cofactor regeneration 系統，此系統藉由外加丙三醇讓 E. coli 產生 electron-donating cofactor，nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)，將 Au3+ 離子還原成尺寸範圍在 7.2-29 nm，平均直徑在 19.5 ± 5.8 nm (n=100) 的 Au 奈米粒子，使 E. coli 做為一個能在細胞內合成 Au 奈米粒子的反應器 (Figure 1-6)14。. Figure 1- 6 (A)重組 E. coli 藉由 cofactor regeneration 系統合成 Au 奈米粒子； (B)TEM 分析(a)合成金奈米粒子的重組 E. coli 及(b)、(c)其合成的 Au 奈米粒子 14。. 8.

(21) 1.4 研究動機與目的 1.4.1 微生物細胞表面顯示系統之開發與應用微生物細胞表面顯示系統即是藉由載體蛋白將乘客蛋白/胜肽暴露在細胞表面，根據菌種之不同，不同的膜外蛋白被使用。outer membrane protein (OmpA)已廣泛地被應用於細胞表面顯示系統，如胜肽庫之篩選、胜肽之表現及疫苗發展等 15。Verhoeven (2009) 等人的實驗中，由於 OmpA 錨定於細胞壁的週質區域是不想要的，於是以 OmpA 的跨膜區域代替全長的 OmpA，根據其標記結果，未誘導的細胞，無論是攜帶 OmpA-177 FLAG (loop3) 或完整長度的 OmpA-FLAG (loop3)，兩者對於抗體接近其表面的 FLAG 抗原之水平相當 16。. Figure 1- 7 (A) OmpA(OmpA-177)的跨膜區域模型。螢光標記細胞表現 FLAG 於(B)OmpA-177 之 loop3，及(C) OmpA 之 loop 3。16 另一種也廣泛地被使用的載體蛋白為 Neisseria gonorrhoeae 的 immunoglobulin A protease (IgA protease) ，屬於一種自轉運蛋白 (Autotransporter protein)，其分泌機制牽涉到大量的蛋白質前驅物，包含一 N 端信號肽指示其傳輸通過內膜 (IM) 到週質，接著藉由其 C 端區域 (β-domain)插入外膜(OM)並形成一個兩性的β-barrel，讓N端區域及伴隨的 9.

(22) 乘客蛋白通過外膜，藉由將IgA1 protease的編碼區域置換成感興趣的重組蛋白，便可應用於E. coli中重組蛋白質的轉運並顯示於E. coli表面. 17,18. 。. Figure 1- 8 自轉運蛋白之分泌機制。(A) polyprotein precursor 的結構，(B)重組乘客之轉運，透過信號肽，一個前體蛋白穿過內膜運輸，到達週質，前體的 C末端部分的折疊為孔蛋白樣的結構，即所謂的 β- barrel 在外膜並將乘客傳遞到細胞表面。(SP 為信號肽，IM 為內膜，PP 為週質，OM 為外膜) 18. FhuA 是一個 outer membrane iron transporter protein，Yeh (2013) 等人利用 bacteriophage T5 的 phage pb5 對 FhuA 之間的相互作用，讓活體細胞功能化，且無論是在其原生菌 E. coli 或是表現在 R. eutropha，兩者之間的相互作用仍在，證實 FhuA-pb5 相互作用可以被沿用並功能化其他革蘭氏陰性菌的表面 19。. 10.

(23) Figure 1- 9 R. eutropha 表現分別只有 RFP 及融合 FhuA-RFP 的細胞，選擇性成像螢光顯微鏡圖。(Scale bar = 1 μm) 19 本實驗目的即發展一個可以使用於不同菌種及顯示不同異源性乘客蛋白/胜肽的細胞表面顯示平台，以利於更多之應用，藉由三個不同的外膜蛋白，分別為來自 E. coli 的 FhuA、OmpA 以及來自 N. gonorrhoeaen 的 IgA protease 作為載體蛋白，將乘客胜肽暴露於一革蘭氏陰性菌，R. eutrpha 之表面 (Figure 1-10)。. Figure 1- 10 R. eutropha 分別藉載體蛋白，FhuA、OmpA 及 IgA protease 顯示乘客蛋白/胜肽於細胞表面示意圖。. 11.

(24) 1.4.2 利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子微生物本身就具有在細胞內或細胞外合成金屬奈米粒子的特性，在目前研究中，許多利用重組菌株的方式以合成更多樣化的金屬奈米粒子。Apte (2013) 等人利用酵母菌 Yarrowia lipolytica 產生的黑色素合成 Au，Ag 奈米粒子 20。在黑色素的合成路徑中，牽涉到 tyrosinase，為 copper-containing dioxygen activating enzymes，能將 phenolic 及 diphenolic compound 催化形成 quinone，如 tyrosine、L-DOPA 等，再經過一連串非酵素反應形成黑色素 20,21。在自然界中，許多細菌都含有 tyrosinase，其中，一革蘭氏陰性菌， Rhizobium etli，是一種根瘤菌，其特殊的固氮作用有利植物生長，故而常與植物以共生之方式存在，其所含的 melA 基因序列被證實為 tyrosinase 的基因序列，且被使用於重組大腸桿菌並藉由外加的 tyrosine 或 L-DOPA 產生黑色素 22,23。本實驗將藉由帶有 melA 基因片段的重組 E. coli，表現 tyrosinase 並催化 L-DOPA，產生出黑色素並合成多種的金屬奈米粒子 (Figure 1-11)。. Figure 1- 11 帶有 melA 基因片段的重組 E. coli，表現 tyrosinase 並催化 L-DOPA，產生出黑色素並合成多種的金屬奈米粒子示意圖。 12.

(25) 第二章研究結果與討論 2.1 微生物細胞表面顯示系統之發展及應用 2.1.1 細菌表面顯示系統之建立藉由紅色螢光蛋白(RFP)的位置判斷載體蛋白的位置，其中，FhuA 及 OmpA 皆為 C 端區域裸露於細胞表面，故將 RFP 融合於兩蛋白質之 C 端區域，而 IgA protease 根據其分泌機制，其裸露於細胞表面為 N 端區域，且要依信號肽之指示才能啟動整體機制，因此將 RFP 需融合於其信號序列下游，IgA protease 序列之上游(Figure 2-1)。從螢光顯微鏡實驗結果可以看出，RFP 訊號在 FhuA-RFP、RFP-IgA protease 及 OmpA-RFP 菌株外圍形成光圈，而 RFP 菌株的紅色螢光訊號則充斥著整個細胞，證實 FhuA、OmpA 及 IgA protease 皆成功易位在 R. eutropha 外膜。(Figure 2-2). Figure 2- 1 (A) RFP，(B) FhuA-RFP，(C) OmpA-RFP 及(D) RFP-IgA protease 之質體結構。. 13.

(26) Figure 2- 2 R. eutropha 表現分別只有 RFP， FhuA-RFP ， OmpA-RFP 及 RFP-IgA protease 之螢光顯微鏡圖像。(Scale bar = 2 μm ). FhuA、OmpA 及 IgA protease 成功易位在 R. eutropha 之外膜，並成功顯示紅色螢光蛋白後，嘗試顯示一短的胜肽，gold-binding peptide (GBP)，由八個胺基酸組成，其被證實能夠與 Au 奈米粒子結合 24。在此部分將 GBP 融合在螢光蛋白之下游(Figure 2-3)，以判斷其是否影響載體蛋白之易位。從螢光顯微鏡實驗結果得知，其並不影響載體蛋白在 R. eutropha 之易位 (Figure 2-4)。. 14.

(27) Figure 2- 3 (A) RFP-GBP，(B) FhuA-RFP-GBP 及(C) OmpA-RFP-GBP，之質體結構。. Figure 2- 4 R. eutropha 表現分別只有 RFP-GBP， FhuA-RFP-GBP ， OmpA-RFP-GBP 之螢光顯微鏡圖像。(Scale bar = 2 μm ). 15.

(28) 2.1.2 分析 gold-binding peptide 顯示於 R. eutropha 表面之成效重組 R. eutropha 顯示 GBP 於表面之系統分別為 FhuA-GBP ， OmpA-GBP 及 GBP-IgA protease，加入誘導劑促使重組 R. eutropha 先生成 GBP 並顯示於細胞表面，再加入約 11.54 nM，直徑 13.3nm 的 Au 奈米粒子一起培育，從結果可以得知，各系統之重組 R. eutropha 皆生成並成功顯示 GBP 於細胞表面，且 GBP 仍具有其結合 Au 奈米粒子特性(Figure 2-3)。而各系統將 GBP 顯示於細胞表面並結合 Au 奈米粒子之效率可藉由 Table 2-1 得知，FhuA-GBP 之效率比 GBP-IgA protease 及 OmpA-GBP 高。. 16.

(29) 17.

(30) Figure 2- 5 有無 GBP 顯示之重組 R. eutropha 表面結合金奈米粒子(H)之 TEM 圖像，(A) FhuA，(B) FhuA-GBP，(C) RFP-IgA protease，(D) GBP-IgA protease，(E) OmpA-RFP，(F) OmpA-GBP。(Scale bar = 200nm). Table 2- 1 Au 奈米粒子結合於細胞表面效率之定量。. 18.

(31) 2.1.3 利用 FhuA-passenger 系統顯示不同的胜肽一些能夠結合具有特定面向金屬奈米粒子的胜肽已經被發表，Chiu (2011)等人在室溫下利用兩種facet-specific胜肽作為capping agent，分別為 Pt-{100} binding peptide (T7)，能夠識別面{100}的Pt nanocrystal，而Pt-{111} binding peptide (S7)則能夠識別面{111}的Pt nanocrystal。該文獻利用此兩種胜肽分別合成出由6個{100}面組成的立方體Pt nanocrystal，及由4個{111} 面組成的四面體Pt nanocrystal 25。在此，將使用此兩種胜肽作為乘客胜肽，讓細胞能夠合成Pt nanocrystal (Figure 2-4)。. Figure 2- 6 R. eutropha 藉載體蛋白，FhuA，顯示 Pt-{100} binding peptide (T7) 及 Pt-{111} binding peptide (S7)於細胞表面示意圖。. 19.

(32) 重組 R. eutropha 顯示兩胜肽於表面之系統分別為 FhuA-S7 及 FhuA-T7，加入誘導劑促使重組 R. eutropha 生成兩胜肽並同時加入 1mM Pt4+ 離子溶液一起培育，將細胞以 PBS buffer 清洗三次後，發現 FhuA-S7 及 FhuA-T7 皆能夠合成 Pt 奈米粒子，而 FhuA 未顯示任何胜肽之細胞則不能(Figure 2-5A)；且 FhuA-S7 合成之 Pt 奈米粒子能顯示在細胞表面，且合成之 Pt 奈米粒子皆呈現球形居多(Figure 2-5B)，而 FhuA-T7 合成之 Pt 奈米粒子沒有顯示於細胞表面，且合成之 Pt 奈米粒子形狀則較不規則 (Figure 2-5C)。. Figure 2- 7 重組 R. eutropha 合成 Pt 奈米粒子之 TEM 圖像，(A) FhuA，(B) FhuA-S7 (PBS wash) 及(C) FhuA-T7 上清液。(Scale bar = 0.5 μm). 2.2 利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子與應用 2.2.1 藉由 Rhizobium etli 生成之黑色素合成 Au 奈米粒子在此，藉由添加 L-DOPA 讓 R. etli 生成黑色素，並加入 Au3+離子溶液，雖發現溶液整體迅速從黑褐色轉變為深紅棕色，由於溶液顏色過深，判斷不易，因此後續合成皆將先一步把細菌離心去除。從 Figure 2-6A 可以看出，在培養 R. etli 的 TY 培養基中，未添加 L-DOPA 的培養基仍呈現透明淡黃色，而添加 L-DOPA 一起培養的培養基則因有黑色素的生成而呈現淡褐色，將兩者都加入 Au3+離子溶液後，可以發現未添加 L-DOPA 的培養基仍呈現透明黃色，但添加 L-DOPA 一起培養 20.

(33) 的培養基在加入 Au3+離子溶液後，顏色迅速轉變為紅棕色，並利用穿透式顯微鏡(TEM)可以觀察到平均直徑為 11.69  5.79 nm (n=50)的金奈米粒子 (Figure 2-6B)。而從 Figure 2-6C 可以看出，R. etli 確實藉由 L-DOPA 生成黑色素並合成 Au 奈米粒子。. Figure 2- 8 R. etli 與 1 mM L-DOPA 在 TY 培養液中(28°C, 200rpm)培養 12 小時後並將菌分離後，上清液加入 1mM Au3+離子溶液後，(A)顏色變化及(B) Au 奈米粒子的生成。(scale bar = 20 nm)；(C) R. etli 與 1 mM L-DOPA 在 28°C, 200rpm 轉速下培養 12 小時加入 Au3+離子溶液之狀況。 (scale bar = 200 nm). 2.2.2 利用重組大腸桿菌合成不同的金屬奈米粒子 melA 基因片段已被使用於 E. coli 並能成功生產出黑色素，在此，將帶有 melA 基因片段的 E. coli 與 100nM IPTG 和 1mM L-DOPA 一起培養後，於 LB 培養基培養之菌液會整體轉變為黑褐色，若是於 M9 培養基培養之菌液則轉變為褐色，為能定量 E. coli 所產生的黑色素濃度，利用黑色素標 21.

(34) 準品配置不同濃度並利用其在波長 280nm 之強度變化，發現黑色素濃度與波長 280nm 時的吸收值成正比並具有良好的線性關係，得公式為 y=0.0066 ･x + 0.0383 (Figure S1)，後續重組 E. coli 生產之黑色素濃度皆依此公式取得。由於為方便在合成金屬奈米粒子時，溶液顏色之判斷，故而使用 M9 培養基培養重組 E. coli 生成黑色素，發現在添加 100 nM IPTG 和 1 mM L-DOPA 一起培養 12 小時後，可以生成約 50.17  3.40 μg/mL 的黑色素，並以該濃度之黑色素合成金屬奈米粒子(Figure 2-7)，經過計算，各種金屬奈米粒子之平均直徑在十幾個奈米之間(Table 2-2)。. 22.

(35) 23.

(36) 24.

(37) Figure 2- 9 重組 E. coli 與 100nM IPTG 及 1 mM L-DOPA 在 M9 培養液中(37°C, 250rpm)培養約 12hr，直到產生依不同濃度的黑色素標準品與吸收波長 280nm 之關係(Figure S1)所得約 50.17  3.40 μg/mL 的黑色素後，將菌分離，上清液加入 2 mM 離子溶液合成的 (A) Au，(B) Cu，(C) Mn，(D) Pt，(E) Ni ，及 Ag、Cu 比例(F) 1:1 mM 所合成的 AgCu 奈米粒子。 (scale bar = 20 nm) Table 2- 2 重組 E. coli 合成的(A)Au，(B) Cu，(C) Mn，(D)Pt，(E) Ni，及 Ag、 Cu 比例(F)1:1 mM 所合成的 AgCu 奈米粒子(Figure 2-7)的平均直徑。. 25.

(38) 2.2.3 調控金屬奈米粒子之大小重組 E. coli 雖成功藉由添加的 L-DOPA 生成黑色素並合成不同的金屬奈米粒子，但各金屬奈米粒子的尺寸之分布並不是那麼一致，所以在此部分將嘗試調整不同金屬離子溶液及不同的黑色素溶液合成金屬奈米粒子。以合成 Au 奈米粒子為例，發現 Au3+ 離子溶液的濃度越低，合成出的 Au 奈米粒子平均直徑也越小，而黑色素的濃度越低時，也是如此(Table 2-3)。. Table 2- 3 重組 E. coli 分別加入(A) 0.5、1、2 mM 離子溶液合成的 Au3+ 所合成的奈米粒子平均直徑，(B) 將所得約 50.17  3.40 μg/mL 的黑色素稀釋為約 10、25μg/mL 並加入 2 mM Au3+ 離子溶液所得的奈米粒子平均直徑。. 26.

(39) 2.2.4 金屬奈米粒子之應用 Taner (2011) 等人成功利用一強還原劑，hydrazine hydrate，一錯合劑以及一穩定劑，成功的同時還原銀和銅的鹽類並合成出 AgCu 合金奈米粒子。將合成的 AgCu 合金奈米粒子與 Ag 奈米粒子進行抗菌測試，觀察到在含有 AgCu 合金奈米粒子的培養基中，菌落數量遠比含有等量 Ag 奈米粒子的培養基的菌落數量少，表示 AgCu 合金奈米粒子與等量的 Ag 奈米粒子相比下，具有好的抗菌活性 26。本實驗中，重組大腸桿菌藉由 L-DOPA 生成黑色素並合成 Ag 奈米粒子及 AgCu 合金奈米粒子，合成 AgCu 合金奈米粒子使用銀、銅離子溶液濃度與 Taner (2011) 等人使用濃度同為 1:1，發現 AgCu 合金奈米粒子抗菌能力較等量之 Ag 奈米粒子好。. Figure 2- 10 不同濃度及奈米粒子處理過的細胞之生長 (由上至下，細胞 10 倍連續稀釋)，定量細胞在不同濃度及奈米粒子存在下之存活率。 27.

(40) 2.2.5 顯示重組 E. coli 合成之 Au 奈米粒子於細胞表面試著讓重組的 E. coli 除了能夠合成 Au 奈米粒子外，也能將自身合成的 Au 奈米粒子回收並顯示於細胞表面，重組 E. coli 利用 FhuA 做載體蛋白並將 gold-binding peptide (GBP) 顯示於表面，並將自己合成的 Au 奈米粒子回收結合於自己的表面上，將 FhuA-GBP 同樣引入 R. etli 中，同樣能將本生合成 Au 奈米粒子結合於自己的表面上，再次確認以 FhuA 作為載體蛋白顯示異源性胜肽能夠使用於不同菌株 (Figure 2-9)。. 28.

(41) Figure 2- 11 (A) FhuA-GBP R. etli 於 TY 培養基中與 1 mM L-DOPA 及 0.2% arabinose 在 28°C, 200rpm 轉速下培養 12 小時及(B) R. etli wild type 於同樣條件，但未加入 0.2% arabinose 之下，加入 1mM Au3+ 並培養 2-3 小時；(C) pbBe1k-melA & FhuA-GBP E. coli 於培養基中與 1 mM L-DOPA、 100nM IPTG 及 0.2% arabinose 在 37°C, 250rpm 轉速下培養小時，(D) pbBe1k-melA & FhuA-GBP E. coli 於同樣條件，但未加入 0.2% arabinose 之下，加入 1mM Au3+ 並培養 2-3 小時之 TEM 圖像。(scale bar 200 nm). 29.

(42) 第三章結論微生物細胞表面顯示技術應用範圍廣泛，而本實驗藉由來自 FhuA、截短的 OmpA 及 IgA protease 作為載體蛋白，將乘客胜肽顯示於 R. eutrpha 之表面。根據實驗結果分析，證實此三種載體蛋白，無論於 E.coli 或 R. eutropha 中，皆成功易位於細胞外膜，同時能顯示異源性胜肽，gold-binding peptide 於 R. eutropha 表面，並能夠將 13.3 nm Au 奈米粒子結合於細胞表面上，且在顯示之成效方面以 FhuA 及 IgA protease 較為顯著。進一步以 FhuA-passenger 系統將 Pt-{100} binding peptide (T7) 及 Pt-{111} binding peptide (S7)顯示於細胞表面，發現兩種胜肽顯示於 R. eutropha 表面並仍具合成 Pt nanoparticles 之功能，雖無法如 Chiu (2011)等人利用此兩種胜肽分別合成出由 6 個{100}面組成的立方體 Pt nanocrystal，及由 4 個{111}面組成的四面體 Pt nanocrystal 25，但仍可嘗試其他條件，表示使用 E.coli FhuA 作為載體蛋白之策略適合顯示異源性胜肽在細胞表面的生物工程應用。由於生物性的合成方法具有無毒並對環境友好性的特質，因此，利用微生物作為合成金屬奈米粒子反應器已廣泛的被研究。本實驗藉帶有 melA 基因片段的重組 E.coli，表現 tyrosinase 並催化 L-DOPA，產生出黑色素並合成 Au、Cu、Mn、Pt 及 Ni 等多種金屬奈米粒子外，亦能合成 AgCu 合金奈米粒子，且 AgCu 合金奈米粒子在抗菌測試中，比起等量之 Ag 奈米粒子有較好的抗菌效果。進一步將 FhuA-GBP 系統使用於 R. etli 及帶有 melA 基因片段之大腸桿菌，使其能將合成之 Au 奈米粒子顯示於細胞表面上。. 30.

(43) 實驗方法與材料微生物表面顯示系統之發展與應用細菌菌株、生長條件及 cloning 所有 R. eutropha 細胞在 28℃，轉速 200rpm 下，生長於含 50μg/mL kanamycin 的 LB 培養基中 overnight，在稀釋(1:1000)於含有 0.2% arabinose 的 LB 培養基中。本研究使用之菌株及質體、Primers 皆列於 Table S1 及 Table S2、Table S3 中。標準的 conjugation 操作步驟及 E. coli S17 用於產生 R. eutropha H16 菌株。Cloning 使用程序進行在 E. coli 中(Figure S2)。. 螢光顯微鏡分析細胞使用 0.2% arabinose 誘引紅色螢光蛋白 6 至 12 小時後，固定於以 PBS medium 配製之 1% agarose 的薄層上，Phase contrast 及螢光顯微鏡圖以 ZEISS Axio Scope.A1 Microscope，EC Plan-NEOFLUAR 100×/1,3 oil Ph3 觀察。. 分析 gold-binding peptide 顯示於 R. eutropha 表面之成效以 0.2% arabinose 誘引之細胞 300 L 於 1000 L 15 nM 金奈米粒子中培養 2-3 小時，在以 8000 rpm 轉速離心 1 分鐘，丟棄上清液後，以已滅菌之去離子水清洗三次。取已清洗之細胞約 3 L 於鍍碳銅網之暗面，放置 2-3 分鐘後以濾紙之尖處輕觸銅網，將多餘溶液分離。本研究所使用之 TEM 為 JEOL JEM-1200EX II。. 31.

(44) 利用 FhuA-passenger 系統顯示不同的胜肽細胞加入 0.2% arabinose 及 1mM Pt4+ 離子溶液誘 12 小時後，離心並將上清液保留，細胞則以 PBS buffer 清洗三次。取上清液及已清洗之細胞各約 3 L 於鍍碳銅網之暗面，放置 2-3 分鐘後以濾紙之尖處輕觸銅網，將多餘溶液分離。本研究所使用之 TEM 為 JEOL JEM-1200EX II。. 合成 13.3 nm 球形金奈米粒子 13.3 nm球形金奈米粒子藉由citrate還原HAuCl4 。HAuCl4 水溶液 (1 mM, 250 mL) 在加裝有迴流裝置之圓底燒瓶中攪拌並加熱至劇烈沸騰後，快速加入 trisodium citrate (38.8 mM, 25 mL)，並繼續加熱15分鐘，期間溶液顏色會由淡黃色轉變至深紅色，在以室溫狀態下持續攪拌至冷卻。金奈米粒子之尺寸由TEM (JEOL JEM-1200EX II)區分，平均尺寸為13.3nm，以 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek)測量吸收值並根據Beer’s law 在波長520 nm，extinction coefficient 為. ，金奈米粒子溶液. 濃度為15nM。. 32.

(45) 利用微生物合成多樣化金屬奈米粒子與應用細菌菌株、生長條件及 cloning 所有 Rhizobium etli 細胞在 28℃，轉速 200rpm 下，生長於 TY 培養基中生長於 overnight，在稀釋(1:1000)於含有 0.2% arabinose 的 TY 培養基中。 E. coli DH5 strains 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於含有 kanamycin (50 g/mL) LB 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM L-DOPA 的 M9 或 LB 培養基中。本研究使用之菌株及質體、Primer 皆列於 Table S4 及 Table S5、Table S6 中。Cloning 使用程序進行在 E. coli 中 (Figure S2)。. 藉由 Rhizobium etli 生成之黑色素合成金奈米粒子 Rhizobium etli 在 28℃，轉速 200rpm 下，生長於 TY 培養基中 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 1mM 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine (L-DOPA)的 TY 培養基中 12 小時後，直接加入 1mM Au3+ (HAuCl4 ．3H2O, Acros Organics)，或以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，上清液加入 1mM Au3+。. 利用重組大腸桿菌合成不同的金屬奈米粒子重組 E. coli DH5 strains, YCY_203, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於含有 kanamycin (50 g/mL) LB 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM L-DOPA 的 M9 或 LB 培養基中約 12 小時後直到產生約 50.71  3.40 g/mL 黑色素，以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，上清液分別加入 2.0 mM Au3+ (HAuCl4．3H2O, Acros Organics), Cu2+ (CuCl2, Acros Organics), Mn2+ (MnCl2．4H2O, Acros Organics ), Ag+(AgNO3, Acros 33.

(46) Organics), Pt4+ (H2PtCl6．6H2O, Acros Organics), and Ni2+ (NiSO4．6H2O, Acros Organics) 及 Ag+、Cu2+ 比例為 1:1 mM。. 調控金屬奈米粒子之大小重組 E. coli DH5 strains, YCY_203, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於含有 kanamycin (50 g/mL) M9 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM L-DOPA 的 M9 培養基中約 12 小時後直到產生約 50.71  3.40 g/mL 黑色素，以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，上清液分別加入 2.0 ，1.0，0.5 mM Au3+ (HAuCl4．3H2O, Acros Organics), Cu2+ (CuCl2, Acros Organics)，及將 50.71  3.40 g/mL 黑色素稀釋為 25 及 10 μg/mL，並分別與 2.0 mM Au3+ (HAuCl4．3H2O, Acros Organics), Cu2+ (CuCl2, Acros Organics)進行反應。. 金屬奈米粒子之應用重組 E. coli DH5 strains, YCY_203, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於含有 kanamycin (50 g/mL) 的 LB 培養基 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 L-DOPA 的 LB 培養基中約 12 小時後直到產生約 50.71  3.40 g/mL 黑色素，以轉速 13500 rpm 離心 15 分鐘將菌分離，上清液加入 Ag+、Cu2+ 比例為 1:1 mM 進行反應。將反應所得之銀銅奈米粒子離心並以滅菌水清洗三次並乾燥。E. coli DH10B strains, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於 LB 培養基 overnight，稀釋(1:1000) LB 培養基中 4 小時後，添加 100 與 150 g/mL 銀，銀銅合金奈米粒子繼續培養 8 小時，再將各菌液分別做 10、100 倍等之稀釋並取 8L 點於 LB-agar 盤上。. 34.

(47) 顯示重組大腸桿菌合成的金奈米粒子於細胞表面重組 Rhizobium etli, YCY_202, 在 28℃，轉速 200rpm 下，生長於 TY 培養基中 overnight，再稀釋(1:1000)於含有 1mM L-DOPA 及 0.2% arabinose 的 TY 培養基中 12 小時後，直接加入 1mM Au3+並進一步生長 2-3 小時，以 13500rpm 離心 1 分鐘並以去離子水清洗三次。重組 E. coli DH5 strains, YCY_201, 在 37℃，轉速 250rpm 下，生長於含有 kanamycin (50 g/mL)及 clro(g/mL )的 M9 培養基中 overnight，稀釋(1:1000)於含有 100nM IPTG 與 1mM L-DOPA 的 M9 培養基中約 12 小時後直到產生約 50.71  3.40 g/mL 黑色素，直接加入 1mM Au3+並進一步生長 2-3 小時，以 13500rpm 離心 1 分鐘並以去離子水清洗三次。. 穿透式電子顯微鏡(TEM)與元素分析上述之樣品取 3-5L 於鍍碳銅網之暗面，放置 2-3 分鐘後以濾紙之尖處輕觸銅網，將多餘溶液分離。本研究所使用之 TEM 為 JEOL JEM-1200EX II 。各奈米粒子之元素分析，使用場發射掃描式電子顯微鏡 (JEOL JSM-7600F)附 INCA X-Max EDS 測量，上述之樣品取 10L 於矽晶片上，並以高溫使溶液快速揮發即得之；而銀銅(1:1)及銀銅(0.25:1)奈米粒子則為乾燥後之樣品直接置於碳膠帶上進行測試。. 35.

(48) 各奈米粒子平均直徑之計算各奈米粒子之平均直徑皆使用軟體 image J 做計算，選擇要計算之圖像檔案後，先設定該圖像原先之 scale bar，裁切出要計算的部分並調整圖像之明亮及對比，再使用”Threshold”功能將不要的背景移除，只留下奈米粒子，再以”Analyze particles”功能得到奈米粒子之尺寸。利用下列公式即可計算出奈米粒子之直徑。(d=diameter, A=area) d=. √𝐴/𝜋. 標準品黑色素之定量取 1mg 之黑色素(Sigma)溶解於 1N NaOH 調整至 pH 值=12 的 M9 培養基中，再分別稀釋為 2、20、35、50、70 及 100 μg/mL，以 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek)測量吸收波長 280 nm 之吸收值，並以測得之吸收值做線性回歸。. Figure S1 1mg 之黑色素溶解於以 1M NaOH 調整至 pH=12 的 M9 培養基中，再分別稀釋為 2、20、35、50、70、100 ug/mL，以吸收波長 280nm 測得之吸收值並做線性回歸。 36.

(49) Figure S2 Cloning project flowchart.. 37.

(50) Table S 1 Bacterial strains used in this study Strain. Relevant genotype. Construction and source. Wild type R. eutropha pBAD-rfp bbr R. eutropha pBAD-rfp-gbp bbr R. eutropha pBAD-fhua bbr. DSM 428 pYCY_037 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_038 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_013 conjugated into R. eutropha H16. pYCY_067. R. eutropha pBAD-fhua-gbp bbr. pYCY_107. R. eutropha pBAD-fhua-rfp bbr R. eutropha pBAD-fhua-rfp-gbp bbr R. eutropha pBAD-ompa-gbp bbr R. eutropha. pYCY_063 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_027 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_039 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_049 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_082 conjugated. pBAD-ompa-rfp bbr R. eutropha pBAD-ompa-rfp-gbp bbr R. eutropha pBAD-ss-rfp-iga bbr R. eutropha pBAD-ss-gbp-iga bbr R. eutropha pBAD-fhua-t7 bbr. into R. eutropha H16 pYCY_081 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_007 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_071 conjugated into R. eutropha H16 pYCY_226 conjugated into R. eutropha H16. R. eutropha pBAD-fhua-s7 bbr. pYCY_225 conjugated into R. eutropha H16. E. coli DH10B pBAD-rfp bbr E. coli DH10B pBAD-fhua-rfp bbr E. coli pBAD-ss-rfp-iga protease bbr. pYCY_037 transformed into E. coli DH10B pYCY_027 transformed into E. coli DH10B. pYCY_007 transformed into E. coli DH10B.. R. eutropha H16 pYCY_ pYCY_052 pYCY_050. pYCY_051 pYCY_060 pYCY_080 pYCY_079 pYCY_068 pYCY_073 pYCY_263 pYCY_264 E. coli DH10B pYCY_037 pYCY_027 pYCY_007. 38.

(51) Strain E. coli DH5 pYCY_038 pYCY_039 pYCY_082 pYCY_081. Relevant genotype. Construction and source. E. coli pBAD-rfp-gbp bbr E. coli pBAD-fhua-rfp-gbp bbr E. coli pBAD-ompa-rfp bbr E. coli. pYCY_038 transformed into E. coli DH5α. pYCY_039 transformed into E. coli DH5α. pYCY_082 transformed into E. coli DH5α. pYCY_081 transformed. pBAD-ompa-rfp-gbp bbr. into E. coli DH5α.. 39.

(52) Table S 2 Plasmids used in this study Strain pYCY_037 pYCY_020 pYCY_004 pYCY_033. Relevant genotype pBBRMCS plasmid with pBAD-rfp pBBRMCS plasmid with 2494 pBbE5K-rfp pBBRMCS plasmid with pTrc-ss-gbp-iga protease pBBRMCS plasmid with 2494-rfp-gbp. pYCY_038. pYCY_013. pBBRMCS plasmid with pBAD-rfp-gbp. pBBRMCS plasmid with pBAD-fhuA. pYCY_063. pBBRMCS plasmid with pBAD-fhuA-gbp. pYCY_027. pBBRMCS plasmid with pBAD-fhuA-rfp 40. Construction and source. PCR fragments were amplified with primers 11 and 12, pYCY_037 as template. The PCR products were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_020. rfp-gbp fragments were treated with EcoRI and BamHI from pYCY_033, and cloned into plasmid pYCY_037. PCR fragments were amplified with primers 09 and 10, pYCY_027 as template. The PCR products were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_037. gbp fragments were amplified with primers 35 and 36 by annealing. The gbp fragments were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_027..

(53) Strain pYCY_039. Relevant genotype pBBRMCS plasmid with pBAD-fhuA-rfp-gbp. Construction and source PCR fragments were amplified with primers 11 and 12, pYCY_037 as template. The PCR products were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_027.. pYCY_049. pBBRMCS plasmid with pBAD-ompA-gbp. PCR fragments were amplified with primers 23 and 24, E. coli colony as template. The PCR products were treated with. pYCY_082. pBBRMCS plasmid with pBAD-ompA-rfp. pYCY_081. pBBRMCS plasmid with pBAD-ompA-gbp-rfp. NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_037. PCR fragments were amplified with primers 41 and 42, pYCY_049 as template. The PCR products were treated with NdeI and BglII, and cloned into plasmid pYCY_037. PCR fragments were amplified with primers 40 and 42, pYCY_049 as template. The PCR products were treated with NdeI and BglII, and cloned into plasmid pYCY_037.. pYCY_007. pBBRMCS plasmid with pBAD-ss- rfp-iga protease. 41.

(54) Strain. Relevant genotype. Construction and source. pYCY_071. pBBRMCS plasmid with pBAD-ss- gbp-iga protease. pYCY_226. pBBRMCS plasmid with pBAD-fhua-t7. pbad fragments were treated with PstI and EcoRI from pYCY_037, and cloned into plasmid pYCY_004. t7 fragments were amplified with primers 109 and 110 by annealing.. pYCY_225. pBBRMCS plasmid with pBAD-fhua-s7. The t7 fragments were treated with NdeI and XhoI, and cloned into plasmid pYCY_027. s7 fragments were amplified with primers 111 and 112 by annealing. The s7 fragments were treated with NdeI and XhoI, and cloned into plasmid pYCY_027.. 42.

(55) Table S 3 Primers used in this study Primers. Sequence. 009_FhuA EcoRI fw 010_FhuA XhoI rv. TTTTgaattcaaaagatctagatcttttaagaaggagatataatggc TTTTCTCGAGtcaagagtccggagaagagccagaaacgaagcgg aa TTTTcatatggcgagtagcgaagacgttatcaaaga TTTTggatccttaagagtccggagaagagccagaaacagcaccggtgg a TTTTCATatgaaaaagacagctatcgcgattgcagt. 011_RFP NdeI fw 012_RFP GBP BamHI rv 023_ OmpA NdeI fw 024_OmpA159GBP SmaI BamHI rv 035_GBP oligo NdeI/BamHI 036_GBP oligo com. ggatccttaagagtccggagaagagccagaaaccccggggttgtccggac g tatggtttctggctcttctccggactcttaag gatccttaagagtccggagaagagccagaaacca. NdeI/BamHI 040_ompA gbp rfp NdeI rv TTTTcatatgagagtccggagaagagccagaa 041_ompA rfp NdeI rv TTTTcatatggttgtccggacgagtgccgatg 042_ompA gbp rfp BglII fw TTTTAgatcttttaagaaggagatataatgaaaaagacagctatcgcgatt 109_T7 oligo NdeI/XhoI 110_T7 oligo NdeI/XhoI 111_S7 oligo NdeI/XhoI 112_S7 oligo NdeI/XhoI. g tatgaccttaaccacgttaaccaactaac tcgagttagttggttaacgtggttaaggtca tatgtcgtcctttccgcagccgaactaac tcgagttagttcggctgcggaaaggacgaca. 43.

(56) Table S 4 Strains used in this study Strain. Relevant genotype. E. coli DH5α. F80 lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 E. coli pbBe1k-melA and pKT-fhuA-gbp. Purchased from Protech Technology. E. coli pbBe1k-melA Wild type. pYCY_203 transformed into E. coli DH5α Purchased from BCRC (bioresource collection and research center, Taiwan) pYCY_063 conjugated into Rhizobium etli. YCY_201. YCY_203 Rhizobium etli. YCY_202. Rhizobium etli pBAD-fhuA-gbp bbr. 44. Construction and source. pYCY_195 and pYCY_203 transformed into E. coli DH5α..

(57) Table S 5 Plasmids used in this study Plasmids pYCY_002 pYCY_077 pYCY_203. pYCY_063. pYCY_195. Relevant genotype pBBRMCS plasmid with colE1, pTrc-rfp, kanR Broad host-range plasmid IncQ group, cmR pYCY_002 derivative, pBbe1k-melA kanR. pBBRMCS plasmid with BBR1, pBAD-fhuA-gbp, kanR. pYCY_077 derivative, pKT-fhuA-gbp. Construction and source. PCR fragments were amplified with primers 77-1 and 78-1, pTrc-melA from as template. The PCR products were treated with NdeI and XhoI, and cloned into plasmid pYCY_002. gbp fragments were amplified with primers 35 and 36 by annealing. The gbp fragments were treated with NdeI and BamHI, and cloned into plasmid pYCY_027. fhua-gbp fragments were treated with EcoRI and BamHI from pYCY_063, and cloned into plasmid pYCY_077.. Table S 6 Primers used in this study Primers. Sequence. 077-1_melARe NdeI fw 078-1_melARe_XhoI rv. TTTTCATatgccgtggctggtcggcaagc TTTTCTCGAGttaggcggacactatggctatttctagctttgc. 45.

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微生物細胞表面顯示系統及 合成多樣化金屬奈米粒子的開發與應用

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