3-1 Halobacterium halobium
3-1-1 菌體介紹
Halobacterium halobium 為一可以生存在鹽濃度高於 12 % 環境下的菌體，甚至 在飽和鹽濃度的環境下也能生存的非常好。其最適合生長的環境是在鹽濃度為 25 % (wt/vol)的環境中，所以在鹽湖、鹽田或死海等高鹽分的地方，都能發現它的蹤跡。
H. halobium 是兩端都有著鞭毛的桿菌 (Fig. 3-1)，其細胞膜主要由蛋白質及少數 的碳水化合物所構成。細胞膜是呈暗紅色的，可將其進一步分離成紅色細胞膜(red membrane，RM)以及細胞只有在低氧環境下生長時才會形成的紫色細胞膜(purple membrane，PM)。H. halobium 在有充足氧氣的環境下，絕大部分在生長時都是形成 RM；而在缺氧及光照的環境下生長時，則是可以形成含量一半以上的 PM。因此我 們不只可以在菌體生長時，製造低氧的環境來促使細胞合成 PM，更可額外提供光 源，來增加 PM 在每個細胞上的含量。
此菌特別的地方就在於，當環境為缺氧的狀態、而無法行正常的新陳代謝時，它 可以將光能轉換成化學能，形成一個橫跨細胞膜的氫離子濃度梯度，然後促進 ATP 的合成，以提供細胞正常活動時所需之能量(Henderson, 1977)。
3-1-2 紫色細胞膜 ( PM )
H. halobium 的 PM 紫色細胞膜中，存在一具有光驅動質子唧筒功能的蛋白質，
bacteriorhodopsin (bR)。bR 由於有著一個發色基(chromophore) ─ retinal 的存在，所 以具有此特殊功能。
由化學分析可以知道，PM 中的成分為 75 % 的蛋白質與 25 % 的脂質(lipid)。
而脂質的成分有 phosphatidyl glycerophosphate (52 %)、 phosphatidyl glycerol (4 %)、
largely squalenes (9 %) 、photphatidylglycerosulfate (5 %)、 glycolipid sulfate (10 %)、
triglycosyl diether (19 %) 與其他一些 glycolipid。而 RM 中的脂質成分則與 PM 的有 著些許的不同，我們將 PM 做蛋白質電泳的分析，發現只有單一個明顯的色帶，這 表示在 PM 中只存在著一種蛋白質，而且其分子量估算大約為 26,000 Da，此即 bR 蛋白質。而在 RM 中則包含了 25 種以上的蛋白質。由此可以推測，RM 上的蛋白 質包辦了細胞需正常活動的所有機能，而 PM 則只有在缺氧且照光時，啟動光驅動 質子唧筒這唯一的功能(Henderson, 1977)。
Fig. 3-1 H. halobium is a rod-shaped bacterium normally flagellated both ends. The white is the red membrane, and the gray is the purple membrane.
(http://omega.ilce.edu.mx:3000/sites/ciencia/volumen2/ciencia3/092/img)
bR 是由嗜鹽菌體 H. halobium 在低氧環境下所合成的，它是以二維六角晶格結 構排列在菌體的細胞膜上(Fig. 3-2)。每一個六角晶格是由三個蛋白質所形成的三聚體 (trimer)，而蛋白質之間則為可以穩定結構的脂質。這些脂質對於 bR 來說是非常重 要的，除了穩定結構之外，在 bR 推出質子時還有調節 pKa 值的功能(Hendler and Dracheva, 2001)。
在 Henderson (1977) 的文獻回顧中有提到，Blaurock 與 Stoeckenius (1971)是最 先觀察到 PM 中的蛋白質與一些脂質為規則性排列的人。他們以 X-ray 觀察在雲母 基材上乾燥的 PM，發現在平行於細胞膜的平面上，有六角形排列的物質，且是遍及 整個 PM 的表面，而膜的厚度大約只有 49 Å (Henderson, 1977; Lanyi and Luecke, 2001)。Qutub 等人在 2004 年時也用 lipidic cubic phase 的方式，讓 bR 在他們所設 計的 Cryoloop 上呈現六角晶格狀(Fig. 3-3)，他們且更進一步地以 AFM (atomic force microscopy)分析探討 bR 結晶的情形。而 Nollert 在 2004 年曾針對 lipidic cubic phase 法於膜蛋白結晶的應用上做詳盡的說明及回顧(Fig. 3-4)。
Fig. 3-2 Arrangement of bR and lipids in 3D crystals grown in the cubic lipid phase (Lanyi and Luecke, 2001).
Fig. 3-3 An optical microscopy image of a hexagonal bR crystal grown in monoolein cubic phase (Qutub et al., 2004).
Fig. 3-4Growth of bR crystals within a monoolein-based lipidic cubic phase matrix in a glass vial. (A) The 10 µL crystallization experiment was set up in a glass vial. (B) bR microcrystals formed within 1 month. (C) Schematic close-up of purple bR crystals with sizes up to ca. 100 µm along their longest dimension (Nollert, 2004).
3-2 Bacteriorhodopsin (bR)
3-2-1 bR 之結構
bR 的存在，對於無法行呼吸作用時的 H. halobium 來說，是一個可以緊急驅動 而使得菌體可以繼續生存下去的一種光驅動質子唧筒(light-driven proton pump)。它可 以將光能轉換成質子梯度來啟動一連串的反應，以利菌體的生存；而由吸收光譜可以 知道 bR 的最大吸收波長大約在 568 nm。
bR 是一個膜蛋白質，由 248 個胺基酸所組成(Fig. 3-5)，結構為 7 個 α-helix 與 2 個β-sheet 所架構而成，而 7 個 α-helix 我們可以分別編號為 A、B、C、D、E、F 與 G，
而其中 B、C 形成一個反平行方向的 β-strand (Fig. 3-6)。其分子量大約為 26 kDa。bR 之所以會受光激發，全因為其內部有一發色基 ─ retinal 的存在，位置大約在於細胞 膜中央的位置。其與 bR 內的 Lys-216 連結形成被稱為 Schiff base 的碳氮鍵 (C = N) (Fig. 3-7)。Retinal 則是橫向存在於螺旋結構之中，大部分殘基的功能是在固定整個 helix 結構及氫離子的傳輸路徑。Retinal Schiff base (RSB) 將 bR 分成兩個部份，一個 是與釋放質子有關的胞外通道 (extracellular pathway，EC)，另一個是與質子的擷取有 關的胞內通道 (cytoplasmic pathway，CP)。
Fig. 3-5 Schematic diagram of the structure of bR. (Sharma et al., 2004).
在retinal 朝向胞外的那端，有著許多極性的殘基(如：Asp-36、Asp-102、Asp-104、
Lys-159、Glu-161、Arg-164、Glu-166、Arg-227)，他們扮演著讓 Schiff base 去質子化 及釋放質子到細胞膜表面的角色，比較重要的有 Asp-85、Arg-82 及較靠近的 Glu-194 及Glu-204。而在朝胞內的那端，卻沒有發現可以將 retinal 再質子化的結構分子。在 高解析的結構圖(Fig. 3-8)上我們可以發現，有一個水分子 Wat-402 將質子提供者 Schiff base，與質子接受者 Asp-85 區隔開來，在胞外的區域包含 7 個水分子，與一些有極 性的側鏈，有Asp-85，Asp-212，Thr-89，Trp-86，Tyr-83，Tyr-57，Tyr185，Arg-82，
Glu-194，Glu-204 與 Ser-193，而形成一個三維的氫鍵鍵結結構，連結 Schiff base 與 細胞膜表面(Lanyi, 2004)。
Fig. 3-7 X-ray crystallographic structures of the Schiff base region in bR (Kandori, 2004).
Fig. 3-8 Structure of bR (Lanyi, 2004).
3-2-2 bR 的光循環機制
bR 在受光激發後，其結構會變化成一連串的中間產物，至今能確定且較穩定的 激發態包括：K、L、M、N 及 O State (Fig. 3-9)。
Fig. 3-9 The photocycle of bR (Heberle et al., 2000).
其實從十七世紀，bR 被發現後至今，其光循環機制仍然是眾說紛紜，如光循環 是單一循環，或是多循環；是可逆方向性的，還是無方性的，到現在都還是受爭議的 議題。既然沒有一個可完美解釋的光循環機制，現在大部分都以單一且可逆的光循環 機制，及已經非常確定結構的各個基本中間介質，來當作基本的機制 (Lanyi, 2004)。
Fig. 3-10 Photocycle scheme of bR with proton release (Lanyi, 2004).
Fig. 3-10 為單一且可逆的光循環機制，最主要的中間介質為 M 及 N state。M state共分三種，首先是因 L state 的 RSB 去質子化而形成的 M1。在 M1 中 RSB 因 質子化而與胞外環境隔絕，與胞內連接，形成 M2。而後bR推出質子到胞外，形成 M2´，Schiff base 因 Asp-96 的水解而再質子化，形成 N state。N state 再因 Asp-96 從胞內得到質子而再質子化，而形成 N´ state (Lanyi, 2004; Heberle, 2000)。
Fig. 3-11 Changes of the geometry of the retinal with the connected side-chain of Lys-216 and water 402 in the intermediates of first phase of the photocycle. (Lanyi and Schobert., 2003).
Fig. 3-12 The photocycle of bR (Hirai and Subramaniam, 2003).
Fig. 3-13 Simplified level diagram representing the photochemical cycle of bR molecule (Singh and Roy, 2003).
由於各個中間分子的結構不同，使得其顏色也會各有所變化，自然其吸收波長也 就大不相同(Fig. 3-11、Fig. 3-12、Fig. 3-13) (Hirai and Subramaniam, 2003)。
在光循環機制上還存在著其他分支的中間激發態存在，如不同波長的光源會激發 bR 形成不同的中間象態，例如若以紅光照射 bR，則bR會由 all-trans 的 O state 變 成另一個不在主光循環機制中的 9-cis P state (Fig. 3-14)。
Zhang 等人在 2004 年時，利用 150 W 的鹵素燈透過紅色濾片(λ = 680 nm)照射 bR 薄膜，利用量測照射紅光後的 bR吸收光譜變化，由原本的最大吸收波長 570 nm 變成 488 nm，來證明 P state 的形成。此外，他們更利用化學方法修飾的 bR 薄膜，
來增加且加速 P state的產生；其將 bR 與 C8H20ClN (tetraethylammonium chloride) 以 一定比例混合之後，再加入已溶在檸檬酸中的凝膠溶液，最後將混有 bR 的凝膠溶 液塗覆在親水性的石英基材上乾燥成膜。由 FTIR 分析可發現如此的化學修飾並沒 有破壞 bR 的基本二維結構。
Fig. 3-14 The photocycle of bR with a branching reaction (Zhang et al., 2004).
他們也證明了隨著照光時間的增長，P state 的量會持續增加，直到整個系統達到光化 學平衡。而且 P state 是非常穩定的物質，在照光過後的 30 天後仍然非常穩定地存 在著(Fig. 3-15、Fig. 3-16)。
Boyer 等 人 在 1995 年 時 則 是 利 用 添 加 Enflurane (trademark Ethrane; 2 chloro-1,1,2 trifluoroethyl difluoromethyl ether) 得到 bR 的 P state，而且由光譜可以證 明只要將此添加物移走，bR 仍然可以回到原始的基態(Fig. 3-17)。Enflurane 影響 bR 結構的原因，主要是影響 Schiff base 的去質子化，其量越多，bR 中 all-trans retinal 的比例會越高，即 bR 在 560 nm 的吸收峰會越來越小，而於 480 nm 的吸收峰則 會越來越大 (Nishimura et al., 1985)。
Fig. 3-15 (A) The difference spectra of the chemically modified bR film at various exposure times. (B) The thermal stability and lifetime of the P state (Zhang et al., 2004).
Fig. 3-16 The dependence of the absorption changes of the P state in the chemically modified bR film on the exposure time (Zhang et al., 2004).
Fig. 3-17 Reversible transformation of bR absorption spectrum in purple membrane films in the presence of Enflurane (Boyer et al., 1995).
3-2-3 氫離子之傳輸路徑
bR 受光激發後所產生質子的傳遞是由於 retinal 形成異構物所產生的。在光循 環過程中，bR 須經過一連串中間介質的改變，然後回到基態。
bR568 ⎯⎯→hv K590 ⇔ L550 ⇔ M1410 ⇔ M2410 ⇔ N560 ⇔ O610 ⎯⎯→ bR568
在 bR 被激發成 K state 時，其中至少儲存了 11.6 kcal/mol 的能量，以驅動接 下來光循環中一連串的等溫反應。這些反應都牽涉了氫離子的傳輸，而氫離子傳輸大 約分成五大步驟，其中兩個步驟是有關於將氫離子推出胞外，及從胞內吸取氫離子有 關，其餘的步驟則是氫離子在細胞膜內的傳遞 (Fig. 3-18) (Balashov, 2000)。
Fig. 3-18 Scheme showing steps in light-driven proton transport by bR from the inside the cell to the outside (Balashov, 2000).
當 bR 在基態時，Schiff base是質子化的 (C = NH+)，受光激發後會使 Schiff base 去質子化，繼而 bR 會推出質子到胞外。Schiff base 的再質子化則是從胞內擷取質 子。而在 bR 內有兩個半通道 (half-channel)，以連接胞內環境與Schiff base，Schiff base 與胞外環境。連接胞外的通道是較寬的；連接胞內的則較窄(Fig. 3-19)。
除了 Schiff base 之外，跟氫離子傳輸有關的殘基，就屬 Asp-85 最為重要了，
此胺基酸的位置大約在 Schiff base 往胞外方向大約 4.2 Å 的地方。在 Schiff base 去 質子化的時候，Asp-85則是扮演質子接收者的角色。再來則是 Asp-96，其位置在 Schiff base 朝胞內約 11 Å 的位置，大約是 Schiff base 與 胞內表面距離的一半，在 bR 為基態時其為質子化的狀態，等 bR 受光激發，則會去質子化而提供質子給 Schiff base。簡單來說 Schiff base 從 Asp-96 得到質子，而提供質子給 Asp-85，
Asp-96 從胞內得到質子，Asp-85 則推出質子到胞外。驅動質子傳遞的能量主要來自 於受光激發時，retinal 由 all-trans 轉為 13-cis 時所儲存的能量(Balashov, 2000)。
當 bR 在 5 < pH < 9 時， retinal 受光激發變為 K state，C13 = C14 幾乎全部轉 成 13-cis 的形式，接著轉變成 L state。在 L state 時，Schiff base 準備釋放出質子 給 Asp-85，由 L state 轉變成 M state 時，bR 內傳遞質子的通道會打開(Fig. 3-20)，
Schiff base 會推出質子給 Asp-85。為了要使 pKa 值較高的 Schiff base 能提供質子 給 pKa 值較低的 Asp-85，必須要有額外的能量的存在，此能量則來自於 bR 的基
Schiff base 會推出質子給 Asp-85。為了要使 pKa 值較高的 Schiff base 能提供質子 給 pKa 值較低的 Asp-85，必須要有額外的能量的存在，此能量則來自於 bR 的基