4-1 實驗藥品
(1) Agar，瓊脂：Detroit，金暐代理
(2) Antifoam，polyproylene glycol，H[OCH(CH)3CH2]nOH，消泡劑：Nacalai Tesgue Inc., Japan，鼎好代理
(3) Bacteriological peptone，消化蛋白質：Oxoid Ltd., Basingstoke England，金暐代理 (4) Deoxyribonuclease-I，Dnase，DNA 分解酵素：Sigma，六和代理，酵素活性為
2000 unit/mg
(5) Dextrose，C6H12O6，葡萄糖：J. T. Baker (6) D. I. Water，H2O，去離子水：8 樓實驗室公用 (7) Ethanol，C2H5OH，乙醇：國宜代理
(8) Halobacterium halobium–S9：實驗生產培養而來。由德國 Max-Plank Institute 的 Dieter Oesterhelt 教授提供 H. halobium –S9 菌種
(9) Hydrochloric acid，HCl，鹽酸：J. T. Baker
(10) Idium Tin Oxide glass，ITO 導電玻璃：正隆公司提供，電阻值為 10 Ω，ITO 鍍膜厚度值為1500 Å
(11) Isopropanol，C3H7OH，異丙醇：J. T. Baker
(12) Magnesium sulfate，MgSO4‧7H2O，硫酸鎂：Sigma (13) Nitric acid，HNO3，硝酸：J. T. Baker
(14) Polydimethylsiloxane，PDMS，聚二甲基丙烯酸甲酯：DOW CORNING，喬越 公司
(15) Potassium chloride，KCl，氯化鉀：J. T. Baker (16) Potassium hydroxide，KOH，氫氧化鉀：ACROS
(17) Potassium phosphate, dibasic，K2HPO4，磷酸氫二鉀：J. T. Baker (18) Potassium phosphate, monobasic，KH2PO4，磷酸氫化鉀：J. T. Baker (19) Purple membrane，PM 細胞膜：實驗生產純化而來
(20) Sodium chloride，NaCl，氯化鈉：J. T. Baker
(21) Sodium hydroxide，NaOH，氫氧化鈉：Mallinckrodt
(22) Sodium phosphate, dibasic，Na2HPO4，磷酸氫二鈉：J. T. Baker
(23) Sodium phosphate, monobasic，NaH2PO4，磷酸氫化納：J. T. Baker (24) Sucrose，C12H22O11，果糖：Sigma
(25) Trisodium citrate，C6H5O7Na3‧2H2O，檸檬酸鹽：Sigma (26) 銅膠帶：皓睿科技有限公司
(27) 抗酸鹼膠帶：友俊國際股份有限公司 (28) 矽膠：DOW CORNING，喬越公司 (29) 模型改造版：TAMIYA，萬品館模型專賣 (30) 模型膠：TAMIYA，萬品館模型專賣 (31) 鋁膠帶：皓睿科技有限公司
4-2 實驗設備
Fig. 4-1 為光電系統設備的架設圖，主要元件有氙燈、濾片、光遮蔽物，光電化學系 統，微電流儀及電腦。我們所使用的微電流儀為雙電極的形式，其餘的設備，包括養 菌發酵槽的列表如下：
(1) 微生物菌體發酵槽：B. Braun Biotech Internatioonal，型號為 Biostat B，尚偉公司 代理
(2) 循環水控制水槽：EYELA COOL ACE，型號為 CA-1200，尚偉公司代理
(3) 灌注式管柱層析蛋白質純化系統 (Perfusion Chromatography Workstation) ： ABI Applied Biosystems，型號為 Bio CAD 700E，展陽公司代理
(4) 高速離心機：Beckman，型號為 Avanti J-25，貝克庫爾特公司代理
(5) 超高速離心機：Beckman，型號為 OPTIMA XL-90K，貝克庫爾特公司代理 (6) 高速離心機所用轉子：Beckman，型號為 JA 25.5 (fixed-angle rotor , 8 × 50 ml)，貝
克庫爾特公司代理
(7) 高速離心機所用轉子：Beckman，型號為 JA 10 (fixed-angle rotor , 6 × 500 ml)，貝 克庫爾特公司代理
(8) 超高速離心機所用轉子：Beckman，型號為 SW 28 (6x swinging-buckets rotor)，貝 克庫爾特公司代理
(9) 超高速離心機所用離心管：Beckman，型號為 Beckman Ultra-clear tube，產品貨號 為344058，管長 25 × 89 mm，容量為 38.5 ml，貝克庫爾特公司代理
品，型號為Jasco V-530，全拓公司代理
(11) pH 值測定儀：JENCO Electronics. LTD.，型號為 Microcomputer pH-Visio 6071，伯昂興業股份有限公司代理
(12) 透析袋：SPECTRA/Pro.，產品貨號為 132706，直徑為 29 mm，MWCO 值為 12K-14 K，康谷公司代理
(13) 透析夾：SPECTRUM MEDICAL Industries，產品貨號為 Closure 132736，夾 長為4 cm，康谷公司代理。
(14) 磁石加熱攪拌器：Corning。
(15) 超音波震盪器：NEY Industry，型號為 ULTRA sonic 19B
(16) 氙燈激光源組：Model A-1010B，Photon Technology International (17) 光源遮斷器：Model 300C，Scitec Instruments
(18) 濾光片(Blue、Green、Red、Yellow) ：Model 079-0010、0020、0030、0040，OptoSigma (19) 逆電極：白金棒，國宜代理
(20) 微電流儀：Model 6485，Kiethley
(21) 微量電子天秤：Model AG104，Mettler Toledo (22) 恆溫振盪培養器：Model LM-570，COCONO
(23) 桌上型微量離心機(Microcentrifuge) ：Model UFO2100，Pantech (24) 微量離心機：Model 5410，Eppendorf
4
Kiethley-6485 picoammeter
Counter electrode Working
electrode
Xenon light Filter Light gate Photo-electrochemical system Computer
Fig. 4-1 光電流訊號裝置圖
4-3 實驗流程
H. halobium-S9 菌體搖瓶培養
H. halobium-S9 發酵培養
紫色細胞膜純化
4-4 實驗步驟
4-4-1 H. halobium-S9 菌株培養 發酵培養
(1) 發酵系統外圍架設日光燈管，並依發酵槽標準操作程序進行前置作業。
(2) 由濃度 2 N、體積各為 500 mL 的 NaOH 及 HCl 所組成之酸鹼液，藉系統 pH 電極之檢測自動控制發酵槽槽體內之pH 值。
(3) 於配製好之 2 公升培養基中加入適量消泡劑，及 40 g 之 glucose 做為碳源來 源，每一公升約添加5 滴消泡劑，以避免發酵時有過多氣泡產生，造成氣泡 破裂時所產生的剪力傷害到菌體。
(4) 進行槽體與饋料瓶之滅菌操作，並調控好循環水系統確定系統中含有充分 的控溫循環水可用。
(5) 空氣壓縮機為桌上型小型壓縮機，直接接上管線至發酵槽。
(6) 槽體滅菌後接上相關管路及循環系統裝置與偵測器等外接元件，連結控制 器平面與發酵槽相關管路元件後，即進行氧氣電極極化程序。
(7) 至氧氣電極極化 6 小時後，確定槽體溫度下降後即進行發酵槽系統參數設 定。
(8) 設定溫度為 37 ℃，槽體葉片攪拌速率為 40 rpm，酸鹼 pH 質以 2N 的 NaOH 與HCl 之饋料控制，維持系統 pH 值在 7-7.2 範圍內，通氧量則為壓縮機的 最小值。
(9) 設定好系統控制參數後，即進行種菌動作。將 200 mL 成熟菌液經種菌口送 入槽體培養基中。
(10) 每日經取樣瓶進行取樣動作，藉 UV/Vis 光譜分析儀紀錄菌液 OD560、OD580、 OD660等數值。
4-4-2 PM 細胞膜純化
(1) 將發酵後之 2.2 公升成熟菌液，利用 10,000 rpm 轉速於 4 ℃環境下離心 30 分鐘，以進行收菌動作。
(2) 使用 BS 鹽水溶液清洗離心後之菌體顆粒，並以 10,000 rpm 轉速於 4℃環境 下離心30 分鐘進行清洗收菌，重複上述清洗與離心之程序 3 次，且需注意
所使用之離心管的數量應逐次減少以利菌體收集。
(3) 加入 40 mL 的 BS 鹽水溶液溶解清洗完畢之菌體顆粒，置入孔徑大小為 13 K 的透析膜中，並添加1500 Units 的 DNase 於上述溶液中，將透析膜使用透 析夾做封口動作後，即置入外在環境為 5 公升之去離子水溶液中，於室溫 下進行透析程序約16 個小時。
(4) 隔日即將透析袋中的紫色溶液，利用超高速離心機進行收集，設定轉速為 12,500 rpm 溫度控制為 4 ℃環境下，離心 30 分鐘後可得紫色外觀之顆粒。
(5) 使用 0.1 M NaCl 鹽水溶液進行清洗程序，設定離心機轉速為 12,500 rpm，
在4 ℃環境下離心 30 分鐘，收集外觀為紫色的沉澱物。
(6) 以去離子水清洗所得紫色沉澱物，並設定超高速離心機轉速為 12,500 rpm，
在4 ℃環境下離心 30 分鐘﹔重複此步驟至上清液為清澈不帶色為止，並需 注意要逐次減少離心管使用數量，以減少沉澱物附著於管壁造成收集時有 所損失。
(7) 將經上述步驟所得之紫色沉澱物溶於 18 mL 的去離子水溶液中。
(8) 製作果糖梯度，平均每管離心管中置入 2 mL 濃度為 60 %的果糖濃度於底 部，於其上製造出30 mL 容積之 30 %-50 %的果糖濃度梯度，再將(7)步驟 中的紫色溶液每管分配6 mL 至裝有果糖濃度梯度之離心管的最上層。
(9) 進行超高速離心操作，將上述裝有樣品與果糖梯度之離心管，先以天平準 確量測各管重量相同至小數第 3 位，並小心盡量減少搖晃離心管，將其置 入SW 28 轉子中設定轉數為 12,500 rpm，環境溫度為 4 ℃下離心 18 小時。
(10) 於超高速離心程序後，若無誤即可明顯觀測到離心管中 PM 與 RM 的分 層，此時利用微量吸管吸取出PM 分布帶。
(11) 使用去離子水進行 PM 與殘餘果糖的清洗程序，為避免 PM 樣品有過多果 糖的殘餘，仍需以去離子水加以清洗並以超高速離心機進行沉澱物的收 集，設定轉速為12,500 rpm，溫度為 4 ℃環境下離心 45 分鐘。
(12) 重複(11)步驟 3 次。
(13) 將收集所得知 PM 樣品溶於適量的去離子水中保存，並將其分裝成 1 mL 來保存。短期保存而言儲放溫度為0 ℃ - 4 ℃環境，若長期儲放則以-20 ℃ 環境為佳。
4-4-3 光電化學系統的建立
(1) 將兩個全量比色管的一個完全透明面切除。
(2) 在兩個比色管缺面的部分插入中間介質，用矽膠黏合比色管與中間介質，
如 Fig. 4-3 所示。
(1) 將組合好的裝置放入乾燥箱，等待一天完全黏合後，就可架設光電化學系統 來測量紫色細胞膜之光電訊號。
(a) (b)
cuvette intermediate
cuvette
intermediate
10 mm 20 mm
30 mm
Fig. 4-3 比色管系統 (a) 側面示意圖，(b) 正面示意圖
2. 清洗 ITO 玻璃
(1) 使用鑽石刀切割適當大小面積之 ITO 導電玻璃。
(2) 利用三用電錶確定 ITO 玻璃之導電面。
(3) 以去離子水清洗玻璃，在清水中以超音波震盪 15 分鐘。
(4) 置換掉去離子水溶液，再於 Isopropanol 震盪清洗 15 分鐘。
(5) 倒掉 Isopropanol 溶液，最後以去離子水溶液清洗 15 分鐘 2 次。
(6) 於室溫無塵環境中靜置待乾。
3. 蝕刻 ITO 玻璃
(1) 將已洗淨且切刻成適當大小的 ITO 玻璃，用抗酸鹼膠帶將欲留 ITO 的部 分貼住，而且要非常緊密的貼住，以防預保留 ITO 的部分也被蝕刻掉，如 Fig. 4-4。
(2) 將 ITO 蝕刻液加熱到 55 ℃，然後將已貼抗酸鹼膠帶的 ITO 玻璃放入溶
液中，蝕刻時間為 270 秒。
(3) 蝕刻時間結束後將 ITO 玻璃取出，用大量的自來水連續沖洗 15 分鐘。
(4) 最後將抗酸鹼膠帶撕去，會得到我們所需的 ITO 玻璃。
(a)
15 mm
5 mm
35 mm 45 mm
(b)
(c)
Fig. 4-4 (a) 貼上抗酸鹼膠帶的 ITO 玻璃，藍色部分即為抗酸鹼膠帶，(b) 從蝕 刻液取出的 ITO 玻璃，空白部分為 ITO 被蝕刻，而成為空白玻璃的部 分，(c) 撕去抗酸鹼膠帶的 ITO 玻璃。
PDMS 陣列系統 (PDMS array system)
(1) 先用模型改造版作出欲成型的模組 (Fig. 4-5)。
(2) 將 PDMS 的母液與作用劑 (curing agent)，以重量比 10：1 的比例混合均 勻。
(3) 將混合液用超音波震盪 30 分鐘。
(2) 將震盪完畢的混合液進行真空乾燥的動作，以除去溶液中所有的氣泡。
天的時間讓 PDMS 成為固體，就可從模組中取出，如 Fig. 4-6 所示。
5 mm 5 mm
5 mm
Fig. 4-5 PDMS 模組
(a)
(b)
(c)
(d)
5 mm 5 mm
5 mm
35 mm
25 mm
Fig. 4-6 (a) PDMS 模組，(b) 將去除氣泡後的 PDMS 溶液倒入模組中，乾燥一 天，(c) 將形成固體的 PDMS 從模組中取出，(d) 完成的 PDMS。
(6) 依序將空白玻璃、PDMS、中間介質、PDMS、已蝕刻 ITO 玻璃用矽膠黏
合，放入乾燥箱中一天，等待完全黏合。要注意的是 ITO 玻璃的導電面要 朝向 PDMS 側，如 Fig. 4-7 所示。
uncoated glass
PDMS
intermediate ITO glass
conductive surface
PDMS conductive surface
intermediate
(a) (b)
35 mm
35 mm
10 mm
5 mm 5 mm
5 mm 25 mm
Fig. 4-7 PDMS 陣列系統完成圖 (a)為側面示意圖，(b)為正面示意圖，銅色部分 為中間介質，斜線部分為 ITO 玻璃的導電面。
4-4-4 偵測光電流訊號
(1) 比色管系統與 PDMS 陣列系統我們都是用 ITO 玻璃當作工作電極，白金 棒當作逆電極。ITO 玻璃的導電面都是朝向中間介質的方向。
(2) PM 溶液置放在工作電極之側，而電解質是置放在逆電極那側。PM 與電解 質容易的量是相等的，系統裝置如 Fig. 4-8 所示。
(3) PDMS 陣列系統是利用針筒將溶液注入其內，溶液量為注滿槽體體積為原 則。
(4) 裝置圖如 Fig. 4-1 所示，測光電流訊號時，將微電流儀的兩個鱷魚夾分別 連接系統的工作電極與逆電極。燈源則是照射 PM 側，燈源距離系統距離 為20 公分。
Pt rod ITO glass
PM electrolyte
intermediate
conductive surface
(b) PDMS array system
Pt rod ITO glass
PM electrolyte
intermediate
conductive surface
(a) cuvette system
30 mm
20 mm
10 mm
25 mm
Fig. 4-8 (a) 比色管系統，(b) PDMS 陣列系統裝置圖，工作電極皆為 ITO 玻 璃，逆電極為白金棒，紫色部分為 PM 溶液，網點部分為電解質。