5-1 菌體培養及觀察
在 H. halobium-S9 菌體的培養中，總共分成三個階段的培養：小量的試管 培養、搖瓶培養及大量的發酵培養。
第一階段的試管培養中可以明顯觀察到，原本為澄清黃色的培養液，大約 5-7 天後，變為略帶紫色渾濁的液體，由此可初步觀察到菌體的生長情形。第二 階段則是將原本 3 mL 的菌液放大成 50 mL 來培養，與試管培養相同，大約 5-7 天，就可以觀察到紫色渾濁的菌液。最後則是大量的發酵培養，將搖瓶培養所得 到 200 mL 的菌液，放大成 2 L 來培養，其與搖瓶培養最大的不同點在於發酵 培養有控制培養基之酸鹼值維持中性，通氧量固定為壓縮機之最小值，搖瓶培養 則沒有控制酸鹼值，也沒有固定的通氧量。
Fig. 5-1 為發酵培養時觀察菌體的生長曲線，560 nm 吸收光譜是觀察 PM 細胞膜合成的情形，660 nm 吸收光譜則是觀察菌體本身生長的情形，580 nm 吸 收光譜也是觀察 PM 細胞膜合成的情形。國外學者有的是利用 560 nm，有的則 是利用 580 nm 來觀察 PM 細胞膜合成的情形。
由生長曲線可以觀察到，發酵培養並沒有一個明顯的遲滯期 (Lag phase)，
而且 OD560 的值幾乎都是大於 OD660，這代表在低養分、缺氧且照光的環境下，
菌體首先為了本身能適應環境生存，先開始合成 PM 細胞膜，繼而利用氫離子 唧筒造成氫離子濃度梯度，合成 ATP，得到生存所需的能量，之後才有生長菌 體的動作，所以在同一時間中，可以觀察到 PM 細胞膜合成的量都會略高於菌 體生長的量。
在發酵培養完畢後，經過離心收集菌體，可以更明顯觀察到紫色的 H.
halobium-S9 菌體，由此可證明在低養缺氧且照光的環境下，此菌體會合成含有 bR 蛋白質的紫色細胞膜。
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
稀釋為 5 mg/mL。由圖中可以明顯觀察到，在可見光的範圍內，在 568 nm 有 一個最大吸收波長，這與大部分的文獻記載 bR 蛋白質的吸收波長吻合，所以 可以初步確認我們的 PM 細胞膜溶液的確含有 bR 蛋白質。
300 400 500 600 700 800
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
3.0 concentration of PM = 5 mg/mL
568 nm
Absorption
Wavelength (nm)
Fig. 5-2 PM 細胞膜溶液全吸收光譜圖
5-3 光電化學系統
5-3-1 中間介質對光電流訊號之影響
對於建立光電化學系統而言，形成一個完整的通電迴路是非常重要的，我們 利用比色管系統來測試三種不同的中間介質，來找出最適合者。Fig. 5-3、Fig.
5-4、Fig. 5-5 分別為以銅片、鋁片及透析膜為中間介質的比色管光電流訊號圖。
由結果可以明顯看出，以銅片為介質的系統有非常明顯的開關燈訊號，其餘兩者 則無，其光電流訊號大小約為 1 μA。
鋁片沒有訊號的原因可能為其導電性較銅片差，而且鋁片的表面非常容易氧 化，會影響其導電性。而透析膜則可能無法使兩邊溶液確實隔開，雖然其系統為 一完整迴路且bR 受光時也能正常推出質子，但是兩邊電極溶液中的離子會穿過 透析膜的孔隙，相互參雜在一起，而影響光電流的產生。
若使用沒有孔隙的膜，預估因兩溶液間沒有離子的傳遞，薄膜也沒有導電 性，這系統則不是一完整的迴路，而無法測得光電流訊號。所以初步判定中間介 質的選擇，有孔隙者雖然可讓離子通過使系統為一完整迴路，不過參雜在一起的 兩極溶液，卻會影響光電流的產生。銅片雖然沒有可讓離子通過的孔隙，不過其 有良好的導電性，可使系統成一完整迴路，且沒有使兩極溶液混在一起的缺點；
金片或銀片也是良好的中間介質；鋁片的缺點則是因為其表面會快速氧化，而影 響導電性。所以介質使用沒有孔隙、且有良好導電性的銅片是較適當的。
中間介質為銅片的比色管系統會有明顯的因開關燈而產生的光電流訊號，是 因為 PM 細胞膜中的 bR 蛋白質受到光的激發而推出質子，與不受光時吸收質 子，造成工作電極與逆電極間瞬間產生電位差，所產生的電流訊號。Fig. 5-6 為 不含 PM 細胞膜溶液，只有去離子水，也就是只有溶劑，而沒有溶質之光電訊 號圖，由沒有訊號顯示之結果更可證明 Fig. 5-3 之光電流訊號是由 PM 細胞膜 所產生。
5-3-2 比色管光電流訊號之機制
Fig. 5-7 為中間介質為銅，且兩電極已接上微電流儀的比色管光電化學系 統。不照光時，bR 蛋白質為基態，整個光電化學系統為電中性平衡，所以光電 流訊號為一水平的基準線。PM 細胞膜溶液在照光之後，bR 蛋白質會因激發而 推出許多的質子，使得工作電極側形成比逆電極較高的電位，而引起一電子流由 逆電極 側流向工作電極側，此時可以測得一個瞬間電流上升的訊號。
0 5 10 15 20 25 30 35 -1.0x10-6
-5.0x10-7 0.0 5.0x10-7 1.0x10-6 1.5x10-6
off off on on
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light intermediate-Cu
light-on = 1.195E-6 A light-off = -9.348E-7 A
current = 1.065E-6 A = 1.065E-6 A/cm**2
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-3 中間介質為銅之比色管光電流訊號圖(工作電極側為 8 mg/mL 的 PM 溶液 800 μL，逆電極側為 0.1 M 的 KCl 800 μL，均未調酸鹼值)
0 5 10 15 20 25 30
-1.0x10-8 -5.0x10-9 0.0 5.0x10-9 1.0x10-8
Current (A)
Time (s)
Cuvette system, 120 W Xenon light, green filter intermediate-Al
Fig. 5-4 中間介質為鋁之比色管光電流訊號圖(工作電極側為 8 mg/mL 的 PM 溶液 800 μL，逆電極側為 0.1 M 的 KCl 800 μL，均未調酸鹼值)
0 10 20 30 40 50 60
Cuvette system, 120 W Xenon light, green filter intermediate-membrane
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO glass-1000 ul water
counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M) current (light on) = 1.916E-8 A current (light off) = -1.049E-8 A
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-6 中間介質為銅，工作電極側為純去離子水之比色管光電流訊號圖(工作電 極側為去離子水800 μL，逆電極側為 0.1 M 的 KCl 800 μL，均未調酸鹼值)
一個完整迴路的系統，當電性平衡受到破壞時，最後整個系統仍然會回到電性平 衡。所以在比色管光電化學系統中，銅就扮演著一個非常重要的角色，它必須靠 著它的導電特性，使整個系統為一個完整的迴路，也因此系統因 bR 受激發產 生一個正向的電流訊號後，緊接著就是因為光電系統恢復電性平衡的電流下降訊 號，如 Fig. 5-8 所示。
Pt rod ITO glass
PM
在實驗中發現，經過 PM 細胞膜光電流訊號測試的比色管系統，作為中間介質
PM
++ ++ +
- -- -Cu
Cu2+ 2e
-Cu Cu2+ + 2e
-PM KCl
Fig. 5-12 PM 不照光吸收質子時，銅的還原反應
此時兩側的電極仍然會因為水的氧化還原反應，產生氧氣與氫氣，只是與受 光激發時相反，此時在逆電極產生的是氫氣，
2H+ + 2e- H2
而在工作電極產生的是氧氣，
2O2- 2O2 + 4e
-而最後整個系統則恢復成照光前的電中性狀態，如 Fig. 5-13 所示。Table 5-1 則 是將系統的各個部分在開關燈時所發生的變化作一個整理。
PM KCl
A
photocurrent signal
Time Current
(a) (b)
Fig. 5-13 (a) 恢復成電中性的比色管光電系統之電子與離子狀態，(b)光電流訊 號：恢復到水平基線
Table 5-1 比色管系統的各個部分在開關燈時的變化
(a) pH of PM = 6, pH of KCl = 3
0 5 10 15 20 25 30
-5.0x10-6 -4.0x10-6 -3.0x10-6 -2.0x10-6 -1.0x10-6 0.0 1.0x10-6 2.0x10-6 3.0x10-6 4.0x10-6 5.0x10-6
on on
pH of PM = 6, pH of KCl = 3
Current (A)
Time (s)
(b) pH of PM = 6, pH of KCl = 4
0 5 10 15 20 25 30
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
pH of PM = 6, pH of KCl = 4
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-14 (a) 、(b)不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(c) pH of PM = 6, pH of KCl = 5
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
on on
pH of PM = 6, pH of KCl = 5
Current (A)
Time (s)
(d) pH of PM = 6, pH of KCl = 6
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
on on on
pH of PM = 6, pH of KCl = 6
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-15 (c)、(d) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(e) pH of PM = 6, pH of KCl = 7 light-on = 2.154E-6 A light-off = -2.279E-6 A
current = 2.217 A = 2.217 A/cm**2
(g) pH of PM = 6, pH of KCl = 9
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
pH of PM = 6, pH of KCl = 9
Current (A)
Time (s)
(h) pH of PM = 6, pH of KCl = 10
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
on
pH of PM = 6, pH of KCl = 10
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-17 (g)、(h) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(i) pH of PM = 6, pH of KCl = 11
0 10 20 30 40 50
-5.0x10-6 -4.0x10-6 -3.0x10-6 -2.0x10-6 -1.0x10-6 0.0 1.0x10-6 2.0x10-6 3.0x10-6 4.0x10-6 5.0x10-6
pH of PM = 6, pH of KCl = 11
Current (A)
Time (s)
(j) pH of PM = 6, pH of KCl = 12
0 5 10 15 20 25 30
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
pH of PM = 6, pH of KCl = 12
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-18 (i)、(j) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(k) pH of PM = 3, pH of KCl = 7 light-on = 3.328E-6 A light-off = -2.655E-6 A
current = 2.993E-6 A = 2.993E-6 A/cm**2
off on
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-19 (k)、(l) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(m) pH of PM = 5, pH of KCl = 7
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
off on
pH of PM = 5, pH of KCl = 7 light-on = 3.524E-6 A light-off = -3.615E-6 A
current (A) = 3.570E-6 A = 3.570E-6 A/cm**2
Current (A)
Time (s)
(n) pH of PM = 7, pH of KCl = 7
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
pH of PM = 7, pH of KCl = 7
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-20 (m)、(n) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(o) pH of PM = 8, pH of KCl = 7
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
off on
pH of PM = 8, pH of KCl = 7
Current (A)
Time (s)
(p) pH of PM = 9, pH of KCl = 7
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
pH of PM = 9, pH of KCl = 7
off on
off on
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-21 (o)、(p) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(q) pH of PM = 10, pH of KCl = 7
(s) pH of PM = 12, pH of KCl = 7
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
off off
on on
pH of PM = 12, pH of KCl = 7
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-23 (s) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
而在實驗中也發現於酸性環境下的 PM，其光電流訊號的方向並沒有與在中 性環境下時相反，此與文獻所記載的有所不同。推測可能因為本文所設計的光電 系統對溶液中的離子游動非常敏感，且研究中所用的酸性溶液中本已存在相當多 的質子，其受到光子的擾動時也會有相對的電流產生，繼而影響真正 bR 推出 質子的光電訊號，而使系統無法反應出 bR 真正的光電訊號。然其確切的影響 則有待更多的資訊及實驗結果來說明。
第二組不同酸鹼值的實驗則是包括 3 個 PM 溶液的酸鹼值，5 個電解液的 酸鹼值，共有 15 組光電流訊號，而只有當 PM 之酸鹼值為 6，電解液之酸鹼 值為 8 時，有穩定且完整的光電流訊號。
第三組不同酸鹼值的實驗則是包括 3 個 PM 溶液的酸鹼值，3 個電解液的 酸鹼值，共有 9 組光電流訊號，而只有當 PM 之酸鹼值為 6，電解液之酸鹼值 為 7 時，有穩定且完整的光電流訊號。
(a) pH of PM = 6, pH of KCl = 5
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 6) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 5) light-on = -3.399E-9 A
light-off = -1.764E-8 A current = 7.121E-9 A/cm**2
off
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 6) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 6) light-on = -1.397E-8 A
light-off = -6.714E-9 A current = 3.628E-9 A/cm**2
off
on
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-24 (a)、(b) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(c) pH of PM = 6, pH of KCl = 7
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 6) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 7) light-on = 2.660E-6 A
on on
Current (A)
Time (s)
(d) pH of PM = 6, pH of KCl = 8
0 5 10 15 20 25 30 35
-4.0x10-6 -2.0x10-6 0.0 2.0x10-6 4.0x10-6
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 6) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 8) light-on = 2.652E-6 A
light-off = -2.132E-6 A current = 2.392E-6 A/cm**2
off on
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-25 (c)、(d) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(e) pH of PM = 6, pH of KCl = 9
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 6) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 9) light-on = 2.840E-6 A
light-off = -2.059E-6 A current = 2.45E-6 A/cm**2
off
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 7) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 5) light-on = -2.716E-6 A
light-off = 2.454E-6 A current = 2.585E-6 A/cm**2
off
(g) pH of PM = 7, pH of KCl = 6
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 7) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 6) light-on = -2.520E-6 A
light-off = 2.353E-6 A current = 2.437E-6 A/cm**2
off
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 7) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 7) light-on = -2.116E-6 A
light-off = 2.108E-6 A current = 2.112E-6 A/cm**2 off
on
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-27 (g)、(h) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號
(i) pH of PM = 7, pH of KCl = 8
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 7) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 8) light-on = -2.132E-6 A
on on
cuvette system, green filter, 120 W Xenon light working-ITO-1000 ul PM (5 mg/mL, pH = 7) counter-Pt-1000 ul KCl (0.05 M, pH = 9) light-on = -2.481E-6 A
on
Current (A)
Time (s)
Fig. 5-28 (i)、(j) 不同酸鹼值之 PM 與電解液之光電訊號