文獻探討

前言

Endonuclease G (EndoG) 是一種細胞凋亡時所必需的核酸水解酶，在細胞 凋亡發生時會參與細胞核中DNA 的片斷化切割 (fragmentation) 。EndoG 已經 被證實可能在細胞凋亡的過程當中扮演關鍵角色。EndoG 最早被提出它可能參 (Caenorhabditis elegans, C. elegans) 的細胞凋亡是非常重要的。Li 等 (2001)，

藉著將粒線體當中的蛋白質逐層的分離出來及偵測細胞組成的每一個位置，也 發現當 EndoG 從粒線體被釋放出來後會造成細胞凋亡的核酸水解酶。在 2003 年Zhang 等，從 EndoG 基因剔除老鼠的細胞中發現，這些細胞對於人為誘發的 細胞凋亡會產生抗性，並且發現homozygous EndoG 基因剔除的老鼠在胚胎早 期時就無法存活下來。根據這個結果，他們提出一個結論，EndoG 是老鼠胚胎

EndoG 有許多的生物性功能及在細胞中的影響，然而這些活體的試驗存在著許 多的矛盾，而這些功能及影響仍需更進一步的研究才能證實。所以在本論文的 研究中將利用EndoG 的結構及功能，試著重新詮釋 EndoG 在生物體內所扮演 的角色。

第一節 Endo G 的簡介

EndoG 是一種屬於 DNA/RNA 非專一性的核酸水解酶，凡是核酸類如雙股 DNA、單股 DNA、單股 RNA、RNA．DNA 的複合物等，都可被其所催化水解 (Gerschenson et al., 1995; Widlak et al., 2001) 。類似這樣的蛋白質在許多物種，

如細菌、黴菌、無脊椎動物以及脊椎動物等生物體都有發現它的蹤跡。而哺乳 類生體內的EndoG 分子量大約是 33 kDa，在 N 端包含一段 48 個胺基酸序列，

會引領EndoG 到粒線體儲存的引領序列 (Mitochondria leader sequence) (Tiranti et al., 1995) 。而經過修飾過去除 N 端 48 個胺基酸序列的成熟型 EndoG 會儲存 在粒線體裡，並且始具有水解核酸的活性。

EndoG 的生化功能

1987 年首先由 Ruiz-Carrillo 等，從未成熟的雞紅血球細胞核中分離出一種 具內切酶活性，而且會選擇性的切割在DNA 的 d(G)n × d(C)n 序列上，因此將 這個內切酶命名為 Endonuclease G。他們分析出 EndoG 最喜好受質 d(G)n × d(C)n 序列的 n 值大於或等於 9，其切割行為很類似於第二型及第三型限制酶。

更進一步，他們分析出 EndoG 在 G-strand 造成裂口(nick)的比率比在 C-strand 高出4 到 10 倍。由此結果，他們推測 EndoG 在切割雙股 DNA 的時候，會先吸 附到喜好的那一股，進而藉著鎂離子或錳離子造成 DNA 斷列並形成 5’端的磷 酸單酯末端 (phosphomonoester ends) ，因此他們推論 EndoG 可能參與 DNA 重組的過程。接著，1989 年，同一個研究團隊從牛的胸腺組織細胞核當中，分 離出EndoG 並且很明確的在 SDS-PAGE 上觀察到變性的 EndoG 約 26 kDa 的分 子量，然而利用膠體過濾法 (gel filtration) 卻得到 50 kDa 的未變性 (native) EndoG，因此推論 EndoG 是以雙體的形式存在於細胞內的。1993 年時 Cote 等，

EndoG 在 N 端具有一段會引領到粒線體儲存的 48 個胺基酸序列

(mitochondria leader sequence) 。因此，他們將先前 Ruiz-Carrilloz 提出 EndoG 可 能參與DNA 重組過程的推論及假說，應用在他們從 EndoG 在試管中切割粒線 體DNA 所觀察到的現象上，並提出一個假說，EndoG 可以在粒線體 DNA 複製 的時候幫助 primer 的形成。直到 2001 年，Parrish 等，利用 si-RNA (small interfering RNA) 的方式，抑制線蟲身上的 EndoG 表現，發現線蟲在細胞凋亡 時不容易產生DNA 的片段化 (DNA degradation) ，此結果顯示 EndoG 可能牽 涉到細胞凋亡的進程。

EndoG 基因在體內扮演的功能

人類EndoG 基因座落染色體 9q34.1 的位置，很奇特的 EndoG 的 exon3 剛 好與反向轉錄的C9orf114 (小鼠 D2Wsu81e) 基因 exon3 重疊，因此在 2003 年 Zhang 等，將 EndoG 基因及一部份 D2Wsu81e 基因剔除後，從老鼠的細胞中發 現，這些細胞對於人為誘發的細胞凋亡會產生抗性，並且發現 homozygous EndoG 基因剔除的老鼠在胚胎早期時就無法存活下來。根據這個結果，他們提 出一個結論，EndoG 是老鼠胚胎早期發育及細胞凋亡時所必需的蛋白質。然 而，這樣的基因剔除的設計並沒有受到後來其它學者的研究所認同。在 2005 年時，Irvine 等，精準而且很專一的剔除老鼠染色體上的 EndoG exon 2，發現 這些缺乏EndoG 的老鼠皆與正常老鼠相同。更進一步，從這些老鼠的細胞中並 沒有觀察到會影響細胞凋亡。2006 年 David 等，改進 Irvine 等的 EndoG 剔除法，

更進一步的也將少部份的EndoG exon3 也剔除，而且不影響到 D2Wsu81e 基因 的表現，他們的結論與Irvine 等不謀而合，EndoG 在胚胎早期發育及細胞凋亡 時並不是必需的。這些矛盾的結果，使得EndoG 在生物體內扮演的功能更顯得 有趣。

第二節 人類 EndoG 的蛋白質結構

人類EndoG 全長由 297 個胺基酸所組成，分子量約 33 kDa。先前有以牛 (bovine) EndoG 為研究的報告 (Schafer et al., 2004) ，將牛 EndoG 與許多物種 DNA/RNA 非 專 一 核 酸 水 解 酶 的 胺 基 酸 做 多 重 線 性 比 對 (multiple alignment) ，及同源性結構模擬 (homology modeling) ，他們根據這些生物資 訊所得的結果推測，牛 EndoG 是屬於 ββα-Me-finger 超家族 (superfamily) 的 核酸水解酶。而且在這個研究當中，經二級、三級蛋白質結構模擬，以Serratia nuclease 與牛 EndoG 最為相似，在執行功能時，並且存在著雙體結構。牛 EndoG 執行功能的主要胺基酸為histidine-143，對應到人類 EndoG 為 histidine-141。

ββα-Me-finger 家族蛋白質

Ghosh等，將不同功能但是具相似的催化中心的ββα-Me-finger核酸水解酶，

區分為五大類 (Ghosh et al., 2005) ：

(1) Sugar non-specific nuclease：Serratia nuclease、NucA以及EndoG。

(2) Non-specific DNase：ColE7、ColE9、Vvn nuclease 以及 CAD/DFF40。

(3) Structure-specific nuclease：T4endoVⅡ。

(4) TypeII restriction endonuclease：KpnI及McrA。

(5) Homing endonuclease：I-PpoI 及 I-HmuI。

屬於這五類的ββα-Me-finger 核酸水解酶蛋白質，根據蛋白質結晶的文獻歸納，

通常它們會提供一個到兩個的鎂離子配體 (Mg²⁺ ligand) ，例如 Serratia nuclease 的 Asn119、 NucA 的 Asn155、 ColE7 的 His544 及 His569 、 ColE9的 His102 及 His127、 Vvn nuclease 的 Glu79 及 Asn127、CAD/ DFF40 的Asp262 及 His308 、 T4 endoVII 的 Asp40 及Asn62 、 I-PpoI 的 Asn119 以及 I-HmuI 的 Asp74 及 Asn96。而目前沒有結晶，但是已有以蛋白質結構模擬及生化試驗

的 報 告 指 出 在ββα-Me-finger核酸水解酶上面的Mg²⁺ ligand，如牛EndoG 的 Asn174 與 KpnI 的 Asp148 及 Gln175。

H-N-H 結構之核酸水解酶

H-N-H motif 最 早 從 一 些 噬 菌 體 及 細 菌 裡 的 intron-encoded homing endonuclease蛋白質胺基酸序列的比對中被發現到的高度保留位置 (Gorbalenya, 1994; Shub et al., 1994) 。目前為止，從噬菌體、細菌到人類，約有大於200多個 蛋白質被現具有H-N-H motif，並且被歸納為H-N-H家族 (Hsia et al., 2004) 。許 多 的H-N-H 蛋 白 質 ， 像 是 具 有 限 制 酶 專 一 性 的 group I 或 groupⅡ homing endonuclease，這些蛋白質可以切下染色體上的一小段DNA，並著著轉送的其它 細胞內蛋白質將這段DNA轉送到對偶基因缺失這段DNA的地方 (Chevalier and Stoddard, 2001; Lambowitz and Belfort, 1993) 。 目 前 也 發 現 許 多 DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶具有H-N-H motif，如ColE7、ColE9 (Hsia et al., 2004) 、apoptotic DNase CAD等。H-N-H motif 通常伴隨著ββα-metal的結構 的 存 在 如 nonspecific Serratia nuclease (Miller et al., 1994) 以 及 Holliday junction-specific phage T4 endonuclease VII (Raaijmakers et al., 1999) ，而且這些伴 隨著ββα-metal結構的H-N-H motif通常也是它們的催化受質的核心。另外，本研 究也在EndoG蛋白質上也有發現類似這樣的一個結構。

第三節 EndoG 的研究及展望

細胞在經過一些如鎘Cd或Galectin-1的物質處理後，EndoG可藉由從粒線體 釋放到細胞核使染色體DNA片斷化達到細胞凋亡的效果 (Lemarie et al., 2004;

Hahn et al., 2004) 。因此EndoG不但可以成為一個細胞凋亡偵測的標的，也可以 nuclease (Miller et al., 1994)，DNA的結合如Vvn (Li et al., 2003) ，鎂離子主要的 ligand是N174 (人類 N172) 。然而，並沒有很直接的證據支持這些假說(Schafer et al., 2004)。所以，如能找尋更直接有力的方法探討人類EndoG如何與受質接合、

如何水解受質、如何與輔因子結合等完整的研究，也許能提供EndoG在細胞中諸 多功能的紛爭及其所扮演的角色有更好的解釋。

DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶的結晶

由於DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶很難尋找到一段與該酵素結合很專 一的核酸序列，所以要很直接的探討DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶是如何與 受質交互作用的機制是不容易的。也因此，要在實驗中取得這類酵素的共結晶更 是困難。如今已有結晶的DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶有Staphylococcal nuclease (Arnone et al., 1971) 、Serratia nuclease (Miller et al., 1994) 、Vvn (Vibrio Vulnificus nuclease ) (Li et al., 2003)、P1 nuclease (Volbeda et al., 1991) 、Nuclease A (Ghosh et al., 2005) 以及ColE7的核酸水解功能區段 (Cheng et al., 2002) 等。而 目前只有Vvn與ColE7及ColE9有與雙股DNA的共結晶被以X-ray繞射解讀出來。

然而這些結晶結果只能在數據上做分析及推論，詳細分子間的交互作用還是需由 分生實驗來證實，可見得要解開一個DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶的結構跟 功能需要很長期及深入的研究，尤其是在哺乳類生物體內的這類蛋白質。

DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶所扮演的角色

在原核生物體的DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶，例如從細菌中發現的 Serratia nuclease、Staphylcoccal nuclease、P1 nuclease 等，這些核酸水解酶可以

幫助細菌本體水解外來的核酸並提供本身所需的養份。除此之外，有些細菌像是 霍亂弧菌 (Vibrio cholerae) 更利用這類的蛋白質來幫助它感染到宿主 (Focareta and Manning, 1991) 。而在真核生物體的DNA/RNA-nonspecific 核酸水解酶例如 在酵母菌中的 Rad52 以及 Nuc1等核酸水解酶，可以參與DNA的修補以及DNA 的重組 (Alani et al., 1990) 。而哺乳類生物粒線體裡的EndoG目前仍然有許多的 爭議，雖然如此，但從文獻中不難發現，許多報告都在細胞凋亡的時候偵測到 EndoG的參與。

EndoG 在生物體內功能的不確定性

最早提出 EndoG 在生物體內確切的功能是在 2001 年 Li 等，利用 si-RNA (small interfering RNA) 的方式，將 EndoG 從線蟲身上剔除，發現會影響線蟲的 細胞凋亡。然而從2003 年至 2005 年陸續的有三個研究團隊，利用基因組重組 的方式剔除老鼠染色體上的EndoG (Zhang et al., 2003; Irvine et al., 2005; David et al., 2006)。然而卻得到兩種截然不同且矛盾的結果。EndoG 是老鼠胚胎早期 發育及細胞凋亡時所必需的蛋白質? 或者與兩者功能相關性不大？ 而另一個 問題是當EndoG 形成後會儲存在粒線體的哪個部位？ 是儲存在 intermembrane space (Ohsato et al., 2002) 或者是鑲鉗在 innermembrane 上及 matrix 裡(David et

al., 2005) ？這些疑問都有待更具體的研究來解答。

EndoG 基礎結構研究的缺乏

自從人類EndoG 在2001年首次從HeLa細胞中被純化出來 (Widlak et al., 2001) ，在EndoG的許多研究方面，大都展開以生物性功能為主，這對於EndoG 在生物體功能提供了不可抹滅的貢獻，並且也提供了相當大的討論空間。因此本 論文的研究設計將重新回到探討EndoG結構，利用生物資訊學試著將EndoG胺基 酸序列完整的分析，並搭配定點突變的方式，對EndoG切割DNA、酵素動力學、

輔因子的結合做完整的分析，藉著此基礎研究輔助EndoG在生物體功能的探勘。