討論

在本章節中證實了人類 EndoG 的基因利用大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS 表現 系統，所表現出來的蛋白質，經純化及變性到再折疊復性的過程是可行的，並分 析到 EndoG 蛋白的生化特性及切割 DNA 的行為。但是以這些來源進行 EndoG 的酵素分析，必須經過繁鎖的純化步驟，而且所回收的大腸桿菌表現可溶蛋白質 的比例偏低。為了解決這些問題，我們嘗試利用大腸桿菌表現與六個histidine 融 合的人類EndoG，再自不可溶的部份，純化 EndoG。將 pET-DNase 表現載體送 入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS 後，因這株細菌含有 T7 溶解酵素基因，因此有利

EndoG。因為這樣純化出來的人類 EndoG 具有與從真核生物體 EndoG 有相似的 打開，又剛好EndoG在水解單股DNA的活性上又比雙股DNA強許多 (Ikeda and Ozaki, 1997) ，因此 pH值少許影響到EndoG的活性，但受質結構的改變使得 EndoG水解DNA活性在 pH等於9時比 pH等於8的時候好。EndoG偏好在中性的 環境下作用，而且需要鎂離子其最進濃度0.5 mM，而鈉離子不能取代鎂離子。

目前大部份的核酸分解酵素都需要二價金屬離子作為輔因子，以執行酵素的功 能。EndoG是在低濃度的鈉離子及鉀離子時有最佳的催化條件，當鉀離子濃度高 於20 mM時EndoG活性即很明顯的被抑制住。在同樣是扮演細胞凋亡因子DNA fragmentation factor (DFF) ，其活性展現在鈉或鉀離子環境中有很大的範圍，從 50 mM到150 mM之間都可以有最佳活性 (Widlak et al., 2001) 。然而正常存活的 個胺基酸序列(Tiranti et al.,1995) 。這類帶有Mitochondria leader sequence (MLS) 的前驅蛋白質，其N端通常會由許多帶正電荷的胺基酸所組成，經由在細胞質中 最為重要的伴隨蛋白 (chaperones) heat-shock protein 70 (cHsp70) 及粒線體轉運

刺激因子將帶有MLS的前驅蛋白質運送到粒線體外膜 (outermembrane) 並由 Tom 複合體 (Tom complex) 做辨識轉運進去intermembrane space，若是要儲存到 粒線體的基質 (matrix) 當中，則需再經過粒線體內膜 (innermembrane) Tim複合 體(Tim complex)的轉運後，接著經由粒線體蛋白水解酶 (mitochondrial processing peptidase (MPP) 將前驅蛋白質的MLS切除後，再透過Hsp60及cpn10 (Chaperonin 10) 幫助折疊成具有功能的蛋白質並儲存在該位置 (Hood et al., 2003) 。EndoG 先前被認為會從細胞質轉送到intermembrane space儲存 (Ohsato et al., 2002) ，另 一個研究團隊則認為是少部份鑲嵌在innermembrane上及大量存在matrix當中 (David et al., 2005) 。本篇的研究，主要是探討EndoG在斷開N端的MLS後的功 能。全長的EndoG(1)似乎還具水解核酸的功能，但依照粒線體的轉運蛋白質過 程，EndoG(1) 應該是沒有完整的folding，根據此結果本研究推論N端的MLS 48 個胺基酸會影響到EndoG結構跟功能活性。

pET-28a(+)

endoG cDNA 6His tag

BL21(DE3)pLysS + IPTG

6His tag-EndoG

pET-28a(+) pET-28a(+)

endoG cDNA 6His tag

BL21(DE3)pLysS + IPTG

6His tag-EndoG

(A)

(B)

圖2-1 SDS-PAGE 分析大腸桿菌表現及純化的人類 EndoG。(A) EndoG 表現載 體架構及產物示意圖。(B) 將含有 pET-EndoG(49) 野生株的大腸桿菌不經 (Lane 2) 及經 (Lane 3) IPTG 誘導的粗萃取液及純化後 (Lane 4) 的人類 EndoG 野生 株，命名為EndoG(49)，利用 SDS-PAGE 分析後，再以 Coomassie Brilliant Blue 染 色。蛋白質標誌 (Lane 1) 的分子量 (單位為 kDa) 標示在左邊，33 kDa 的表現 蛋白質以箭頭標示在右邊。

(A)

(B)

(C)

圖2-2 人類 EndoG 的生化特性。以上的每個試管反應包含 0.1 pmol EndoG(49) 及0.1 μg pUC18 雙股 DNA 在 37 ℃ 下反應 2 分鐘 (A) pH 值對酵素活性的影 響。下列緩衝液被用來維持適當的pH 值：BES (pH 3.0)、醋酸(acetic acid, pH 5.0)、

磷酸 (sodium phosphate, pH 6.0)、Tris (pH 7.0、8.0、9.0) 及 3-(cyclohexylamino)-1 -propanesulfonic acid (pH 10)。(B) 兩價鎂離子對酵素活性的影響。(C) 單價鉀離 子對酵素活性的影響。Lane1~8 受質為經 EcoRI 限制酶處理過的線形 pUC18，

Lane9~16 受質為環形 pUC18。

sec

圖2-3 重組人類 EndoG 的切割模式。 (A) 以不同時間點觀察 EndoG 的切割行 為。每個試管包含0.01 pmol EndoG、0.1 μg pUC18 雙股 DNA 在最佳的緩衝液 中下37 ℃反應，時間分別為 0、10、30、60、300、600 秒。 (B) 以不同濃度的 EndoG 觀察其切割行為。每個試管包含 0.1 μg pUC18 雙股 DNA 在最佳的緩衝 液中下37 ℃反應 2 分鐘，濃度分別為 0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 pmol。

Lane 1 及 Lane 8 為 DNA 標誌的左邊為長度單位 kb，Lane 2 ~ Lane7 的受質為經 EcoRI 限制酶處理過的線形 pUC18；Lane 9 ~ Lane14 為受質為環形 pUC18。右邊 OC 代表 open circular；L 代表 linear； SC 代表 supercoiled。

(A)

(B)

圖2-4 人類前趨 EndoG、缺損株、成熟株之架構與表現純化。 (A) EndoG 缺損 株的架構。最上面的 EndoG(1) 表示為全長完整的 EndoG 結構，EndoG(37)則是 隨機裁剪N 端 1~36 個胺基酸的缺損株，EndoG(49) 為裁剪 N 端 1~48 個胺基酸 的野生株EndoG (B) 將各別大腸桿菌的粗萃取液經純化步驟後，利用 SDS-PAGE 分析後，再以Coomassie Brilliant Blue 染色。蛋白質標誌 (Lane 1) 的分子量 (單 位為kDa)，Lane 2 為純化後全長 EndoG(1)，Lane 3 為缺損株 EndoG(37)，Lane 4 為野生株 EndoG(49)。

圖2-5 重組人類前趨 EndoG、缺損株、成熟株的切割活性比較。以固定濃度 0.1 pmol 酵素，以 0.1 μg pUC18 雙股 DNA 為受質，在適當的緩衝液中反應 37 ℃5 分鐘。Lane 1 及 Lane 5 為不含酵素的對照組，Lane 2 ~ Lane4 的受質為經 EcoRI 限制酶處理過的線形pUC18；Lane 6 ~ Lane8 的受質為環形 pUC18。右邊 OC 代 表open circular；L 代表 linear； SC 代表 supercoiled。