材料與方法

EndoG 與缺損株 cDNA 之選殖及表現載體之架構與製備

將 HeLa 細 胞 溶 裂 後 ， 利 用 酸 性 guanidinium-phenol-chloroform 方 法 (Chomczynski et al.,1987) 抽取其全部RNA。接著將全部的RNA以反轉錄酶 (SuperScript^TMⅢ, invitrogen, Carlsbad, CA, USA)及P2 (5′-CGGGATCCGCCGA GTTGCCCCCTGTGCC-3′) 、 M1 (5′-CGGAATTCTCACTTACTGCCCGCCGTG ATGG-3′) 為引子，做 35 個循環後得到的產物為 902 bp長度的全長EndoG cDNA。將 902 bp全長的EndoG cDNA經過BamHI及EcoRI處理後，轉架接到帶有 histidine-tagged的pet-28c(+) (Novagen, Madison, WI, USA) 表現載體上，完成 pet-EndoG(1)全長EndoG表現載體。接著為了架構成熟型的EndoG，我們利用已 架 構 好 的pet-EndoG(1) 為 模 板 股 ， 以 P1 (5′-CGGGATCCTGGGCCGGCTGC CCGTGC-3′) 及 M1、P3 (5′-CGGGATCCGCCGAGTTGCCCCCTGTGCC-3′) 及 M1 為引子做聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)，分別得到 791 bp 及755 bp兩種片段的產物，接著架接到pet-28a(+)中的BamHI及EcoRI切位上，各 自形成pET-EndoG(37) (Δ1-36) 及pET-EndoG(49) (Δ1-48) 兩個缺損株。之後，每 一個架構出來的表現載體利用大腸桿菌增殖後，皆需經過核苷酸定序確認。

EndoG表現的最佳O.D值

取已選殖到的 EndoG 表現載體 pET/EndoG 1 μl 加入 40 μl 的勝任細胞 (competent cell) 利用電穿孔 (electroporation，電容 25 μF、電壓 1.25 kV、電阻 480 Ω) 的 方 式 轉 形 (transformation) 至 勝 任 細 胞 ， 此 細 胞 為 大 腸 桿 菌 BL21(DE3)pLysS，再加入 1 ml 的 SOB Medium，於 37 ℃以 200 rpm 振盪培養一 小時，最後將菌液塗在含有 0.03 μM kanamycin 的培養基中，在 37 ℃培養 16 小 時 後 觀 察 有 無 菌 落 出 現 。 挑 取 此 株 大 腸 桿 菌 單 一 菌 落 ， 接 種 到 2 ml

Luria-Bertani (LB) 含 0.03 μM kanamycin 培養液中經 37 ℃，250 rpm 震盪培養隔 夜後，以1：50 的比例接種到 5 ml 含 kanamycin 的 LB 培養液中，置於 37 ℃，

250 rpm 震盪，在培養後 30 分鐘開始第一次取樣，每隔 10 分鐘取樣一次，直至 到 第 120 分 鐘 ， 樣 品 在 可 見 波 長 600 nm 測其 OD； 每 次 取 樣 完 並 加 入 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 至最終濃度為 0.5 mM，再振盪培養 3 小時。因此株大腸桿菌內帶有一個嵌在染色體上的T7 RNA 聚合酵素基因，其表 現受到lac operator 控制，因此可用 IPTC 誘導 T7 RNA 聚合酵素表現，進而轉 錄 pET 質體上所帶的基因，大量產生異源蛋白質。最後將細菌離心收集下來，

以 10 % SDS-聚丙烯醯膠體電泳 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis；

SDS-PAGE) 分析。

將已選殖到的全長EndoG(1) 及缺損株 EndoG(37)與 EndoG(49)之 cDNA 分

別架接在pET-28a(+)及 pET-28c(+) 上的 BamHI 與 EcoRI 限制酶切位上。接著再 將此已構築好之表現載體利用電穿孔的方式轉型 (transform) 到

BL21(DE3)pLysS 大腸桿菌並做篩選。將篩選到含有 pET-EndoG 載體的大腸桿 菌，接種至5 ml 含 0.03 μM kanamycin 的 LB 培養液中經 37 ℃，250 rpm 震盪培 Tris-HCl [pH 8.0] , 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM phenylmethylsulfonylfluoride) 中，在冰上作用 20 分鐘後，進行一次冷凍解凍 (-70

℃~37 ℃)，再利用超音波震盪處理，接著以 15000 rpm 離心 10 分鐘。去上清液 後，將沉澱物懸浮於含1 % (v/v) Triton X-100 的 lysis buffer 中，置於冰上 15 分 鐘，再以15000 rpm 離心 10 分鐘，把沉澱物懸浮於含 8 M 尿素的 binding buffer (5 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 8.0]) 中，於室溫下緩慢混合 2 小時。最後以15000 rpm 離心 10 分鐘後，收集上清液並利用鎳親合性色層分析 法 (nickel-affinity chromatography) 將帶有 6 個組胺酸標記的 EndoG 蛋白質純化 出來，再以10 % SDS-PAGE 檢測蛋白質純度。

0.1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 0.5 M NaCl , 4 M urea) ， renaturing buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM PMSF, 0.5 M NaCl) ，renaturing buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM PMSF，15 % (v/v) glycerol) ，renaturing buffer E (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM PMSF,25 % (v/v) glycerol) ，最後在storage buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 20 % (v/v) glycerol，0.2 % (v/v) NP-40) 。經過兩次storage buffer透析後，將EndoG蛋白分裝保存於-70 ℃。

EndoG核酸水解酶活性的測定

取1 μl先前已完成再折疊的EndoG，以 0.1 μg 環形超螺旋的pUC18 DNA 為 受質，混合在 EndoG buffer (20 mM Tris/HCl [pH 7.5]/0.5 mM MgCl2/0.5 mM DTT) 並且在 37 °C 的條件下反應 5 分鐘。最後再利用以 1.2 ％ TAE agarose gel (40 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA) 進行電泳，電泳結束後將膠片置於EtBr中染色，再 以紫外光照像並觀察分析之。