摘要
本章主要是進行人類EndoG 功能區及活化中心的研究。利用化學修飾作用，
探討 histidine 是否參與 EndoG 的活性。由 EndoG 水解核酸分析，發現 diethyl pyrocarbonate (DEPC)不活化的 EndoG 在水解核酸的活性依 DEPC 的濃度上升而 下降，然而藉由hydroxylamine 的處理 EndoG 的活性又回復。這些結果顯示 DEPC 不活化EndoG 的作用是因 histidine 被修飾所造成的。因此，histidine 對於 EndoG 活性，顯然具有決定性的影響力。為了證實這一點，進行人類 EndoG 氨基酸序 列的比較，利用人類 EndoG 蛋白質胺基酸序列與另外其它六個物種分別是牛、
小鼠、大鼠、線蟲、S. cerevisiae 酵母菌、S. pombe 酵母菌之 EndoG 線性比對的 結果，發現EndoG 在各物種有一 DRGH 高度保留的序列。而這個 DRGH 高保留 區的氨基酸histidine 位在人類 EndoG 的第 141 個胺基酸。因此，利用定點突變，
將histidine 轉換為 alanine，並探討其在 EndoG 中是否為主要的活性胺基酸。接 著在取得一系列的arginine 、asparagine、及 histidine 的 EndoG 點突變株後，利 用酵素動力學的方式計算得到其 Km 及 Kcat 等參數以探討這些胺基酸對於 sequence 切割試驗，結果發現 H141A、N163A、N172A 對於 EndoG 活性有嚴重 影響，因此推論EndoG 可歸類於 H-N-H 核酸水解酶的一種。
第一節 緒言
Human EndoG 的 mRNA、cDNA 及胺基酸在 NCBI 所發表序列 X79444 (Tiranti et al., 1995) ，經過比對在已被發表 EndoG 的許多 mRNA 及 cDNA，發 現X79444 這組序列具有核苷酸的點突變，造成 EndoG 第 163 的胺基酸存在 lysine 及 asparagine 兩種胺基酸，更進一步在，我們以定點突變分析這兩種 EndoG 發 現活性上N163 遠大於 K163 的 EndoG。這表示著，如果真實存在這兩種不同的 type EndoG 的細胞，在進行 EndoG apoptosis pathway 路徑時或執行其功能時會受 到嚴重影響。所以我們從許多來自human 不同的 cell line 中抽取 genomic DNA，
設計primer 經 PCR 取得 EndoG exo1 這個片段的 DNA，並利用限制酶來檢驗。
在 2004 年 Schäfer 等，已對牛 EndoG 的功能及結構提出了一些推測及看法 (Schäfer et al., 2004) 。基於對牛 EndoG 結構的模擬及 DNA/RNA-non-specific nuclease 的胺基酸線性比對，他們推測牛 EndoG 是屬於 ββα-Me-Finger 核酸水 論EndoG 存在著 ββα-Me-Finger 這個結構，並且與 H-N-H-superfamily 的核酸水 解酶有相同的生化及序列特性。
在輔因子鎂離子的研究方面，Schäfer 等，認為牛EndoG 的第 174 個 asparagine為主要跟鎂離子交互作用的胺基酸，線性比對的結果對應到人類 EndoG第 172 個胺基酸asparagine。為了更明確的分析哪些胺基酸參與鎂離子的 結合作用，利用protein data bank蛋白質結晶資料庫 (http://www.rcsb.org) ，將 EndoG與其它具有結晶的ββα-Me-Finger交集H-N-H motif的蛋白質做模擬比對，
發現與人類EndoG最為相似的是NucA (1ZM8) (Ghosh et al., 2005) 。在這個結構 當中，NucA 第 249 個胺基酸glutamate發現其第二個鎂離子結合位(Ghosh et al., 2005)，另外在人的EndoG以NucA的模擬結構及序列比對當中，發現EndoG 第 271 個胺基酸glutamate與NucA的第 249 個胺基酸glutamate吻合。利用定點突變及 鎂離子需求的試驗，證實了人類EndoG 的E271 是第二個鎂離子結合位。
第二節 材料與方法
多重胺基酸序列排序 (Multiple Alignment)
進 入 國 家 衛 生 研 究 院 網 頁 之 GCG (Genetics Computer Group) 資 料 庫 (http://bioinfo.nhri.org.tw/gcg/) ，將EndoG之胺基酸序列與另外其它六個物種分 別是牛、小鼠、大鼠、線蟲、S. cerevisiae酵母菌、S. pombe酵母菌之EndoG相似 蛋白質胺基酸序列進行線性比對。
利用焦碳酸二乙酯 （diethyl pyrocarbonate；DEPC） 進行人類 EndoG 的化學 性修飾及利用hydroxylamine 進行修飾後氨基酸的回復
在反應液pH 值為 6.0 時，DEPC 通常會選擇性的修飾 histidine，少部份也有 可能會對tyrosine 進行修飾作用，但是只有被修飾的 histidine 可被 hydroxylamine 還原。將含有0.2 pmole 純化後的 EndoG、50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0)及不同 DEPC 濃度的 100 μl 反應液，在 25 ℃作用 5、10、15 及 30 分鐘後，
加入1 μl 的 0.1 M imidazole (pH 6.0)中止反應。最後，經 DEPC 處理的 EndoG 利 用活性測定，判定其被DEPC 不活化的程度。在 hydroxylamine 回復實驗中，將 上述利用DEPC 處理後的 EndoG，以 imidazole 中止反應後，加入 hydroxylamine 至最終濃度為20 mM，反應物於 4 ℃下作用五小時。最後測定 EndoG 的活性，
以判定EndoG 活性回復的程度。反應中所使用的 DEPC 必須新鮮以絕對酒精配 製，而且所加入的DEPC 體積不得超過總反應液體積的 2.5 ﹪。
含尿嘧啶單股DNA 的製備
首先將phagmid pET-EndoG送入大腸桿菌CJ236 株中。大腸桿菌CJ236 的染 色 體 中 不 含dut 及 ung 基 因 ( 這 兩 個 基 因 分 別 可 以 表 現 dUTPase 及 uracil N-glycosylase) ，如此一方面導致細菌內dUTP的濃度增加，另一方面導致在DNA
複製中即使插入尿嘧啶鹽基，也不會被uracil N-glycosylase修補成胸腺嘧啶，因 此，在這株細菌中所萃取到的質體DNA，通常含有大量的尿嘧啶。將含pET-EndoG 的大腸桿菌CJ236，接種在 5 ml含 30 μg/ml kanamycin及 10 μg/ml choramphenicol 的LB培養液中，於 37 ℃下振盪培養隔夜。之後，以 1：50 的比例，將隔夜培養 的菌液接種在 50ml含kanamycin的LB培養液中，也是以振盪的方式，培養在 37
℃。當培養液的OD600到達0.3 時，加入 20 m.o.i的helper phage M13KO7，繼續培 養八小時。培養液以17,000 g於 4 ℃中離心五分鐘後，將含有transducing particles 的上清液收集起來，加入10 μg/ml RNaseA、10 U/ml DNaseI及 2 mM MgCl2，於 25 ℃中作用 30 分鐘。之後，加入 1/4 上清液體積的 3.5 M ammonium acetate / 20
% PEG-6000, 於冰上作用 30 分鐘，再以 17,000 g於 4 ℃中離心十五分鐘，以沉 澱transducing particles。將沉澱物懸浮在 200 μl的高鹽緩衝液 (0.3 M NaCl，0.1 M Tris-HCl [ pH 8.0]，1 mM EDTA) ，放置在冰上 30 分鐘，以 12,000 g離心兩分鐘 中，因ung 基因產物 uracil N-glycosylase 可以辨認在 DNA 上的尿嘧啶，將尿嘧 啶去除，如此一來，在 DNA 複製時，原先充作模版的含尿嘧啶 DNA 會因尿嘧 啶的去除，而被分解成小片段，只有新合成的互補股DNA 可以在細菌中順利進 行複製。定點突變的步驟如下：將含0.3 pmol 含尿嘧啶的單股 DNA、6 pmol 已
先經5'端磷酸反應的突變引子、20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2 mM MgCl2 及 50 mM NaCl 的 10 μl 黏合反應液，加熱到 95 ℃ 1分鐘後，以每分鐘降1 ℃的速度，緩 慢降到25 ℃。之後依序加入 4 μl 的 10 倍合成緩衝液 (4 mM dNTPs，175 mM Tris-HCl [pH 8.0]，37.5 mM MgCl2，5 mM DTT，7.5 mM ATP) 、3 U 的 T4 DNA 接合酵素、1 U 的 T4 DNA 聚合酵素及 22 μl 的 DDW，進行第二股 DNA 的合成。
第二股DNA 合成的反應條件為：冰上五分鐘；25 ℃五分鐘；37 90℃ 分鐘。反 應結束後的突變雙股 DNA 送入大腸桿菌 NM522 株中，所得的菌落進一步抽取 增殖的質體，並以引子上設計的限制酶切位，以特定的限制酶切割質體 DNA，
篩選突變株。
EndoG 點突變株蛋白的表現及純化
將構築好的表現質體送入大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS 中進行表現，IPTG 誘 導及純化的方法同EndoG 蛋白的表現及純化的方法。
酵素動力學分析
EndoG切割pUC18 DNA的酵素動力學，在本篇研究是利用固定濃度的EndoG 之後給予不同濃度的pUC18 dsDNA當作受質，並在適當的buffer中反應。依野生 株及突變株活性的不同，反應時間及酵素濃度也會跟著不同。反應結果利用膠體 電泳分析後，經過Gel-Pro® Analyzer (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, USA) 軟體的運算後，將所得的資料代進方程式計算，v = { I1 / ( I0+0.5I1 ) t } × [ substrate ]，t = 反應時間 (秒)、I1 = 產物、I0 = 受質原始濃度。最後利用 Michaelis-Menten方程式將Vmax及Km值，Kcat 與 Kcat/Km隨後便可被計算出 來。
GC 喜好性的切割分析
先前已有文獻利用含有 HSV-1 a sequence 轉接的序利為受質來分析 EndoG (Huang et al., 2002) 。這個質體 DNA 命名為 pKJH20，它包含 HSV-1 a sequence，
經EcoRI 與 XbaI 處理後，形成 2.8 kb 及 1.6 kb 的兩個片斷，而 a sequence 則 會存在於1.6 kb 的片段的邊緣。取 0.2 μg 以 EcoRI/XbaI 處理過的 pKJH20 與重 組人類EndoG 在含有 15 mM spermidine 適當的 buffer 中 37 ℃反應，並依照突變 株不同活性設定不同反應時間。最後加入終止反應的試劑後以1.2 %膠體電泳分 析。
蛋白質立體結構模型分析 (3D modeling)
進入http://bioinfo.pl/meta/ 網頁中並將human EndoG胺基酸序列載入之，進 行分析並計算EndoG可能的 3D結構模式。將由上述方法所得之PDB檔以PyMOL (http://www.pymol.org/funding.html) 軟體程式將PDB蛋白質結構原始的數據檔打 開後，即可將此數據檔轉換成 3D模型，再以該軟體分析並評估其結構，並與其 相似，且已有結晶的蛋白質進行比對，並可從差異性當中推論該點胺基酸在 EndoG當中參與的功能角色。
第三節 結果
人類EndoG 基因多型性之分析
從NCBI 網站中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，利用其Evidence Viewer程式 將人類EndoG在染色體上的每個exon與目前已被發表的EndoG cDNA或mRNA序 列作線性比對。結果得到其中有三個核苷酸點不一樣造成轉譯的胺基酸改變，分 別是第12 個leucine變成serine，第 34 個proline變成leucine，以及第 163 個asparagine 變成lysine (Ohsato et al. 2002; Strausberg et al. 2001) (圖 3-1A) 。EndoG exon1 部 分基因及蛋白質序列比對。在第163 的胺基酸位置，accession number 為X79444.1 的序列的胞嘧啶 (cytosin, C) 點突變為腺嘌呤 (adenine, A) 造成由asparagine (N) 改變成lysine (K)。因此，利用限制酶Hpy99I恰好可辨識此突變點 (圖 3-1B) ，接 著將EndoG exon 1 利用Exon1-P (5′- TGCTGTGCTACGACCCGCGCACCC-3′) 及 Exon1-M (5′-CCCGTGGAGGGACT CGCAGCGAAAGGA-3′) 為引子，以PCR方 法放大EndoG exon 1 的DNA片段 (圖 3-1C) 。在此研究選擇以下幾種細胞株 HeLa、Hs68、HL60、Caco-2、Detroit 551、C3A及Change liver，在取得Exon 1 的產物後 (圖 3-2A) ，經Hpy99I限制酶切割確認後在這些細胞株中沒有發現預期 的K163 這一型的EndoG (圖 3-2B) 。所以我們以endoG N163 的這個因基型為野 生株更進一步研究。
重組人類EndoG 的化學修飾
從圖3-3 各物種 EndoG 的多重線性比對結果，可以顯示出人類 EndoG 第 141 個 histidine 以及很多高度保留的胺基酸。為了偵測 histidine 胺基酸對於 EndoG 活性的影響。我們利用DEPC 來修飾 EndoG 蛋白質上 histidine 胺基酸。將純化 的EndoG (0.2 pmol) 與不同濃度 (0、0.1、0.2、0.4 mM) 的 DEPC 混合後，於 pH 6.0 緩衝液中作用 30 分鐘，再進行酵素活性的測定。圖 3-4 顯示，當作用 DEPC
濃度愈高時，酵素活性被不活化的程度愈大。當DEPC 濃度為 0.2 mM 時，可以 抑 制 大 部 份 EndoG 的 活 性 。 若 是 將 DEPC 不 活 化 的 EndoG ， 進 一 步 以 hydroxylamine 處理，可以回復 EndoG 大部份的活性。此結果顯示 histidine 在 EndoG 當中主要負責催化活性的角色。
EndoG 突變株之酵素動力學
在本研究中，我們將EndoG在各個物種高度保留的histidine、asparagine以及 arginine設計引子進行定點突變成alanine及glutamic acid (見圖 3-4、表 3-1) ，所 得突變株包含：H141A、H228A、H141A/H228A、H141D、H228D、R110A、R139A、
R184A、R272A、N163A、N172A、N251A。由於EndoG水解 DNA的起始速率 會隨著受質濃度增加，利用此曲線關係利用Michaelis-Menten方程式計算可得 Steady-state kinetic參數 (圖 3-5) 。野生株EndoG的Km及Kcat從這個實驗當中得 到值分別為18.72±1.84 nM與 0.07±0.01 S-1。表3-2 為野生株與突變株的酵素動 數也顯示Kcat比野生株降低了 25,000 倍以上，此結果暗示H141、N163 及N251 可能是扮演DNA水解的關鍵角色。將R139 及 N172 各別突變成alanine所得Kcat 比野生株降低了約2,000 倍，而其它的突變株則是下降 1,000 倍左右。綜合以上 結果，H141、N163、N172、N251 這幾個histidine 及 asparagine的位置可能參與
R184A、R272A、N163A、N172A、N251A。由於EndoG水解 DNA的起始速率 會隨著受質濃度增加，利用此曲線關係利用Michaelis-Menten方程式計算可得 Steady-state kinetic參數 (圖 3-5) 。野生株EndoG的Km及Kcat從這個實驗當中得 到值分別為18.72±1.84 nM與 0.07±0.01 S-1。表3-2 為野生株與突變株的酵素動 數也顯示Kcat比野生株降低了 25,000 倍以上，此結果暗示H141、N163 及N251 可能是扮演DNA水解的關鍵角色。將R139 及 N172 各別突變成alanine所得Kcat 比野生株降低了約2,000 倍，而其它的突變株則是下降 1,000 倍左右。綜合以上 結果，H141、N163、N172、N251 這幾個histidine 及 asparagine的位置可能參與