(一) 目標基因選殖
1.質體製備
Mini-preparation of plasmid DNA from bacteria (小量製備)
相關 Kits 購買自 Viogene，詳細實驗步驟參考套組之使用手冊。
2. 勝任細胞製備 (氯化鈣法)
1. 於 37℃ 培養箱中培養隔夜菌體 (12-16 小時)。
2. 取 1 ml 菌液繼代於 100 ml LB 培養液，於 37℃ 下重新震盪培養 菌體至OD600 吸光值為0.4-0.8。
3. 將菌液平均分裝至兩支離心管，冰浴 10 分鐘。自此步驟起均保持 低溫操作。
4. 以 6000 rpm 在 4℃ 下，離心 10 分鐘，移除上清液。
5. 每管以 1-2 ml 冰 0.1 M CaCl2 懸浮菌體，再加入3-5 ml 冰 0.1 M CaCl2混勻，冰浴30 分鐘。
6. 以 4000 rpm 在 4℃下，離心 10 分鐘，移除上清液。
7. 重複步驟 5-6。
8. 每管加入 1 ml 冰 0.1 M CaCl2 / 15% glycerol 懸浮菌體。
9. 每100 μl 菌液分裝至菌種保存管中，儲存於－80℃ 冰箱。
3. 轉形作用
E. coli Heat shock transformation
1. 取 50 μl 勝任細胞與 20 μl 質體接合反應 (ligation) 之產物，或 5 μl
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小量製備的質體混合後，冰浴一小時。
2. 於 42℃下，進行熱休克反應兩分鐘後，迅速置於冰上兩分鐘。
3. 加入 1 ml LB 液態培養基，於 37℃ 培養箱中震盪培養一小時。
4. 以 6000 rpm 離心 10 分鐘，移除上清液，留下約 50 μl 懸浮菌體。
5. 塗於含適當抗生素的培養基上，置於 37℃培養箱培養隔夜。
TSS -Transformation
1. 取 30 μl 隔夜培養菌液，繼代於 3 ml LB 液態培養基中，震盪培養 菌體至OD600 吸光值為 0.6-0.8。
2. 將菌液以 3000 rpm，離心十分鐘，移除上清液。
3. 加入 0.3 ml 2X TSS 溶液將菌體懸浮，加入 5 μl 小量製備的質體混 合後，冰浴一小時。
4. 以 37℃下，進行熱休克反應兩分鐘後，迅速置於冰上兩分鐘。
5. 加入 0.5 ml LB 液態培養基，於 30℃培養箱中震盪培養一小時。
6. 以 6000 rpm 離心五分鐘，移除上清液，留下約 50 μl 懸浮菌體。
7. 塗於含適當抗生素的培養基上，置於 30℃培養箱培養隔夜。
4. 建構點突變蛋白
以pET21a ClpY 作為模板，利用突變引子對 fw 及 rv 分別與 clpY 3’ 及 5’ 引子做第一次 PCR (polymerase chain reaction) 增幅(表三)。所得之產物以 套組回收後，混合兩種片段作為新模板，以 clpY 3’ 及 5’ 引子做第二次 PCR，
2XTSS (Transformation and storage solution) 4℃保存
PEG 8000 (Polyethylene glycol 8000) 20.0 g
1 M MgSO4 4.0 ml
加 LB 至總體積 190 ml，滅菌後再加入 190.0 ml DMSO (Dimethyl sulfoxide) 10.0 ml
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所得二次產物同樣以套組回收後，利用限制酶截切，和以相同限制酵素截切 製備之載體進行接合反應，再轉形至 E. coli XL1Blue 中進行初步篩選，最後 萃取出質體經定序確認正確。
PCR 增幅反應
Total 50.0 μl
PCR 反應條件
Denaturation 94℃： 10 min Denaturation 94℃： 1 min 30s Annealing 48℃~55℃： 1 min Extension 72℃： 1 min 30s Extension 72℃： 10 min Stop 4℃： stop
＊Annealing 溫度依照引子的不同而有所差異，為 Tm 值減 5 度。
PCR 產物純化
將PCR 產物以 Viogene Gel/PCR DNA isolation kit 回收。
限制酶截切反應 (Digestion)
取適量質體或 PCR 回收產物，加入選用之限制酶及其配合之緩衝液混 Template
10X Prime buffer dNTP (10 mM) Forward primer (5μM) Reversed primer (5μM) Prime DNA polymerase ddH2O
1.0 μl 5.0 μl 1.0 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 40.5 μl
30 cycles
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合均勻，於37℃水浴槽內反應，時間約 60 分鐘。反應完成後加入適量的追 蹤染劑，進行DNA 瓊脂電泳。
DNA 瓊脂膠體 (Agarose gel)電泳
以 1X TAE 緩衝液配製 1.0% 的瓊脂膠體，以 100 伏特之電壓進行電泳。
反應35 分鐘後，利用 Ethidium Bromide (EtBr) 進行外染，經退染後再以紫 外光觀察DNA 產物。
回收電泳膠體之 DNA
進行 DNA 瓊脂膠體電泳，並經 EtBr 染色及退染後，使用長波長之紫 外光源 (365 nm)，觀察 DNA 產物片段大小，並挖取欲回收之片段位置，使 用 Viogene Gel - M Gel Extraction kit 回收 DNA。
50X TAE buffer
Tris base 242 g
Glacial acetic acid 57.1 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 100 ml
加水至總體積為1 L，保存於室溫，使用前稀釋至 1X。
接合反應
透過接合酶將以相同限制酶截切製備而得之基因片段及載體接合，於 16℃ 下反應 14~16 個小時，反應後保存於 4℃。
接合反應 (Ligation)
Vector DNA 3.0 μl Insert DNA 13.0 μl 10X ligation buffer 2.0 μl
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Total 20.0 μl 選殖質體篩選及確認
將接合反應的反應物以前述轉形作用的方式轉形至 E. coli. XL1Blue 中，
並塗抹於含適當抗生素之培養基上，以篩選具有質體的菌落。重新於菌體中 純化出質體，並以適當的限制酵素截切，經瓊脂膠體電泳分析，初步確認 DNA 片段分子量大小，最後將萃出之質體委由基龍米克斯進行定序。
(二) 蛋白質純化
His-tag 蛋白質純化
1. 將N 端帶有 6xHis-tag 之 clpY 及其於突變株送入 pET21a 中，並於大 腸桿菌菌株BL21 (DE3) clpY-Q- 中表現並加以純化。
2. 於30℃培養箱中隔夜培養菌體。
3. 將隔夜培養菌液以1:100 繼代於含適當抗生素之 200 ml LB 液態培養 基中，盪培養菌體約 2 小時，至 OD600吸光值為0.4。
4. 加入終濃度1 mM 之 IPTG，以誘導目標蛋白質表現，再繼續震盪培 養4 小時。
5. 於4℃以 4000 rpm 離心 15 分鐘，移除上清液。
6. 以8 ml 冰的 wash buffer 懸浮菌體。視菌量多寡調整 buffer 量。
7. 在冰上以超音波震盪器(震盪 1 秒後暫停 1 秒，持續 2 分鐘後，於冰 上靜置1 分鐘) 將細胞打破。
8. 於4℃以 10,000 rpm 離心 30 分鐘，取上清液備用。
9. 取1 ml Ni Sepharose™ 6 Fast Flow (GE Healthcare) 到乾淨之管柱中，
以10 ml wash buffer 流洗平衡 resin。
10mM ATP 2.0 μl T4DNA Ligase (TaKaRa) 1.0 μl
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10. 將上清液通過平衡完畢之管柱。
11. 以 10 ml wash buffer 流洗 resin，去除非專一性結合之雜質。
12. 以 5 ml elution buffer 流洗 resin，使結合於 resin 上之目標蛋白溶出，
並收集通過管柱滴下之液體。
13. 以 5 ml dH2O 流洗 resin，使 resin 與 elution buffer 中之咪唑 (imidazole)間結合力下降，以去除 elution buffer。
14. 以 10 ml wash buffer 流洗 resin，重新平衡鹽離子濃度，再把清洗完畢 之resin 保存於 4℃。
15. 於步驟 11 收集而得之產物，取 20μl 與同體積之 2X SDS sample buffer 混合，於 100℃加熱 10 分鐘，待其冷卻後以 SDS-PAGE 觀察 結果。
5X Wash buffer
NaH2PO4 3.0 g
NaCl 8.7 g
H2O 150 ml
先溶解後，再加水至總體積為 200 ml，保存於 4℃ 200 ml 需要時先稀釋至1X，並調整其 pH 至 7.0，置於冰上備用。
Elution buffer (pH 7.0)
NaH2PO4 0.6 g
NaCl 1.74 g
Imidazole 2.72 g
H2O 150 ml
溶解後，pH 調至 7.0，再加水至總體積為 200 ml，保存於 4℃ 200 ml
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蛋白質濃縮
選定適合分子大小 (50 kDa) 的蛋白質濃縮過濾器 (Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Devices, Milipore)，以低溫離心的方式進行蛋白質濃縮，濃 縮後以大量storage buffer 置換原本的 elution buffer，體積比為 1：30，此步 驟重複兩次以確保緩衝液置換完全。最後以微量吸管將蛋白溶液自濃縮過濾 器中取出。
蛋白質定量
使用Bradford 法，將蛋白質標準品牛血清蛋白 (BSA) 依所需要之濃度 稀釋，在96 孔盤中加入 Bradford 試劑 200 μl 混合均勻，在室溫下放置 10 分鐘，以分光光度計測吸光值 A595 繪製標準曲線，再將待測樣品值代入公 式計算濃度。
蛋白質保存
蛋白質所存在之緩衝液置換成利於蛋白質保存之storage buffer，使用濃 縮管來進行緩衝液置換。
Storage buffer
2X SDS sample buffer
10% SDS 20.0 ml
Glycerol 10.0 ml
β-mercaptoethanol 5.0 ml
1.0 M Tris-HCl (pH6.8) 6.25 ml
Bromophenol blue 1.25 mg
加水至總體積為 50 ml，保存於室溫 50 ml
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0.5M HEPES 5.0 ml
1.0M MgCl2 1.0 ml
1.0M DTT (Dithiothreitol) 25.0 μl
65% Glycerol 7.7 ml
NaCl 0.88 g
H2O 25 ml
先溶解後，調整pH 至 7.4，再加水至總體積為 50 ml
(三) SDS 蛋白質膠體電泳
SDS-PAGE
含粗萃蛋白的SDS-PAGE 樣品溶液於 12.5%的 SDS-PAGE 膠片中進行 蛋白質電泳，視蛋白質分子量大小選擇適當的膠體濃度。用來檢查蛋白質純 化程度，蛋白質定量精準度。
1. 鑄膠，適當隔絕空氣，避免膠體乾裂。
2. 100 伏特電泳十分鐘。
3. 再 120 伏特下電泳約兩小時，視蛋白質泳動速率決定電泳時間。
4. 電泳後將膠片以清水泡洗，去除 SDS。
5. 染色並脫色後，以 G:BOX 膠體照相系統建檔保存。
SDS-PAGE 電泳膠片 (12.5%) Running gel Stacking gel
H2O 3.3 ml 3.4 ml
30% Acrylamide 4.0 ml 0.83 ml 1.5M Tris (pH 8.8) 2.5 ml 0 ml 1.0M Tris (pH 6.8) 0 ml 0.63 ml
10% SDS 0.1 ml 0.05 ml
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10% APS 0.1 ml 0.05 ml
TEMED 0.004 ml 0.005 ml
此份量約可配製 0.75 mm 厚 10 X 7 cm 的膠片兩片。
30% 丙烯醯胺液 (Acrylamide)
40% Acrylamide / Bisacrylamide 75 ml
H2O 25 ml
加蒸餾水至100 mL，保存於 4℃。
5X 電泳槽緩衝液 (Chamber buffer)
Tris base 15.0 g Glycine 72.0 g SDS 5.0 g
先以800 ml 蒸餾水溶解並調整 pH 至 8.3，加水至 1000 ml，保存於室溫。
使用時稀釋至1X。
APS 溶液 (Ammonium persulfate)
APS 50.0 mg 加滅菌水0.5 ml 溶解。每次使用前新鮮配置。
SDS-AGE
用來檢視聯結蛋白之分子量大小。含聯結蛋白的樣品溶液於 3% 的 SDS-AGE 膠片中進行蛋白質電泳，160 伏特電泳 90 分鐘。以 agarose 取代 Acrylamide/ Bisacrylamide，具備多種好處：可使用較少量之樣品，得到較清 晰的色帶，且電泳時間較短，所需電壓也較小。採取水平電泳，膠體的厚度 決定可以乘載的樣品體積，以150 ml 為例，可乘載 25 μl 的樣品。
1. 當溶解洋菜顆粒以微波爐加熱時應避免溶液溢出，加熱後靜置一段 時間，待氣泡消減再倒入鑄膠槽中。採用14*15 cm2的鑄膠槽。
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2. 160 伏特電泳 90 分鐘，視蛋白質泳動速率決定電泳時間。
3. 電泳後將膠片以清水泡洗，去除 SDS。
4. 染色並脫色後，以 G:BOX 膠體照相系統建檔保存。
SDS-AGE 電泳膠片(3%) Running gel
TAE beffer 150 ml
Agarose 4.5 g
10% SDS 0.1 ml
(四) 蛋白質聯結測試 (cross-linking analysis)
為了解ClpY 蛋白的生理狀態，以緩衝液模擬生理環境，並加入 ATPγS 模仿ATP 分子，藉由戊二醛 (glutaraldehyde) 兩端之醛基，將兩個氨基以共 價鍵聯結起來，如此便可以將ClpY 蛋白質在此模擬環境中的生理狀態固定。
在此，以蛋白質膠體電泳將大小不同的蛋白質分開來，以分子量判定 ClpY 蛋白質形成六元環或其他多元體的狀況。
1. 將 ClpY (6 μM)、ClpQ (6 μM) 與 1 mM ATPγS 加入 degradation buffer 中，總體積為 40 μl。ATPγS 應統一最晚加入。
2. 於 37℃ 水浴槽中培養五分鐘。
3. 加入戊二醛，使反應液戊二醛終濃度為 0.4%。加入時需強力震盪 均勻。
4. 於 37℃ 水浴槽中再培養 20 分鐘進行聯結反應。
5. 加入 10 μl 2XE SDS-PAGE sample buffer。
6. 進行蛋白質膠體電泳 (SDS-AGE)。
4X Degradation buffer
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0.5 M HEPES 80 ml
1.0 M MgCl2 4.0 ml
1.0 M DTT（Dithiothreitol） 0.4 ml
0.5 M EDTA 0.8 ml
H2O 50 ml
先溶解後，再加水至總體積為 100 ml，保存於 4 ℃ 100 ml
(五) 細菌生理活性分析
本 實 驗 中 以 5’EcoRI 及 3’HindIII 將 clpY 及 其 突 變 株 建 構 於 pBAD24，並共轉形入 pBAD33 ClpQ 及 pTH18kr HA-SulA 或 pTH18kr 3xFLAG-SulA，細菌生長時以阿拉伯糖大量誘導 ClpYQ 蛋白質，以 IPTG 誘 導tag-SulA，觀察生長於盤上之表現型。
1. 於大腸桿菌 AC3112 中共轉形 pBAD33 ClpQ、pBAD24 ClpY 或其 突變株及pTH18kr HA-SulA 或 pTH18kr 3xFLAG-SulA。以 pBAD33 ClpQ、pBAD24 及 pTH18kr HA-SulA 或 pTH18kr 3xFLAG-SulA 作 為質體控制組。
2. 隔夜培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm、1/2 Kan 的 LB 培養基中。
3. 當日，測定 OD600，取同樣濃度之菌液繼代培養。
4. 繼代培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm、1/2 Kan 的 LB 培養基中，並額 外加入終濃度0.5% 之阿拉伯糖。
5. 30 ℃ 培養至 OD600 為0.2，加入終濃度 1mM IPTG 誘導 HA-SulA 表現。
6. 加入 IPTG 後 2 小時，取 10 μl 菌液於 96 孔盤中，利用八爪為量分 注器，以M9 minimal medium 序列稀釋菌液至 10-8，滴於1/2 ACK 盤
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上培養於30 ℃。
7. 培養一天後掃描存檔。
(六) 細菌液態培養密度測定
本 實 驗 中 以 5’EcoRI 及 3’HindIII 將 clpY 及 其 突 變 株 建 構 於 pBAD24，並共轉形入 pBAD33 ClpQ，細菌生長時以阿拉伯糖大量誘導 ClpYQ 蛋白質，觀察 ClpYQ 蛋白質對細菌密度之影響。
1. 共轉形 pBAD33 ClpQ、pBAD24 ClpY 或其突變株於大腸桿菌 AC3112 中。
2. 隔夜培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm 的 LB 培養基中。
3. 當日，測定 OD600，取同樣濃度之菌液繼代培養。
4. 繼代培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm 的 LB 培養基中，並額外加入終 濃度0.5% 之阿拉伯糖。
5. 30℃ 培養 24 小時 6. 測量 OD600 讀值。
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