大腸桿菌ClpY 蛋白形成六元環關鍵胺基酸之研究

國立臺灣大學生物資源暨農學院農業化學系 碩士論文

Department of Agricultural Chemistry College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

大腸桿菌ClpY 蛋白形成六元環關鍵胺基酸之研究

The study of the key amino acid on ClpY hexamer formation

張祿高 Lu-Kao Chang 學號：R00623024

指導教授：吳蕙芬 博士

中華民國 102 年 7 月

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論文審定書

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謝誌

感謝台大的多元樣貌，豐富我的視野。感謝農業化學系，讓我從大學一路富 足地學習到碩士。感謝蕙芬老師三年多來的指導，帶領我學習新技術，開放討論 後務實的實踐，還有在生活上的支持，老師總是與我們一起共度難關，非常感謝 老師。

感謝 陳昭瑩教授、陳建德教授、徐駿森教授以及林晉玄教授撥冗細心審閱 本論文初稿，參與口試給予我寶貴的建議，使我的思考更加全面完善，從而完成 此論文。

感謝汎擎大學長，傳授我這麼多好用的寶貝技術，感謝鈞暘哥，給力的靠山 總是令人心安，感謝齡誼姊，燃燒自身之餘還用盡全力照亮我們，感謝智瑄，大 事小事一手包辦，感謝嘉葳姊，如此的直率總讓人精神為之一振，感謝惠婷姊，

到位且貼心的你是我永遠的模範，謝謝玉鳳、郁君和宣合，讓我初次認識這可愛 的實驗室，謝謝柏儒從容的分析與鼓勵，謝謝慈芳和謝馨，用開朗的歡笑和可口 的零食豐富我們，感謝天寧，你的參與激盪出土壤微生物的絢爛火花，感謝君翰，

讓熱情充滿了實驗室。感謝羅凱尹老師帶領我完成首次的助教生涯。

感謝六年來共同學習成長的 B96 夥伴們，感謝泰祥無私的分享與陪伴，感 謝述鈞，不論在什麼時候總是能產生正面能量，感謝得翔與宜叡在實驗上精闢的 見解，感謝鈺卿總是捎來第一手消息，感謝克韓總是有令人發笑的故事，感謝昱 霆、鎮賢、沛育、永杰，能與你們體驗人生真是一大樂事。感謝系排的夥伴們，

儘管用生鏽的關節與你們打球一樣很開心。感謝浩銘、瑞堂、二中、宜慧、立婷 及日出團的夥伴們，豐富了我的生活拓展了我的視野。謝謝慈玲、妍妤和文修，

很高興在碩班生涯認識你們。

謝謝張珊齊兩年來的鼓勵與陪伴，每每見到你可愛的笑容，總是讓疲累一掃 而空充滿活力，感謝你的關心與包容。最後謝謝我們家人們，你們總是我最強力 的支持，謝謝你們的信任、關懷和愛。謝謝你們。

將此篇論文獻給你們

iii

摘要

蛋白質是重要的生物分子，細菌中具有蛋白質品管系統(protein quality control network)，以維持各類蛋白質之生理活性。其中包含有伴隨蛋白(chaperone) 及蛋白酶(protease)，伴隨蛋白協助蛋白質對抗構型變化並修正構型已變之蛋白質，

蛋白酶則是分解存在時機不適當之蛋白質，或是已經徹底毀損構型而無法挽救之 蛋白質。細菌體內的蛋白質降解任務，主要由一系列不同之 ATP 依賴型蛋白酶 (ATP-dependent protease) 所執行。

ATP 依賴型蛋白酶具兩種功能區塊解構酶(unfoldase) 及胜肽酶(peptidase)，

前者具有水解 ATP 活性將基質解構並傳送胜肽鏈給後者分解，故屬於 AAA+

(ATPase associated with various cellular activities) 家族的一員。革蘭氏陰性菌大腸 桿菌中，包含ClpAP、ClpXP、ClpYQ、LonA 及 FtsH 等五種 ATP 依賴型蛋白 酶，因為具備形成多元環之特性，ATP 依賴型蛋白酶在生理狀態下皆呈現桶狀 結構。

本研究以 ClpYQ 作為探討形成多元環的關鍵因素。前人研究顯示，第 408 個胺基酸tyrosine 對於 ClpY 六元環的形成有關鍵影響，突變蛋白 ClpY Y408A 不論在有無ATP 或是 ClpQ 的存在下，ClpY 形成六元環的能力都較野生型蛋白 為差。檢視 ClpY 結晶結構 1E94，推測 Y408 胺基酸其較大的側基，可與鄰近 胺基酸產生較多的凡得瓦爾力，因此我們選擇一系列不帶電的胺基酸，建構了側 基由小到大的Y408 點突變蛋白。在胞外以聯結試驗觀察 ClpY 蛋白在 ATPγS 存 在下形成六元環的狀況；另利用ClpYQ 之基質 SulA，其作為抑制細胞分裂的特 性，透過細菌存活程度，檢定胞內ClpYQ 蛋白酶之活性。結果顯示，胞外與胞 內的結果趨勢均隨 ClpY Y408 側基大小而改變。側基愈小的 ClpY 蛋白在胞外 形成六元環的能力愈弱；而ClpY Y408 的側基愈小，對細菌生長的限制愈大。以 上顯示ClpY Y408 是 ClpY 形成六元環的關鍵胺基酸。

iv

Abstract

Proteins play important roles in the cell. Protein quality control network maintain the physiology function of proteins in bacteria. There are chaperons and porteases in the network. Chaperons help to against the denature and refold the unnature proteins, proteases degrade the damaged proteins or no suitable ones. Degradation relies on ATP-dependent proteases, like ClpAP, ClpXP, ClpYQ, Lon and FtsH in model organism Escherichia coli. Under physiology condition, all of them form homomultimer and then stack to form the barrel shape.

This study exams the key amino acid in ClpY forming the hexamer. Before, we knew ClpY Y408A mutant strictly effect the hexamer formation. In the crytstal structure 1E94, Y408 is very close to the adjacent amino acid R25; therefore we speculate that the van der Waals' force between ClpY R25 and Y408 might help ClpY hexamer formation. Here, I present some evidence both in vitro and in vivo. I constructed gradient size point mutant on Y408, according to their side chain size of the amino acid. In vitro, the purified mutant proteins corsslink by glutaraldehyde, running the sodium dodecyl sulfate agarose gel electrophoresis (SDS-AGE) to see the 300 kDa hexamer cylinder or not. ClpY Y408W forms more hexamer than Wt, Y408L, Y408C and R25A/Y408A. In vivo, ClpY Y408 mutants constructed on pBAD24, co-transformed with ClpQ and tagged-SulA, which is a substrate of Lon and ClpYQ and can inhibit cell divide, to AC3112 lon^- clpYQ^-. The wild type ClpYQ can degrade SulA, then cell grow, otherwise the cell would become lethal. Cell viability reveals the Y408W growth equal to wild type, and order as follow: Y408M, Y408L and Y408V/C/A, which growth equal to vector control. Briefly, I show that the side chain of the amino acid of ClpY Y408 mutants affect the function gradually, once the side chain bigger, the hexamer forms more and the cell can grow better.

v

目錄

論文審定書 ... i

謝誌 ... ii

摘要 ... iii

Abstract ... iv

目錄 ... v

表目錄 ... vii

圖目錄 ... viii

附圖目錄 ... ix

壹、 前言 ... 1

一、 ATP 依賴型蛋白酶

二、 大腸桿菌中 ATP 依賴型蛋白酶

三、 ClpYQ 之基質

四、 ClpYQ 之結構

五、 研究動機

貳、 材料與方法 ... 10

一、 實驗材料

(一) 菌株與質體 ... 10

(二) 藥品與試劑 ... 11

vi

(三) 器材設備 ... 12

(四) 分析軟體 ... 12

二、 方法

(一) 目標基因選殖 ... 13

(二) 蛋白質純化 ... 17

(三) SDS 蛋白質膠體電泳 ... 20

(四) 蛋白質聯結測試 (cross-linking analysis) ... 22

(五) 細菌生理活性分析 ... 23

(六) 細菌液態培養密度測定 ... 24

參、 結果 ... 25

一、 以軟體預測影響六元環形成之成因

二、 確認 ClpY 及其突變株之六元環形成能力

三、 胞內 ClpYQ 蛋白酶生理活性測試

四、 ClpYQ 蛋白酶與基質對細菌生長之影響

五、 ClpYQ 蛋白酶對液態培養的細菌密度之影響

肆、 討論 ... 30

伍、 結論 ... 33

陸、 參考文獻 ... 34

vii

表目錄

表一、本論文所使用的菌株 ... 38

表二、本論文所使用的質體 ... 39

表三、本論文所使用的引子對 ... 40

viii

圖目錄

圖一、ClpYQ 結晶結構卡通圖 ... 42

圖二、ClpY 單體之結晶結構卡通圖及其區塊標示 ... 43

圖三、ClpY 單體於六元環之相對位置卡通圖 ... 44

圖四、ClpY Y408 及其附近胺基酸之結晶結構卡通圖 ... 45

圖五、ClpY 蛋白單體表面構造 ... 46

圖六、ClpY Y408 突變模擬圖 ... 47

圖七、純化 ClpY 突變蛋白 ... 48

圖八、定量 ClpY 突變蛋白 ... 49

圖九、ClpY、ClpY Y408C 及 ClpY Y408W 形成六元環之能力 ... 50

圖十、ClpY、ClpY Y408L 及 ClpY R25A/Y408A 形成六元環之能力 ... 51

圖十一、HA-SulA 於 AC3112 生理活性分析 ... 52

圖十二、透過不具活性的 ClpYQ 基質觀察 ClpYQ 六元環對細菌生 長之影響 ... 54

圖十三、大腸桿菌 AC3112 大量誘導 ClpYQ 於 24 小時停滯期之菌

量 ... 56

ix

附圖目錄

附圖一、ATP 依賴型蛋白酶之分類及保守性序列之分佈 ... 57

附圖二、ClpY Y408 於真核生物間的保守性 ... 58

附圖三、ClpY Y408 於原核生物間的保守性 ... 59

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壹、 前言

一、

細菌體內充滿了各種巨分子如蛋白質、DNA 及 RNA 等，面對不同環境皆 需要維持菌體內部之生理恆定，負責各類生理活性的蛋白質尤其重要。細菌具備 蛋白質品管系統 (protein quality control network, PQC)，以維持各類蛋白質之生理 活性。其中包含有伴隨蛋白 (chaperone) 及蛋白酶 (protease)，伴隨蛋白協助蛋 白質對抗構型變化並修正構型已變之蛋白質，蛋白酶則是分解存在時機不適當之 蛋白質，或是已經徹底毀損構型而無法挽救之蛋白質。

細菌體內的蛋白質降解任務，主要由一系列不同之 ATP 依賴型蛋白酶 (ATP-dependent protease) 所執行。蛋白酶中功能區塊主要分為解構酶 (unfoldase) 及胜肽酶 (peptidase)，前者將基質解構並傳送胜肽鏈給後者分解。此系列蛋白酶 中的解構酶具有水解 ATP 活性，如一般核酸水解酶一樣，具有與核酸結合的 walker A 超二級結構 (motif) 及負責核酸水解相關的 walker B 超二級結構 (Hanson & Whiteheart, 2005)，屬於 AAA+ (ATPase associated with various cellular activities) 家族的一員。AAA+ 家族成員參與細菌體內多種功能，如 DNA 複製 或重組、微管的運輸、鞭毛泳動及此處之蛋白質降解等 (Neuwald et al., 1999)，

故此系列蛋白酶又稱為AAA+ 蛋白酶。

若解構酶與胜肽酶為同一個基因所承載，如：LonA、LonB 以及 FtsH，歸 於單元體蛋白酶 (one-component protease)。若解構酶與胜肽酶為兩個基因分別承 載，如：ClpAP、ClpCP、ClpEP、ClpXP 及 ClpYQ，則歸於雙元體蛋白酶 (two-component protease) (如附圖一)。革蘭氏陰性菌中帶有 ClpAP、ClpXP、ClpYQ、

LonA 及 FtsH 等五種 ATP 依賴型蛋白酶；革蘭氏陽性菌則具有 ClpCP、ClpEP、

ClpXP、ClpYQ、LonA、LonB 及 FtsH 等七種 ATP 依賴型蛋白酶 (Gur et al.,

2

2013) 。

二、 大腸桿菌中 ATP 依賴型蛋白酶

Lon

大腸桿菌中LonA (或稱為 Lon) 為主要的蛋白酶，早在 1960 年代，研究突 變株表面大量多醣生成之細胞外圍黏稠 (mucoid) 現象，此突變株較不容易抵抗 紫外光，且細胞呈現長條狀 (long)，因此命名為 Lon (Howard-Flanders et al., 1964)。

日後了解到mucoid 現象是因為 Lon 之基質 RcsA 殘存，持續誘發莢膜多醣基因 表現所造成 (Torres-Cabassa et al., 1987)；而另一基質 SulA 的累積，由紫外光所 誘發，抑制細胞分裂而產生長條之形狀 (Gottesman et al., 1981)。因為分解蛋白 質是趨向失序而能提高熵，當Lon 被發現是需要 ATP 的蛋白酶時，打破科學家 所 認 為 降 解 蛋 白 質 是 不 需 耗 能 之 下 坡 反 應 (downhill reaction) 的 概 念 (Murakami et al., 1979)。Lon 也能和 DNA 結合，是所有蛋白酶中唯一有此特性 者，但其生理意義尚未明朗 (Gur, 2013)。

FtsH

具有穿膜區域的FtsH 蛋白酶，鑲嵌在細菌內層胞膜上，可以分解在細胞質 中以及細胞膜上的蛋白質，除了分解失活的蛋白質 (Okuno & Ogura, 2013)，亦 調控細菌之逆境反應、脂質生合成 (Ogura et al., 1999) 及生物膜之合成 (Bove et al., 2012)，甚至參與了大腸桿菌間蛋白質抗生素 (colicin) 的成熟過程 (Chauleau et al., 2011)。

ClpAP

雙元體的 ClpAP，除了可以分解自身之外，更著名的是它與接合蛋白

(adaptor) ClpS 合作，參與細菌中 N 端法則 (N-end rule) 的運作 (Erbse et al., 2006)，N 端法則於酵母菌中首度發現 (Varshavsky, 1996)，後來證實在細菌、植

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物及動物中都有相似的現象，也就是蛋白質的第二或第三個胺基酸決定了此蛋白 質的半衰期 (Varshavsky, 2011)。在大腸桿菌中，ClpS 會辨認 N 端胺基酸為白 胺酸 (Leucine, L)、苯丙胺酸 (Phenylalanine, F)、色胺酸 (Tryptophan, W) 以及酪 胺酸 (Tyrosine, Y) 之蛋白質，然後將此基質交給 ClpAP 蛋白酶降解。其中解構 酶ClpA 從水解 ATP 獲得能量而將基質解構，並傳送胜肽鏈給胜肽酶 ClpP 分解 (Dougan et al., 2012)。

ClpXP

ClpXP 蛋白酶同為雙元體，ClpX 為解構酶，ClpP 為胜肽酶，與 ClpAP 中 的ClpP 一模一樣，基因 clpP 位於第 9.83 分鐘，順向下一個基因即為第 9.84 分 鐘的 clpX。ClpXP 也能藉由接合蛋白如 SspB 及 RssB 的協助來降解蛋白質，但 最特別的是 ClpXP 能直接辨識 SsrA-tag 蛋白而將其水解 (Gottesman et al., 1998)。當細菌核醣體 (ribosome) 在轉譯蛋白質時，若遇到 mRNA 不完全而缺 乏停止密碼 (stop codon)，則核醣體會卡在 mRNA 上無法脫離，ssrA (small stable RNA gene A) 所轉錄出之 tmRNA (transfer-messenger RNA) 則能夠充當 tRNA 讓核醣體繼續轉譯，並帶有一段 mRNA 及停止密碼，此段 mRNA 能轉譯 出11 個胺基酸大小的片段，即所謂之 SsrA-tag，此片段能夠被 ClpXP 所辨識並 降解此蛋白質，細菌藉此可分解因mRNA 不完全而不完整生合成之蛋白質，並 釋放困在mRNA 上的核醣體 (Keiler et al., 1996)。

ClpYQ

clpQY/hslVU 基因序列於 1993 年時由 Chuang 等人，首次在大腸桿菌中發現。

clpQY 位於大腸桿菌基因圖譜的 88.9 分鐘處，可同時被轉錄成 mRNA，故為一 組操作子。由於 clpQY 操作子之 mRNA 經由熱誘導後為未熱誘導之 1.5 倍，且 其上游啟動子 (promoter) 序列與可被熱休克轉錄因子 (heat shock transcription factor, σ³², σ^H) 辨識的啟動子保守序列相似，亦與 groE 及 dnaK 等熱休克基因 (heat-shock gene) 之啟動子保守序列相符 (Chuang et al., 1993)，因此推論 clpQY

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操作子為熱休克基因，故初始名稱由「heat shock locus」的意義而命名為 hslVU。

此外，Rohrwild 等人於 1996 年時，將σ³² 選殖於具有 lac 啟動子的質體上，而 後以IPTG 誘導σ³² 大量表現，發現HslVU 蛋白的表現量增加約 10 倍，更確定 HslVU 為熱休克蛋白 (Rohrwild et al., 1996)。若以蛋白質之作用來分類，由於其 蛋白層次具下列兩點特徵，因此將之分屬於 Clp 家族 (caseinolytic protease family)：(1)從胺基酸序列比對的結果發現，HslV 與真核生物 20S proteasome 中 的β-type 單體具相似度，應具胜肽酶的功能，於 Clp family 中可扮演胜肽酶的 角色；(2)HslU 具有 ATP 結合區，且與 ClpX 的胺基酸序列有 50% 的相同度，

故HslU 應屬於 Clp family 中負責基質辨識及 ATPase 的角色。由於此組操作子 於胺基酸比對上類似於Clp 家族，因此，又被命名為 ClpQY (Schirmer et al., 1996)。

經由基因序列轉譯成胺基酸序列後計算得知 ClpQ 之分子量為 19095 Da；ClpY 之分子量為49598 Da。目前所知 ClpYQ 除了可以分解異蛋白 (abnormal protein) 外，其基質有四種：SulA、RcsA、RpoH 及 TraJ。其中 SulA 與 RcsA 為 Lon 之 基質 (Mizusawa & Gottesman, 1983)。RpoH 為 FtsH 之基質 (Yura et al., 1993)。

三、

異蛋白

利用添加胺基酸類似物或是嘌呤黴素 (puromycin) 而生成不正常蛋白，或異 蛋白及外來蛋白的大量累積，皆會誘導熱休克蛋白的生成，致使菌體內產生類似 熱休克反應之現象。Missiaka 等人於 1996 年時發現，過量表現的 clpQY 操作子 可 抵 抗 造 成 大 腸 桿 菌 累 積 有 害 蛋 白 質 的 毒 素 如 嘌 呤 黴 素 及 伴 刀 豆 蛋 白 A (concanavalin A)。以上結果顯示，ClpYQ 在大腸桿菌細胞中係扮演著分解異蛋 白的角色 (Missiakas et al., 1996)。

RpoH

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面對溫度上升所造成之快速而半致死性的環境變化，細菌會啟動熱休克反應 (heat shock response, HSR) 。 此 現 象 最 早 源 於 研 究 黑 腹 果 蠅 (Drosophila melanogaster) 之唾腺細胞，當溫度提高於正常生長溫度攝氏五度時，會使細胞 快速地大量產生特定蛋白質，統稱為熱休克蛋白 (heat shock protein, HSP) (De Maio et al., 1999)，後來確定此反應為生物體所共有。除了在溫度上升的逆境外，

細菌面對環境之重金屬、氧化壓力及酸鹼性改變等逆境下也會產生熱休克反應。

熱休克蛋白中有伴隨蛋白及 ATP 依賴型蛋白酶，皆有助於維持細菌體內蛋白質 的種類及品質，前者協助維持蛋白質結構完好，而後者降解不合適及無法回復之 錯誤摺疊蛋白。

大腸桿菌中由熱休克轉錄因子 (σ³² )單獨調控熱休克反應，其基因名為 rpoH。

非逆境狀態下，因為 rpoH 之 mRNA 二級結構中鹼基配對位置占據了核醣體結 合位，蛋白質轉譯量低；又RpoH 蛋白會在 DnaK 及 DnaJ 的協助下，快速地被 FtsH 降解 (半衰期約一分鐘)，故此時細菌體內 RpoH 之數量很少 (Guisbert, et al., 2004)，細菌體中之基因表現由主要轉錄因子σ⁷⁰ 所控制。當溫度上升，rpoH 之 mRNA 結構釋放了核醣體結合位，RpoH 轉譯量增加；而短時間內，伴隨蛋 白系統及蛋白酶FtsH 著手處理因環境變化而構型改變的蛋白質，兩種因素皆使 RpoH 較為穩定 (Straus et al., 1987)，從而繼續誘發熱休克反應。伴隨蛋白 DnaK 及DnaJ 和 ATP 依賴型蛋白酶 ClpYQ 亦屬於於熱休克蛋白的一員，熱休克反應 中更多量之DnaK/J 造成 RpoH 被 FtsH 降解，而 ClpYQ 蛋白酶被 RpoH 提高 表現量，也會回頭降解RpoH，多重因素讓 RpoH 數量減少，由此調控熱休克反 應。

RcsA

莢膜生合成調控蛋白 RcsA 會與 RcsB 共同形成異雙體 (hetrodimer)，調控 莢膜生合成基因的表現。RcsA 亦為另一依賴 ATP 蛋白酶 Lon 之基質。由 1999 年Wu 等人首度提出 RcsA 即為 ClpYQ 蛋白酶基質之證據，除觀察到大量表現

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ClpYQ 蛋白酶可抑制菌體之 mucoid 表現型外，更進一步利用可受 RcsA 調控之 cpsB::lacZ 報告基因，藉由 cpsB::lacZ 表現β-galactosidase 的活性，來觀察 ClpYQ 蛋白酶對 RcsA 之影響。實驗結果顯示由多倍數質體大量表現的 ClpYQ 蛋白酶會使得 cpsB::lacZ 表現下降為對照組的 20 倍 (Wu et al., 1999)。2012 年，

Hu 等人也藉由 in vivo 之半衰期及 in vitro 的水解試驗證明 ClpYQ 蛋白酶可分 解RcsA (胡, 2012)。

TraJ

TraJ 為 F 質體進行接合作用 (conjugation) 過程中的活化蛋白，大腸桿菌內 膜上的CpxAR 訊息傳導系統 (two-component regulatory system) 可感應外在逆 境，提高部分伴隨蛋白、熱休克蛋白及 ClpYQ 之表現量，並對 TraJ 進行後轉 譯修飾 (post-transcriptional inactivation) 減少細菌之接合作用。透過胞內及胞外 降解試驗，發現TraJ 能被 ClpYQ 蛋白酶水解。ClpYQ 與 CpxAR 共同調控 TraJ 在菌體內的含量 (Lau‐Wong et al., 2008)。

SulA

當 UV 光或是其他氧化物質使得大腸桿菌中的 DNA 受損時，細菌會啟動 SOS 反應，停止細胞分裂，直到 DNA 修補完成。當遺傳物質受損時，RecA 與 單股 DNA 結合，促使 LexA 開始自我水解，LexA 釋放原先抑制的 SOS 基因 上游結合位，使得SOS 基因開始表現。其中 SOS 基因 sfiA 表現後轉譯成 SulA 為 細胞分裂抑制蛋白，其胺基酸序列在腸道細菌中有高度保守性，分子量約18 kDa。

SulA 與 FtsZ 蛋白質結合，使後者無法聚合形成細胞分裂必須的 Z 環 (Z-ring)，

達到停止細胞分裂的效果 (Bi & Lutkenhaus, 1990)。當 DNA 修復後，SulA 停止 表現，並藉由 ClpYQ 及 Lon 蛋白酶將細胞內的 SulA 清除 (Mizusawa &

Gottesman, 1983)。

根據實驗，Khattar 等人篩選到一質體可在 lon^– 突變株中可抑制 SOS 反應，

進一步分析該質體中所帶的基因序列，確認能抑制SOS 反應是由於 clpQY 操作

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子大量表現所致。細胞型態結果亦顯示，lon^– 突變株中若帶有能表現ClpYQ 蛋 白之載體，細胞可正常分裂，促使原本因細胞不分裂而成絲狀的大腸桿菌細胞成 為正常分裂的細胞，但若不帶有該載體，細胞則因無法細胞分裂而呈現絲狀，此 絲狀細胞乃由於大量累積的 SulA 和 FtsZ 結合，抑制細胞分裂所致。以上結果 說明在Lon 蛋白酶不存在時，ClpYQ 蛋白酶可以分解 SulA (Khattar, 1997)。

四、

ClpQ

ClpQ 由 176 個胺基酸構成，分子量約為 19 kDa。ClpQ 會聚合形成六元環單 體，再由兩個六元環單體聚合形成十二元體。ClpQ 具有胜肽酶的功能，主要負 責水解經由ClpY 解開並運送進入的胜肽鏈。ClpQ 與真核生物的 20S proteasome 之 β-type subunit 具有 18% 之相似度，且在蛋白酶的分類上與 20S proteasome 同樣屬於threonine protease，與 ClpP (屬於 serine protease) 不同 (Missiakas et al., 1996, Bochtler et al., 1997)。

ClpQ 在 其 單 獨 存 在 時 活 性 不 高 ， 可 緩 慢 的 水 解 一 些 斥 水 性 的 胜 肽 (Rohrwild et al., 1996)，ClpQ 自身會形成六元環 (ClpQ6)，再以兩個六元環聚合 成啞鈴狀的十二元體 (ClpQ12)，而其活性中心位於十二元體內部 (Bochtler et al., 1997)，基質必須進入活性中心才能被分解。ClpQ 的活性胺基酸在蛋白質 N 端 第二號胺基酸，因此需將6xHis-tag 融合於 ClpQ C 端，才能純化出有活性的 ClpQ 蛋白。組成ClpQ 的十二元體每個單體皆具有單一活性部位，所以 ClpQ 的十二 元體具有十二個活性部位。在 2009 年的研究報告顯示，當 ClpQ 十二元體中具 有正常ClpQ 次單元的個數達六個以上時，可以維持與野生型 ClpQ 蛋白酶相同 的降解活性，若個數不達六個時，其活性有逐漸下降的趨勢 (Lee et al., 2009)。

ClpY

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ClpY 蛋白質具有一個保守性的 AAA-2 module，為 ATPase，主要負責辨識 基質，水解ATP 協助 ClpQ 打開六元環的窄小孔洞，從原先的 10 Å 擴張至 19.3 Å (Wang et al., 2001)，並將基質蛋白之結構打開後，透過孔洞傳送至 ClpQ 活 性中心，分子量約49 kDa。

ClpY 單體具有三個區塊 (domain)分別為 N、C 及 I domain：N domain 有 197 個胺基酸 (2-109 及 244-332 a.a.)，此區域具有為 ATP 結合位及運送基質的 pore site，負責結合 ATP 並水解之，並透過 ClpY6 中心孔洞周圍之G⁹⁰Y⁹¹V⁹²G⁹³ pore site 將基質送入中心孔洞；C domain 為 111 個胺基酸組成 (333-443 a.a.)，在 結合ATP 後產生形變而伸出 C 端末十個胺基酸與 ClpQ 產生交互作用，促使中 央孔洞放大；而I domain 介於 N、C domain 之間 (110-243 a.a.)，其結構鬆散而 突出於N、C domain 之外，在具有 AAA-2 同源序列的 ATP 依賴型蛋白酶中，

此段序列是專屬於ClpY 獨有的結構(附圖一) (Bochtler et al., 2000; Gur et al., 2013)，I domain 上的環狀結構 loop 1 & loop 2 被認為與基質之辨識結合有關 (謝, 2012)。

ClpY6Q12 複合體

ClpY 於 ATP 存在下能夠形成六元環 (ClpY6)，ClpQ 在有無 ATP 下皆能形 成六元環 (ClpQ6) 並再堆疊成十二元環 (ClpQ6Q6)，生理狀態下最終以 ClpY6Q12

的桶狀形式存在。前述之大腸桿菌 ATP 依賴型蛋白酶，如 Lon、FtsH、ClpAP 及ClpXP 亦先形成環狀構造，再堆疊成桶狀構造，顯示此構型是 ATP 依賴型蛋 白酶一大特徵。在電子顯微鏡下 ClpY 與 ClpQ 形成 ClpY6Q12 的桶狀構造 (Rohrwild et al., 1996)。結晶結構 (PDB：1G3I) 同樣展示 ClpYQ 蛋白酶以 ClpY6Q12Y6 的形式存在(如圖一) (Sousa et al., 2000)，複合體外圍的 ClpY6 以藍 色及綠色標示，其中夾著以紅色及黃色的 ClpQ6Q6。以上可知，在 ATP 存在下 形成六元環的能力，對於ClpYQ 蛋白酶複合體之組成及其功能是相當重要的。

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五、 研究動機

針對ClpY 形成六元環之原因，前人研究顯示，ClpY 第 408 個胺基酸酪胺 酸 (Y) 對於 ClpY 六元環的形成有顯著影響，突變蛋白 ClpY Y408A 不論在有 無ATP 或是 ClpQ 的存在下，ClpY 幾乎無法形成六元環 (Hsieh et al., 2011)。

而序列比對指出，Y408 無論在原核或真核生物中均具有高度的保守性(附圖二、

三，箭頭所指) (Couvreur et al., 2002; Ruiz-Gonzalez & Marín, 2006) 。本研究探討 此胺基酸 Y408 對於 ClpY 形成六元環之影響。觀察 ClpY 結晶結構後，假設 Y408 胺基酸之側基大小是影響的關鍵因子。以此出發，建構一系列的側基由小 到大的點突變蛋白，純化後觀察ClpY 形成六元環的能力，另外在胞內實驗中，

加入ClpYQ 基質 SulA 測試 ClpYQ 蛋白酶是否因 ClpY 不易形成六元環而使蛋 白酶活性降低，以確認大腸桿菌 ATP 依賴型蛋白 ClpY 形成六元環之關鍵胺基 酸及其影響因子。

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貳、 材料與方法

一、 實驗材料

(一) 菌株與質體

本研究使用之菌株與質體如表一、表二所示

選殖基因表現系統

以大腸桿菌菌株AC3112 (lon^- clpY^- clpQ^-) 作為選殖基因表現的宿主細 胞，而選殖基因表現之載體為pBAD24、pBAD33 及pTH18kr。其中pBAD24 和pBAD33具有ara operon 的啟動子PBAD 及調控基因araC，故可利用阿拉伯 醣 (L-arabinose)誘導目標基因的表現 (Guzman et al., 1995)。而pTH18kr 質 體在一細菌中的數量約3-5個，帶有啟動子Plac，以IPTG (Isopropyl-β-D-1- thiogalactopyranoside) 誘導下游基因表現 (Hashimoto-Gotoh et al., 2000)。

蛋白質純化系統

大腸桿菌菌株BL21 (DE3) 為 BL21 品系內帶有 DE3 lysogen 之突變株。

DE3 lysogen 內含有受 Plac 調控之T7 RNA polymerase 基因。當以 IPTG 誘 導T7 RNA polymerase 的表現後，T7 RNA polymerase 會選擇性地轉錄受強 力啟動子 T7 promoter 調控之基因。進一步將 BL21 (DE3) 染色體上之 clpY 及 clpQ 基因進行剔除後，作為純化 ClpY 及 ClpQ 蛋白質之宿主細胞，而 clpY 及 clpQ 基因表現之載體為 pET21a。於 clpY 5’ 融合 6x His-tag 以方 便純化，限制酶切位為5’NdeI 及 3’HindIII 將帶有 6x His tag 的目標基 因片段送入pET21a 後，利用其帶有之 T7 promoter，得以被宿主誘導表現之 T7 RNA polymerase 辨識，進一步於細胞內累積帶有 ClpY 及其突變株之目 標蛋白，以用於後續之蛋白質胞外實驗。

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(二) 藥品與試劑

1.培養基

LB (Luria-Bertani) 購自 BD Biosciences (U.S.A.)，用於一般大腸桿菌培 養，並加入適量抗生素以篩選轉形株。抗生素濃度分別為 Ampicillin (100 mg/ml)、Kanamycin (25 mg/ml)、Chloramphenicol (34 mg/ml)；使用時以 1：

1000 倍率稀釋使用。本論文中，一般大腸桿菌培養於 37℃，菌株 AC3112 則培養於30℃。

2.藥品、酵素及相關套組

藥品購自Sigma (St. Louis, U.S.A.)、J.T. Baker (Phillipsburg, U.S.A.) 及生工 公司(台北，台灣)。

限制酶、接合酶購自TaKaRa (Kusarsu, Japan) Plasmid DNA 純化套組

Mini-MTM Plasmid DNA Extraction kit (Viogene，富聯生物科技公司) Gel-MTM Gel Extraction kit (Viogene，富聯生物科技公司)

Gel/PCR DNA Isolation kit (Viogene，富聯生物科技公司) 蛋白質純化套組

Ni Sepharose™ 6 Fast Flow (GE Healthcare, U.S.A.) Ultra-15 Centrifugal Filter Devices (Amicon, U.S.A.)

3.核酸引子

ClpY 引子在 pBAD24 之 5’ 帶有 EcoRI 切位而在 3 端帶有 HindIII 切 位；在pET21a 之 5’ 帶有 NdeI 切位與加入 6xHis-tag 以便於純化，而在 3’ 為

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HindIII 切位。核酸引子由基龍米克斯合成，詳見表三。

(三) 器材設備

微量離心機 (Kubota KM-15200，雙鷹公司，台北，台灣)。

冷凍超高速離心機 (CF 15D2, Hitachi, Japan)。

DNA 電泳槽 (major science, U.S.A.)。

蛋白質電泳槽 (Amersham, CA, U.S.A.)。

分光光度計 (Ultraspec 2000, Pharmacia, H.K.)。

全波長掃描式微盤分析儀 (SpectraMax 340PC³⁸⁴ , CA, U.S.A.)。

超音波破碎機 (Vibra-Cell^TM, U.S.A.)。

膠體照相系統G:BOX (Syngene, U.S.A.)。

蛋白質電泳槽 (Major Science, U.S.A.)

(四) 分析軟體

GeneSnap v. 6.08 (Syngene, U.S.A.)。

BioEdit Sequence Alignment Editor (BioEdit) v. 7.0.9.0。

Image J v.1.60 from NIH (National Institute of Health, U.S.A.)。

The PyMOL Molecular Graphics System V 1.3 (Schrodinger LLC.)。

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二、 方法

(一) 目標基因選殖

1.質體製備

Mini-preparation of plasmid DNA from bacteria (小量製備)

相關 Kits 購買自 Viogene，詳細實驗步驟參考套組之使用手冊。

2. 勝任細胞製備 (氯化鈣法)

1. 於 37℃ 培養箱中培養隔夜菌體 (12-16 小時)。

2. 取 1 ml 菌液繼代於 100 ml LB 培養液，於 37℃ 下重新震盪培養 菌體至OD600 吸光值為0.4-0.8。

3. 將菌液平均分裝至兩支離心管，冰浴 10 分鐘。自此步驟起均保持 低溫操作。

4. 以 6000 rpm 在 4℃ 下，離心 10 分鐘，移除上清液。

5. 每管以 1-2 ml 冰 0.1 M CaCl2 懸浮菌體，再加入3-5 ml 冰 0.1 M CaCl2混勻，冰浴30 分鐘。

6. 以 4000 rpm 在 4℃下，離心 10 分鐘，移除上清液。

7. 重複步驟 5-6。

8. 每管加入 1 ml 冰 0.1 M CaCl2 / 15% glycerol 懸浮菌體。

9. 每100 μl 菌液分裝至菌種保存管中，儲存於－80℃ 冰箱。

3. 轉形作用

E. coli Heat shock transformation

1. 取 50 μl 勝任細胞與 20 μl 質體接合反應 (ligation) 之產物，或 5 μl

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小量製備的質體混合後，冰浴一小時。

2. 於 42℃下，進行熱休克反應兩分鐘後，迅速置於冰上兩分鐘。

3. 加入 1 ml LB 液態培養基，於 37℃ 培養箱中震盪培養一小時。

4. 以 6000 rpm 離心 10 分鐘，移除上清液，留下約 50 μl 懸浮菌體。

5. 塗於含適當抗生素的培養基上，置於 37℃培養箱培養隔夜。

TSS -Transformation

1. 取 30 μl 隔夜培養菌液，繼代於 3 ml LB 液態培養基中，震盪培養 菌體至OD600 吸光值為 0.6-0.8。

2. 將菌液以 3000 rpm，離心十分鐘，移除上清液。

3. 加入 0.3 ml 2X TSS 溶液將菌體懸浮，加入 5 μl 小量製備的質體混 合後，冰浴一小時。

4. 以 37℃下，進行熱休克反應兩分鐘後，迅速置於冰上兩分鐘。

5. 加入 0.5 ml LB 液態培養基，於 30℃培養箱中震盪培養一小時。

6. 以 6000 rpm 離心五分鐘，移除上清液，留下約 50 μl 懸浮菌體。

7. 塗於含適當抗生素的培養基上，置於 30℃培養箱培養隔夜。

4. 建構點突變蛋白

以pET21a ClpY 作為模板，利用突變引子對 fw 及 rv 分別與 clpY 3’ 及 5’ 引子做第一次 PCR (polymerase chain reaction) 增幅(表三)。所得之產物以 套組回收後，混合兩種片段作為新模板，以 clpY 3’ 及 5’ 引子做第二次 PCR，

2XTSS (Transformation and storage solution) 4℃保存

PEG 8000 (Polyethylene glycol 8000) 20.0 g

1 M MgSO4 4.0 ml

加 LB 至總體積 190 ml，滅菌後再加入 190.0 ml DMSO (Dimethyl sulfoxide) 10.0 ml

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所得二次產物同樣以套組回收後，利用限制酶截切，和以相同限制酵素截切 製備之載體進行接合反應，再轉形至 E. coli XL1Blue 中進行初步篩選，最後 萃取出質體經定序確認正確。

PCR 增幅反應

Total 50.0 μl

PCR 反應條件

Denaturation 94℃： 10 min Denaturation 94℃： 1 min 30s Annealing 48℃~55℃： 1 min Extension 72℃： 1 min 30s Extension 72℃： 10 min Stop 4℃： stop

＊Annealing 溫度依照引子的不同而有所差異，為 Tm 值減 5 度。

PCR 產物純化

將PCR 產物以 Viogene Gel/PCR DNA isolation kit 回收。

限制酶截切反應 (Digestion)

取適量質體或 PCR 回收產物，加入選用之限制酶及其配合之緩衝液混 Template

10X Prime buffer dNTP (10 mM) Forward primer (5μM) Reversed primer (5μM) Prime DNA polymerase ddH2O

1.0 μl 5.0 μl 1.0 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 40.5 μl

30 cycles

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合均勻，於37℃水浴槽內反應，時間約 60 分鐘。反應完成後加入適量的追 蹤染劑，進行DNA 瓊脂電泳。

DNA 瓊脂膠體 (Agarose gel)電泳

以 1X TAE 緩衝液配製 1.0% 的瓊脂膠體，以 100 伏特之電壓進行電泳。

反應35 分鐘後，利用 Ethidium Bromide (EtBr) 進行外染，經退染後再以紫 外光觀察DNA 產物。

回收電泳膠體之 DNA

進行 DNA 瓊脂膠體電泳，並經 EtBr 染色及退染後，使用長波長之紫 外光源 (365 nm)，觀察 DNA 產物片段大小，並挖取欲回收之片段位置，使 用 Viogene Gel - M Gel Extraction kit 回收 DNA。

50X TAE buffer

Tris base 242 g

Glacial acetic acid 57.1 ml

0.5 M EDTA (pH 8.0) 100 ml

加水至總體積為1 L，保存於室溫，使用前稀釋至 1X。

接合反應

透過接合酶將以相同限制酶截切製備而得之基因片段及載體接合，於 16℃ 下反應 14~16 個小時，反應後保存於 4℃。

接合反應 (Ligation)

Vector DNA 3.0 μl Insert DNA 13.0 μl 10X ligation buffer 2.0 μl

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Total 20.0 μl 選殖質體篩選及確認

將接合反應的反應物以前述轉形作用的方式轉形至 E. coli. XL1Blue 中，

並塗抹於含適當抗生素之培養基上，以篩選具有質體的菌落。重新於菌體中 純化出質體，並以適當的限制酵素截切，經瓊脂膠體電泳分析，初步確認 DNA 片段分子量大小，最後將萃出之質體委由基龍米克斯進行定序。

(二) 蛋白質純化

His-tag 蛋白質純化

1. 將N 端帶有 6xHis-tag 之 clpY 及其於突變株送入 pET21a 中，並於大 腸桿菌菌株BL21 (DE3) clpY^-Q^- 中表現並加以純化。

2. 於30℃培養箱中隔夜培養菌體。

3. 將隔夜培養菌液以1:100 繼代於含適當抗生素之 200 ml LB 液態培養 基中，盪培養菌體約 2 小時，至 OD600吸光值為0.4。

4. 加入終濃度1 mM 之 IPTG，以誘導目標蛋白質表現，再繼續震盪培 養4 小時。

5. 於4℃以 4000 rpm 離心 15 分鐘，移除上清液。

6. 以8 ml 冰的 wash buffer 懸浮菌體。視菌量多寡調整 buffer 量。

7. 在冰上以超音波震盪器(震盪 1 秒後暫停 1 秒，持續 2 分鐘後，於冰 上靜置1 分鐘) 將細胞打破。

8. 於4℃以 10,000 rpm 離心 30 分鐘，取上清液備用。

9. 取1 ml Ni Sepharose™ 6 Fast Flow (GE Healthcare) 到乾淨之管柱中，

以10 ml wash buffer 流洗平衡 resin。

10mM ATP 2.0 μl T4DNA Ligase (TaKaRa) 1.0 μl

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10. 將上清液通過平衡完畢之管柱。

11. 以 10 ml wash buffer 流洗 resin，去除非專一性結合之雜質。

12. 以 5 ml elution buffer 流洗 resin，使結合於 resin 上之目標蛋白溶出，

並收集通過管柱滴下之液體。

13. 以 5 ml dH2O 流洗 resin，使 resin 與 elution buffer 中之咪唑 (imidazole)間結合力下降，以去除 elution buffer。

14. 以 10 ml wash buffer 流洗 resin，重新平衡鹽離子濃度，再把清洗完畢 之resin 保存於 4℃。

15. 於步驟 11 收集而得之產物，取 20μl 與同體積之 2X SDS sample buffer 混合，於 100℃加熱 10 分鐘，待其冷卻後以 SDS-PAGE 觀察 結果。

5X Wash buffer

NaH2PO4 3.0 g

NaCl 8.7 g

H2O 150 ml

先溶解後，再加水至總體積為 200 ml，保存於 4℃ 200 ml 需要時先稀釋至1X，並調整其 pH 至 7.0，置於冰上備用。

Elution buffer (pH 7.0)

NaH2PO4 0.6 g

NaCl 1.74 g

Imidazole 2.72 g

H2O 150 ml

溶解後，pH 調至 7.0，再加水至總體積為 200 ml，保存於 4℃ 200 ml

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蛋白質濃縮

選定適合分子大小 (50 kDa) 的蛋白質濃縮過濾器 (Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Devices, Milipore)，以低溫離心的方式進行蛋白質濃縮，濃 縮後以大量storage buffer 置換原本的 elution buffer，體積比為 1：30，此步 驟重複兩次以確保緩衝液置換完全。最後以微量吸管將蛋白溶液自濃縮過濾 器中取出。

蛋白質定量

使用Bradford 法，將蛋白質標準品牛血清蛋白 (BSA) 依所需要之濃度 稀釋，在96 孔盤中加入 Bradford 試劑 200 μl 混合均勻，在室溫下放置 10 分鐘，以分光光度計測吸光值 A595 繪製標準曲線，再將待測樣品值代入公 式計算濃度。

蛋白質保存

蛋白質所存在之緩衝液置換成利於蛋白質保存之storage buffer，使用濃 縮管來進行緩衝液置換。

Storage buffer

2X SDS sample buffer

10% SDS 20.0 ml

Glycerol 10.0 ml

β-mercaptoethanol 5.0 ml

1.0 M Tris-HCl (pH6.8) 6.25 ml

Bromophenol blue 1.25 mg

加水至總體積為 50 ml，保存於室溫 50 ml

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0.5M HEPES 5.0 ml

1.0M MgCl2 1.0 ml

1.0M DTT (Dithiothreitol) 25.0 μl

65% Glycerol 7.7 ml

NaCl 0.88 g

H2O 25 ml

先溶解後，調整pH 至 7.4，再加水至總體積為 50 ml

(三) SDS 蛋白質膠體電泳

SDS-PAGE

含粗萃蛋白的SDS-PAGE 樣品溶液於 12.5%的 SDS-PAGE 膠片中進行 蛋白質電泳，視蛋白質分子量大小選擇適當的膠體濃度。用來檢查蛋白質純 化程度，蛋白質定量精準度。

1. 鑄膠，適當隔絕空氣，避免膠體乾裂。

2. 100 伏特電泳十分鐘。

3. 再 120 伏特下電泳約兩小時，視蛋白質泳動速率決定電泳時間。

4. 電泳後將膠片以清水泡洗，去除 SDS。

5. 染色並脫色後，以 G:BOX 膠體照相系統建檔保存。

SDS-PAGE 電泳膠片 (12.5%) Running gel Stacking gel

H2O 3.3 ml 3.4 ml

30% Acrylamide 4.0 ml 0.83 ml 1.5M Tris (pH 8.8) 2.5 ml 0 ml 1.0M Tris (pH 6.8) 0 ml 0.63 ml

10% SDS 0.1 ml 0.05 ml

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10% APS 0.1 ml 0.05 ml

TEMED 0.004 ml 0.005 ml

此份量約可配製 0.75 mm 厚 10 X 7 cm 的膠片兩片。

30% 丙烯醯胺液 (Acrylamide)

40% Acrylamide / Bisacrylamide 75 ml

H2O 25 ml

加蒸餾水至100 mL，保存於 4℃。

5X 電泳槽緩衝液 (Chamber buffer)

Tris base 15.0 g Glycine 72.0 g SDS 5.0 g

先以800 ml 蒸餾水溶解並調整 pH 至 8.3，加水至 1000 ml，保存於室溫。

使用時稀釋至1X。

APS 溶液 (Ammonium persulfate)

APS 50.0 mg 加滅菌水0.5 ml 溶解。每次使用前新鮮配置。

SDS-AGE

用來檢視聯結蛋白之分子量大小。含聯結蛋白的樣品溶液於 3% 的 SDS-AGE 膠片中進行蛋白質電泳，160 伏特電泳 90 分鐘。以 agarose 取代 Acrylamide/ Bisacrylamide，具備多種好處：可使用較少量之樣品，得到較清 晰的色帶，且電泳時間較短，所需電壓也較小。採取水平電泳，膠體的厚度 決定可以乘載的樣品體積，以150 ml 為例，可乘載 25 μl 的樣品。

1. 當溶解洋菜顆粒以微波爐加熱時應避免溶液溢出，加熱後靜置一段 時間，待氣泡消減再倒入鑄膠槽中。採用14*15 cm²的鑄膠槽。

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2. 160 伏特電泳 90 分鐘，視蛋白質泳動速率決定電泳時間。

3. 電泳後將膠片以清水泡洗，去除 SDS。

4. 染色並脫色後，以 G:BOX 膠體照相系統建檔保存。

SDS-AGE 電泳膠片(3%) Running gel

TAE beffer 150 ml

Agarose 4.5 g

10% SDS 0.1 ml

(四) 蛋白質聯結測試 (cross-linking analysis)

為了解ClpY 蛋白的生理狀態，以緩衝液模擬生理環境，並加入 ATPγS 模仿ATP 分子，藉由戊二醛 (glutaraldehyde) 兩端之醛基，將兩個氨基以共 價鍵聯結起來，如此便可以將ClpY 蛋白質在此模擬環境中的生理狀態固定。

在此，以蛋白質膠體電泳將大小不同的蛋白質分開來，以分子量判定 ClpY 蛋白質形成六元環或其他多元體的狀況。

1. 將 ClpY (6 μM)、ClpQ (6 μM) 與 1 mM ATPγS 加入 degradation buffer 中，總體積為 40 μl。ATPγS 應統一最晚加入。

2. 於 37℃ 水浴槽中培養五分鐘。

3. 加入戊二醛，使反應液戊二醛終濃度為 0.4%。加入時需強力震盪 均勻。

4. 於 37℃ 水浴槽中再培養 20 分鐘進行聯結反應。

5. 加入 10 μl 2XE SDS-PAGE sample buffer。

6. 進行蛋白質膠體電泳 (SDS-AGE)。

4X Degradation buffer

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0.5 M HEPES 80 ml

1.0 M MgCl2 4.0 ml

1.0 M DTT（Dithiothreitol） 0.4 ml

0.5 M EDTA 0.8 ml

H2O 50 ml

先溶解後，再加水至總體積為 100 ml，保存於 4 ℃ 100 ml

(五) 細菌生理活性分析

本 實 驗 中 以 5’EcoRI 及 3’HindIII 將 clpY 及 其 突 變 株 建 構 於 pBAD24，並共轉形入 pBAD33 ClpQ 及 pTH18kr HA-SulA 或 pTH18kr 3xFLAG-SulA，細菌生長時以阿拉伯糖大量誘導 ClpYQ 蛋白質，以 IPTG 誘 導tag-SulA，觀察生長於盤上之表現型。

1. 於大腸桿菌 AC3112 中共轉形 pBAD33 ClpQ、pBAD24 ClpY 或其 突變株及pTH18kr HA-SulA 或 pTH18kr 3xFLAG-SulA。以 pBAD33 ClpQ、pBAD24 及 pTH18kr HA-SulA 或 pTH18kr 3xFLAG-SulA 作 為質體控制組。

2. 隔夜培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm、1/2 Kan 的 LB 培養基中。

3. 當日，測定 OD600，取同樣濃度之菌液繼代培養。

4. 繼代培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm、1/2 Kan 的 LB 培養基中，並額 外加入終濃度0.5% 之阿拉伯糖。

5. 30 ℃ 培養至 OD600 為0.2，加入終濃度 1mM IPTG 誘導 HA-SulA 表現。

6. 加入 IPTG 後 2 小時，取 10 μl 菌液於 96 孔盤中，利用八爪為量分 注器，以M9 minimal medium 序列稀釋菌液至 10^-8，滴於1/2 ACK 盤

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上培養於30 ℃。

7. 培養一天後掃描存檔。

(六) 細菌液態培養密度測定

本 實 驗 中 以 5’EcoRI 及 3’HindIII 將 clpY 及 其 突 變 株 建 構 於 pBAD24，並共轉形入 pBAD33 ClpQ，細菌生長時以阿拉伯糖大量誘導 ClpYQ 蛋白質，觀察 ClpYQ 蛋白質對細菌密度之影響。

1. 共轉形 pBAD33 ClpQ、pBAD24 ClpY 或其突變株於大腸桿菌 AC3112 中。

2. 隔夜培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm 的 LB 培養基中。

3. 當日，測定 OD600，取同樣濃度之菌液繼代培養。

4. 繼代培養於含有 1/2 Amp、1/2 Cm 的 LB 培養基中，並額外加入終 濃度0.5% 之阿拉伯糖。

5. 30℃ 培養 24 小時 6. 測量 OD600 讀值。

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參、 結果

一、 以軟體預測影響六元環形成之成因

本研究欲了解 ClpY 蛋白形成六元環之因素。由於前人研究顯示，ClpY 第 408 個胺基酸酪胺酸 (Y408) 對於 ClpY 六元環的形成有顯著影響，野生型蛋白 於ATP 存在下能夠形成六元環；但是突變蛋白 ClpY Y408A 不論在有無 ATP 或 是ClpQ 的存在下，形成六元環的能力都較野生型蛋白為差 (Hsieh et al., 2011) 。 而ClpY 胺基酸序列比對中，Y408 的位置不論在原核或真核生物中皆為高度保 守性 (Couvreur et al., 2002; Ruiz-Gonzalez & Marín, 2006) 。因此先以電腦軟體檢 視ClpY 蛋白的結晶結構，並聚焦於 Y408 胺基酸。

圖一為PyMol V. 1.3 版本檢視蛋白質結晶結構 1G3I 的卡通圖 (Sousa et al., 2000)，ClpY6Q6Q6Y6 中兩組 ClpY6 分別為藍色及綠色在啞鈴形桶狀構造之蛋白 酶外圍，而ClpQ6Q6 則是內部之淡黃色及紅色六元環。大腸桿菌ClpY 蛋白結晶 結構為1E94 (圖二) (Song et al., 2000)，將 ClpY 單體 N domain 標示成綠色，C domain 標示成橘色，I domain 標示成淺藍色。由於 I domain 上的 loop 2 經研 究顯示為基質結合區 (謝, 2012)，其結構較為鬆散而無法在結晶結構下觀察到構 型，因此以Adobe Photoshop CS3 加上淡紫色虛線示意線(圖二)。附以仰視角度 觀察ClpY6 示意圖(如圖三，綠色為 N domain，橘色為 C domain)，則可以發現 相鄰之ClpY 蛋白是以 ClpY#1 C domain 與 ClpY#2 之 N domain 相鄰。聚焦於 ClpY#1 Y408 及其附近之胺基酸(圖四 A)，可發現相鄰之 ClpY#2 R7 及 ClpY#2 R25 (淡藍色) (R, arginine, 精胺酸) 將 Y408 (綠色) 包夾於其中，經 PyMol 測量 R25 與Y408 兩個胺基酸相當靠近，其側基上任意碳原子核最近為 3.7 Å 最遠為 5.0 Å，

且R25 與 Y408 不論在 ATP (圖四 A)或 ADP (圖四 B) 狀態下都相當接近，又 Y408 胺基酸側基為非極性的苯環，且 R25 胺基酸側基之碳鏈亦較其他胺基酸

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為長，因此推測 R25 與 Y408 間有非極性之凡得瓦爾力，協助 ClpY 形成六元 環。以側視角度觀察ClpY 蛋白單體表面構造(圖五)，相較於附近其他的胺基酸，

R7、R25 及 Y408 凸出於 ClpY 單體外，R7 與 R25 甚至形成小孔構造，此構 造可能用來嵌合Y408。

綜合以上，推測因為 Y408 之胺基酸側基較大，能與 R25 產生足夠的凡得 瓦爾力鍵結，為ClpY 形成六元環穩定力量之一。故以二次 PCR 的方式，選殖 ClpY 點突變株，測試 Y408 之胺基酸側基對 ClpY 六元環之形成及 ClpYQ 蛋 白酶活性之影響。本次研究挑選非極性胺基酸，側基由小到大共選殖 Y408V、

Y408L、Y408M 與 Y408W 之單突變蛋白及 R25A/Y408A 雙突變蛋白，另建構 Y40C，此胺基酸側基為小的極性胺基酸，加上前人建構之 Y408A，將作為本次 實驗的主要材料。利用 PyMol 中 Mutagenesis 功能預測上述點突變胺基酸在 ClpY 結晶結構中與鄰近胺基酸 R25 的相對位置，如圖六所示。

二、 確認 ClpY 及其突變株之六元環形成能力

利用親和性膠體純化 ClpY 及其突變蛋白(如圖七)，更換緩衝液並濃縮後，

以Braford 法測定蛋白質濃度，最後取定量 6 μM 的 ClpY 蛋白質，以 SDS-PAGE 檢驗定量取量是否正確(如圖八)。確認步驟完成後，同樣取定量 6 μM 的 ClpY 蛋 白質，並培養於degradation buffer 中，加入 ATP 類似物 ATPγS，ATPase 無法 水解 ATPγS，使得 ClpY 的生理狀態維持在 ATP 存在時的構型，以戊二醛 (glutaraldehyde) 將此生理狀態之構型固定，並進行 SDS-AGE 膠體電泳，以分子 量大小確認ClpY 及其突變蛋白形成六元環之能力。

如圖八及圖九所示，將蛋白質聯結後，可以看到ClpY Y408C (圖九 lane 5-8) 及ClpY Y408L (圖十 lane 5-8) 不論在有無 ATPγS 或是 ClpQ 的狀況下，形成六 元體的能力皆較野生型蛋白為差 (圖九 lane 1-4、圖十 lane 1-4)，且多以單體及 雙體 (ClpY2) 的形式存在；而 ClpY Y408W (圖九 lane 9-12) 則在有 ATPγS 的狀

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態下有較野生型好的結合能力，符合色胺酸 (W) 側基比酪胺酸 (Y) 側基大的趨 勢。另外建構之雙突變蛋白ClpY R25A/Y408A，是將靠近 Y408 的 R25 之側基 也縮小，試著了解是否對六元環的形成有影響，結果顯示(圖十 lane 9-12)，ClpY R25A/Y408A 在有 ATPγS 以及 ClpQ 的狀態下都無法形成六元體，幾乎所有蛋 白都在雙體 (ClpY2) 形態出現。

使用Image J v.1.60 測量突變蛋白六元環之量。若野生型蛋白為 100%，則 突變蛋白Y408C、Y408L、Y408W、R25A/Y408A 依序為 45.0 %、67.9 %、153

%、32.1 %，符合先前預測趨勢，即當胺基酸側基愈小，則 ClpY 形成六元環的 能力便愈弱。推測可能成因是，側基愈小與鄰近胺基酸產生之凡得瓦爾力愈弱，

因此愈難形成六元環。

三、 胞內 ClpYQ 蛋白酶生理活性測試

桶狀構造對於ClpYQ 蛋白酶分解基質是必須的，利用前人建構之 pTH18kr HA-SulA，並依序將 pBAD33 ClpQ 及 pBAD24 ClpY 共同轉形至 AC3112 (lon^- clpYQ^-) 中，因為 SulA 同樣是 Lon 之基質，需要將 lon 移除才能確認細菌之表 現型，是否為ClpYQ 蛋白酶活性所造成的影響。在 HA-SulA 大量誘導下，大腸 桿菌無法分裂，從而抑制細胞生長。若ClpYQ 蛋白正常作用，在大量表現下能 夠使得細菌正常生長，然而 in vitro 的實驗中，某些 ClpY 突變株形成六元環的 能力較差，此處實驗將測試形成ClpY 六元環的能力是否影響 ClpYQ 蛋白酶的 活性，從而顯現於生長與否的表現型。

把pBAD33 ClpQ、pTH18kr HA-SulA 及 pBAD24 ClpY 與其突變型，依序共 轉形至大腸桿菌AC3112 中。培養於適當培養基中，並加入終濃度 0.5% 之阿拉 伯糖，培養至OD600 為0.2 時，加入終濃度 1mM IPTG 誘導 HA-SulA 表現，此 SulA 具有生理活性，若沒有被 ClpYQ 分解，則會抑制細胞分裂。加入 IPTG 後 2 小時，序列稀釋菌液至 10^-8，滴於1/2 ACK 盤上，培養於 30℃。

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如圖十一所示，由上到下之ClpY 基因型分別為野生型(Wt)、質體控制組 1(S)、

質體控制組2 (QS)、R25A/Y408A (AA)、Y408A (A)、Y408C (C)、Y408V (V)、

Y408L (L)、Y408M (M) 及 Y408W (W)。質體控制組 1 (S) 中的基因型為 pBAD33、

pBAD24 及 pTH18kr HA-SulA，質體控制組 2 (QS) 的基因型為 pBAD33 ClpQ、

pBAD24 及 pTH18kr HA-SulA。圖十一左是培養兩小時尚未添加 IPTG 誘導 HA-SulA 表現之控制組，圖十一右為添加 IPTG 誘導 HA-SulA 表現兩小時之實 驗組。

圖十一左可以觀察到尚未以 IPTG 誘導 HA-SulA 時，細菌的生長並不會受 到大量誘導ClpYQ 的影響，ClpY 野生型蛋白及突變株都能夠生長至 10⁸。圖三 右全體之生長狀態依序為Wt：10⁸、S：10⁶、QS：10⁶、AA：10⁵、A：10⁶、C：

10⁶、V：10⁶、L：10⁶、M：10⁷ 及 W：10⁸，其趨勢如同側基大小，若側基愈大，

則細菌生長狀態愈好，代表ClpYQ 蛋白酶之活性愈好。綜合以上結果顯示，ClpY 第408 個胺基酸的側基大小，漸進的影響了 ClpY 六元環的形成及其活性。然而，

AA 雙點突變株的生長甚至較質體控制組 1、2 為差，暗示著有另外的機制在影 響細菌之生長。

四、

利用前人建構之pTH18kr 3xFLAG-SulA 作為 ClpYQ 蛋白酶之基質，前人利 用 3xFLAG-SulA 作為基質以西方氏點墨法研究 ClpYQ 與基質的關係(陳, 2010) 。然而此基質在大腸桿菌 AC3112 中並沒有如 HA-SulA 顯著之生理活性，

如圖十二A 所示，質體控制組 (QS) 所帶的基因型為 pBAD33 ClpQ、pBAD24 及 pTH18kr 3xFLAG-SulA，在 IPTG 誘導下，細菌生長並沒有受到影響。故以此作 為ClpYQ 蛋白酶之基質，研究 ClpY 六元環之形成能力並與基質共存時，是否 影響細菌的生長情形。

結果如圖十二B 所示，由上至下分別為野生型 (Wt)、Y408A (A)、Y408C (C)、

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Y408V (V)、Y408L (L)、Y408M (M) 、Y408W (W) 及 R25A/Y408A (AA)。圖十 二B 左顯示若大腸桿菌 AC3112 中不帶有 pTH18kr 3xFLAG-SulA，只以阿拉伯 糖大量誘導ClpQ 及 ClpY 或突變株，對於細菌之生長並不會受到影響。然而當 以阿拉伯糖大量誘導 ClpQ 及 ClpY 或突變株，並以 IPTG 誘導帶有 pTH18kr 3xFLAG-SulA 之大腸桿菌時，AC3112 的生長表現型隨著 ClpY 蛋白形成六元 環的能力成正相關，換句話說，ClpY 形成六元環的能力愈差者，細菌的生長能 力愈差。生長狀態依序為Wt：10⁸、A：10⁶、C：10⁶、V：10⁶、L：10⁶、M：10⁷ 、 W：10⁸ 及AA：10⁴。顯示ClpYQ 蛋白酶與基質共同存在時，ClpY 六元環形成 的能力，與細菌生長狀態成正相關。

五、

若以液態培養基培養 AC3112 pBAD33-ClpQ pBAD24-ClpY 及其突變株而 不含有pTH18kr 3xFLAG-SulA，以阿拉伯糖大量誘導 ClpYQ，並記錄其 24 小時 停滯期 (stationary phase) 的 OD600 讀值。此時菌體內仍有少量ClpYQ 之基質，

如 RpoH 等已知或未知的基質。結果如圖十三所示，若誘導 ClpY 野生型蛋白 (Wt) 與 ClpQ，其 OD600 讀值為4.08，其於突變株依序為 R25A/Y408A (1.84)、

Y408A (2.06)、Y408V (2.28)、Y408L (2.49) 及 Y408M (2.94)。此觀察顯示 ClpY 六 元環的形成能力，會略為影響大腸桿菌AC3112 在液態培養基中的細菌密度，而 ClpY 形成六元環的能力愈強，則液態培養中的細菌密度愈高。

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肆、 討論

本研究以純化蛋白質操作之胞外聯結反應，以由小到大之胺基酸點突變證明 Y408 之側基大小是 ClpY 蛋白質在 ATP 存在下形成六元環之關鍵。相較於其他 胺基酸，酪胺酸及精胺酸的側基是較大的，推測較大的胺基酸側基能夠形成較足 夠的凡德瓦爾力，與鄰近的單體產生交互作用；亦可能是Y408 苯環中的極性區 域吸引了鄰近帶正電之R7 及 R25，從而造成小孔洞的產生(如圖五)，接著嵌合 住Y408，以牢固 ClpY 之六元環。

由上述延伸，希望了解ClpY 六元環形成與否，以胞內試驗觀察其對細菌之 生理活性之影響。利用具抑制細菌生長之 HA-SulA 蛋白，測試 ClpYQ 蛋白酶 之活性，能夠觀察到與胞外聯結試驗相同的趨勢，當ClpY 側基愈小，細菌生長 的能力愈差，推論是因為 ClpY 無法形成六元環，導致細菌中的 HA-SulA 蛋白 沒有辦法被 ClpYQ 蛋白酶分解，因此抑制細菌生長。但是雙點突變株 (ClpY R25A/Y408A)之生長狀況比質體控制組略差，暗示除了因 SulA 本身抑制細菌生 長外，無法形成六元環的ClpY 與基質會造成其他機制影響細菌之生長。

因為 3xFLAG-SulA 不具抑制細菌生長的活性，故以此作為 ClpYQ 蛋白酶 基質時，可觀察ClpYQ 蛋白酶與基質共同存在時對細菌生長之影響。結果細菌 之生長趨勢亦如ClpY 之側基大小成正相關，即是與 ClpY 形成六元環的能力成 正相關，由於3xFLAG-SulA 不具抑制細菌生長的活性，推論當 ClpY 之側基愈 大，則ClpY 愈能形成六元環，也愈能將 3xFLAG-SulA 水解。由於 ClpY 不易 形成六元環時，ClpY 與基質之結合能力是較佳的(尚未發表)。因此推測，ClpY 可 能與基質結合但未分解時，會造成未知的機制使細菌生長受抑制。

若不大量誘導ClpYQ 蛋白酶基質，紀錄液態培養時細菌密度的差異，可觀 察到和 ClpY 側基大小相同之趨勢，如圖十三所示，ClpY 之側基愈大細菌在停 滯期的密度愈高。而此現象無法在序列稀釋滴盤實驗中顯現(如圖十二左)，原因

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應為過程中的序列稀釋，將微量的細菌密度差異減少而無從顯現。

綜合以上，ClpYQ 蛋白酶與其基質共同存在於細菌體時，會造成細菌生長 受到影響，而趨勢恰與ClpY 側基大小，即形成六元環的能力成正相關。不論是 誘導ClpY、ClpQ 及 3xFLAG-SulA 在滴盤實驗中所見相差 1000 倍的生長狀況，

亦或是只大量誘導ClpY 及 ClpQ 時，細菌在液態培養基中細菌密度的些微差異，

皆暗示ClpYQ 蛋白酶與其基質共同存在於細菌體時，會造成細菌生長受到影響，

其趨勢為ClpY 較無法形成六元環時，細菌生長受較大的抑制。此新現象推測是 ClpYQ 蛋白參與未知的調控有關。然而此未知的調控機制尚需更進一步深入之 研究。

本實驗建構之一系列突變株，可用以互相印證以探索ClpY 蛋白在細菌中未 知的角色。由於ClpY 蛋白形成六元環需要 ATP 的參與，若沒有 ATP 存在，ClpY 將以單體及雙體 (ClpY2) 的型式存在於細菌體內，如圖九 (lane 1)。再者，ClpY 蛋白需要水解 ATP 後把基質打開，傳送單一多肽鏈進入中央孔洞，運送基質給 ClpQ 蛋白水解，在 2005 年的報告中，Martin 等人將六個 ClpX 單體建構在同一 條多肽上，在此，ATP 單純被水解而用來解構基質，不需幫助 ClpX 形成六元 環，因為六元環已經由人工生成，並依序利用突變減少其中一個、兩個至五個單 體上ATPase 的能力，確認不論 ClpX 六元環上的具完好 ATPase 之單體有幾個，

ClpXP 分解基質所使用的總 ATP 含量是固定的，而分解效率和 ClpX 六元環上 的完好ATPase 之單體數量成正比 (Martin et al., 2005) 。綜合以上，ATP 對 ATP 依賴型蛋白酶的角色有二：協助六元環的形成及幫助水解基質。

前人以CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) 阻斷 ATP 的合成 以研究ATP 對 ClpXP 分解 RpoS 造成的影響(Peterson et al., 2012) ，因為添加 CCCP 後，細菌無法合成 ATP 可能造成許多生理功能失效，影響層面廣泛，只 能短時間內聚焦於 ATP 對 ClpXP 之影響，長時間觀察便難以確認是 ATP 對 ClpXP 的影響或是 ATP 造成其他影響而改變觀察結果。

完全抑制 ATP 生合成(如加入 CCCP) 對細菌而言是很大的生長限制，若欲

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研究本實驗中發現的新現象，則需要把受ATP 缺乏直接造成的生長限制，與 ATP 缺乏使ClpY 無法形成六元環且與基質共存時，所間接造成的生長限制區分開來。

則可利用雙突變株ClpY R25A/Y408A，因為在 ATPγS 存在下，主要都形成 ClpY2

的形式，其型態相同於缺乏ATP 之野生型 ClpY 蛋白之生理狀態。故可以在 ATP 充足不影響細菌生長下，模擬細菌缺乏 ATP 的狀態，探討 ClpY 蛋白質形成雙 體並與基質共存時，對細菌生長造成之影響，配合一系列側基大小不同之突變株 交互印證，更能確認ClpY 蛋白質形成六元環與否對細菌生長之差異。

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伍、 結論

本實驗針對 ClpY Y408 建構一系列由小到大之點突變，研究此胺基酸對 ClpY 蛋白形成六元環之影響，發現若此胺基酸之側基愈小 ClpY 愈不易形成六 元環。進一步此現象對ClpYQ 生理活性之影響，以會抑制細菌生長的 HA-SulA 作為基質，觀察到細菌生長能力與ClpY 形成六元環的能力成正相關，但在 ClpY R25A/Y408A 這個無法形成六元環的雙突變蛋白菌株中，甚至觀察到比控制組為 差的生長狀況。故以不具抑制細菌生長效果的3xFLAG-SulA 作為基質，同樣觀 察到細菌生長能力與ClpY 形成六元環的能力成正相關，對比控制組可知當有不 易形成六元環之ClpY 及其基質共同存在於細菌體內時，會造成細菌生長受抑制。

液態培養下停滯期的細菌密度亦有相同的趨勢。由以上顯示，ClpY Y408 胺基酸 之側基大小將影響ClpY 六元環之形成，並影響 ClpYQ 蛋白酶之功能。

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