若以液態培養基培養 AC3112 pBAD33-ClpQ pBAD24-ClpY 及其突變株而 不含有pTH18kr 3xFLAG-SulA，以阿拉伯糖大量誘導 ClpYQ，並記錄其 24 小時 停滯期 (stationary phase) 的 OD600 讀值。此時菌體內仍有少量ClpYQ 之基質，
如 RpoH 等已知或未知的基質。結果如圖十三所示，若誘導 ClpY 野生型蛋白 (Wt) 與 ClpQ，其 OD600 讀值為4.08，其於突變株依序為 R25A/Y408A (1.84)、
Y408A (2.06)、Y408V (2.28)、Y408L (2.49) 及 Y408M (2.94)。此觀察顯示 ClpY 六 元環的形成能力，會略為影響大腸桿菌AC3112 在液態培養基中的細菌密度，而 ClpY 形成六元環的能力愈強，則液態培養中的細菌密度愈高。
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肆、 討論
本研究以純化蛋白質操作之胞外聯結反應，以由小到大之胺基酸點突變證明 Y408 之側基大小是 ClpY 蛋白質在 ATP 存在下形成六元環之關鍵。相較於其他 胺基酸，酪胺酸及精胺酸的側基是較大的，推測較大的胺基酸側基能夠形成較足 夠的凡德瓦爾力，與鄰近的單體產生交互作用；亦可能是Y408 苯環中的極性區 域吸引了鄰近帶正電之R7 及 R25，從而造成小孔洞的產生(如圖五)，接著嵌合 住Y408，以牢固 ClpY 之六元環。
由上述延伸，希望了解ClpY 六元環形成與否，以胞內試驗觀察其對細菌之 生理活性之影響。利用具抑制細菌生長之 HA-SulA 蛋白，測試 ClpYQ 蛋白酶 之活性，能夠觀察到與胞外聯結試驗相同的趨勢，當ClpY 側基愈小，細菌生長 的能力愈差，推論是因為 ClpY 無法形成六元環，導致細菌中的 HA-SulA 蛋白 沒有辦法被 ClpYQ 蛋白酶分解，因此抑制細菌生長。但是雙點突變株 (ClpY R25A/Y408A)之生長狀況比質體控制組略差，暗示除了因 SulA 本身抑制細菌生 長外，無法形成六元環的ClpY 與基質會造成其他機制影響細菌之生長。
因為 3xFLAG-SulA 不具抑制細菌生長的活性，故以此作為 ClpYQ 蛋白酶 基質時，可觀察ClpYQ 蛋白酶與基質共同存在時對細菌生長之影響。結果細菌 之生長趨勢亦如ClpY 之側基大小成正相關，即是與 ClpY 形成六元環的能力成 正相關，由於3xFLAG-SulA 不具抑制細菌生長的活性，推論當 ClpY 之側基愈 大，則ClpY 愈能形成六元環，也愈能將 3xFLAG-SulA 水解。由於 ClpY 不易 形成六元環時，ClpY 與基質之結合能力是較佳的(尚未發表)。因此推測，ClpY 可 能與基質結合但未分解時，會造成未知的機制使細菌生長受抑制。
若不大量誘導ClpYQ 蛋白酶基質，紀錄液態培養時細菌密度的差異，可觀 察到和 ClpY 側基大小相同之趨勢，如圖十三所示，ClpY 之側基愈大細菌在停 滯期的密度愈高。而此現象無法在序列稀釋滴盤實驗中顯現(如圖十二左)，原因
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應為過程中的序列稀釋，將微量的細菌密度差異減少而無從顯現。
綜合以上，ClpYQ 蛋白酶與其基質共同存在於細菌體時，會造成細菌生長 受到影響，而趨勢恰與ClpY 側基大小，即形成六元環的能力成正相關。不論是 誘導ClpY、ClpQ 及 3xFLAG-SulA 在滴盤實驗中所見相差 1000 倍的生長狀況，
亦或是只大量誘導ClpY 及 ClpQ 時，細菌在液態培養基中細菌密度的些微差異，
皆暗示ClpYQ 蛋白酶與其基質共同存在於細菌體時，會造成細菌生長受到影響，
其趨勢為ClpY 較無法形成六元環時，細菌生長受較大的抑制。此新現象推測是 ClpYQ 蛋白參與未知的調控有關。然而此未知的調控機制尚需更進一步深入之 研究。
本實驗建構之一系列突變株，可用以互相印證以探索ClpY 蛋白在細菌中未 知的角色。由於ClpY 蛋白形成六元環需要 ATP 的參與，若沒有 ATP 存在，ClpY 將以單體及雙體 (ClpY2) 的型式存在於細菌體內，如圖九 (lane 1)。再者，ClpY 蛋白需要水解 ATP 後把基質打開，傳送單一多肽鏈進入中央孔洞，運送基質給 ClpQ 蛋白水解，在 2005 年的報告中，Martin 等人將六個 ClpX 單體建構在同一 條多肽上，在此，ATP 單純被水解而用來解構基質，不需幫助 ClpX 形成六元 環，因為六元環已經由人工生成，並依序利用突變減少其中一個、兩個至五個單 體上ATPase 的能力，確認不論 ClpX 六元環上的具完好 ATPase 之單體有幾個，
ClpXP 分解基質所使用的總 ATP 含量是固定的，而分解效率和 ClpX 六元環上 的完好ATPase 之單體數量成正比 (Martin et al., 2005) 。綜合以上，ATP 對 ATP 依賴型蛋白酶的角色有二：協助六元環的形成及幫助水解基質。
前人以CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) 阻斷 ATP 的合成 以研究ATP 對 ClpXP 分解 RpoS 造成的影響(Peterson et al., 2012) ，因為添加 CCCP 後，細菌無法合成 ATP 可能造成許多生理功能失效，影響層面廣泛，只 能短時間內聚焦於 ATP 對 ClpXP 之影響，長時間觀察便難以確認是 ATP 對 ClpXP 的影響或是 ATP 造成其他影響而改變觀察結果。
完全抑制 ATP 生合成(如加入 CCCP) 對細菌而言是很大的生長限制，若欲
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研究本實驗中發現的新現象，則需要把受ATP 缺乏直接造成的生長限制，與 ATP 缺乏使ClpY 無法形成六元環且與基質共存時，所間接造成的生長限制區分開來。
則可利用雙突變株ClpY R25A/Y408A，因為在 ATPγS 存在下，主要都形成 ClpY2
的形式，其型態相同於缺乏ATP 之野生型 ClpY 蛋白之生理狀態。故可以在 ATP 充足不影響細菌生長下，模擬細菌缺乏 ATP 的狀態，探討 ClpY 蛋白質形成雙 體並與基質共存時，對細菌生長造成之影響，配合一系列側基大小不同之突變株 交互印證，更能確認ClpY 蛋白質形成六元環與否對細菌生長之差異。
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伍、 結論
本實驗針對 ClpY Y408 建構一系列由小到大之點突變，研究此胺基酸對 ClpY 蛋白形成六元環之影響，發現若此胺基酸之側基愈小 ClpY 愈不易形成六 元環。進一步此現象對ClpYQ 生理活性之影響，以會抑制細菌生長的 HA-SulA 作為基質，觀察到細菌生長能力與ClpY 形成六元環的能力成正相關，但在 ClpY R25A/Y408A 這個無法形成六元環的雙突變蛋白菌株中，甚至觀察到比控制組為 差的生長狀況。故以不具抑制細菌生長效果的3xFLAG-SulA 作為基質，同樣觀 察到細菌生長能力與ClpY 形成六元環的能力成正相關，對比控制組可知當有不 易形成六元環之ClpY 及其基質共同存在於細菌體內時，會造成細菌生長受抑制。
液態培養下停滯期的細菌密度亦有相同的趨勢。由以上顯示，ClpY Y408 胺基酸 之側基大小將影響ClpY 六元環之形成，並影響 ClpYQ 蛋白酶之功能。
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表一、本論文所使用的菌株 Table 1. Strains used in this study.
Strains Description Source or
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