一、研究設計：
收集2008 年 11 月至 2010 年 12 月共計 25 位院內感染 XDRAB 的病人，將收 集到的XDRAB 菌株以 PCR 方式檢測 Integron 及 OXA typing，以期了解所收集之 XDRAB 抗藥性的基因分布情形，並以脈衝式電泳分析(Pulse-Field Electrophoresis) 了解各菌株間相關情形，同時以回溯性病例對照方式(1:4 配對)於相同病房、在相 同日期，年齡差距在5 歲以內，將有 XDRAB 院內感染與 100 位非 XDRAB 院內 感染之病人透過臨床資料比對，而所需收集的臨床資料包含：潛在疾病(underlying disease)、侵入性醫療措施(invasive procedure)及抗生素使用種類(Antibiotics
usage)，以便探討 XDRAB 院內感染的危險因子之用。
1. XDRAB 院內感染病例定義：
納入收案條件病人需為A. baumannii菌感染病人，符合衛生署疾病管制局於 2009 年 10 月 30 日二版修訂的醫療照護相關感染監測定義[40] (收案標準詳見附件 一)，且菌株對ampicillin (AM)、cefazolin (CZ)、gentamicin (GM)、amikacin (AN)、
trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT)、ceftazidime (CAZ)、ceftriaxone (CRO)、
imipenem (IPM)、ciprofloxacin (CIP)、cefepime (FEP)、ampicillin/sulbactam (AMS) 、piperacillin/tazobactam (TZP)，以及tigecycline (TG)抗生素均具有抗藥性 者，但是對於colistin(CL)抗生素呈敏感性，符合收案條件之病人定義為醫療照護 相關感染XDRAB病人，研究期間共收集了 25 例病例。
2. 對照組選擇條件：
採用回溯性病例對照方式(配對條件及配對比例為 1:4)於相同病房、在相
同日期，年齡差距在5 歲以內，以隨機方式選取符合上述配對條件的住院病例 100 位。
3. 本研究對XDRAB 感染之危險因子係採用 matched case-control study（配 對病例對照研究設計）來探討。然後再透過統計方式分析相關可能危險 因子，藉此分析可以找到感染XDRAB 的危險因子，並希望在藉由感控 措施預防此細菌的感染。而所需收集的臨床變項資料如下第4 點所述。
4.
臨床變項定義：4.1 潛在疾病(Underlying disease)：此乃依據感染發生日之前的住院病歷診斷 記載認定，資料分析顯示共有以下12 種。
4.1.1 腫瘤(Solid tumor)
4.1.2 惡性血液疾病(Hematologic Malignance) 4.1.3 心血管疾病(cerebral vascular accident,CVA) 4.1.4 糖尿病(DM)
4.1.5 尿毒症(Uremia)
4.1.6 肝硬化(cirrhosis of liver) 4.1.7 紅斑性狼瘡(SLE)
4.1.8 體內有植入物(with Implant)
4.1.9 長期臥床(Long term bed rest)：指臥床天數超過 30 天以上者 4.1.10 使用類固醇(steroid used)
4.1.11 化療/放射線治療(Chemotherapy/Radiotherapy)
4.1.12 昏迷(Coma)：失去意識狀態
4.2 侵入性醫療措施(invasive procedure)：指病例納入收案定義當時有下列侵 入性醫療處置
4.2.1 周邊靜脈注射(Peripheral IV),
4.2.2 中心靜脈導管(central venous pressure catheter,CVP)
4.2.3 長期靜脈注射(Long term IV)：有裝置如 PICC、port-A 等裝置 4.2.4 中心靜脈營養給與(central paraental nutrition,CPN)
4.2.5 動脈導管(Arterial line) 4.2.6 肺動脈導管(Swan-Ganz) 4.2.7 HD(A-V fistula/graft), 4.2.8 HD(Perm/Double lumen), 4.2.9 導尿管(Foley catheter) 4.2.10 氣管內管(Endotracheal) 4.2.11 氣管切開(Tracheostomy) 4.2.12 呼吸器(respirator)
4.2.13 引流管(Drainage catheter)
4.3 抗生素使用種類(Antibiotics usage)：指病例及對照組從入院至收案當日 使用之抗生素。超過3 個月的使用以三個月計算。
4.3.1 Glycopeptide, 4.3.2 Aminoglycoside,
4.3.3 Carbapenem：包含 imipenem, meropenem 及 ertapenem
4.3.4 imipenem or meropenem, 4.3.5 anti-pseudomonas penicillin, 4.3.6 3rd Cephalosporin,
4.3.7 4th Cephalosporin,
4.3.8 antipseudomonal cephalosporins, 4.3.9 Quinolone.
計劃流程:
1. 收集及保留 XDRAB 菌株收集以因應計劃之用。
2. 資料收集
收集所有病人與菌株的抗生素感受性資料 3. Integron 抗藥性基因偵測及 OXA typing 將所收集菌株以 PCR 方式檢測
4. PFGE 電泳分析 ( PFGE Analysis )
5. 以 SAS 軟體進行 conditional logistic regression 分析病例組與對照組病人 臨床資料，以找出有意義的危險因子。
二、方法與步驟：
1. XDRAB 菌株藥物感受性測試
依據美國臨床實驗室標準機構 (Clinical and Laboratory Standards Institute;
CLSI) 之操作指引，以抗生素紙錠擴散法 (disk diffusion) 針對鑑定為 A. baumannii 進行敏感性試驗，其測試方法簡要說明如下：挑取 A. baumannii 菌株 2-3 個菌落，
種入含2 mL TSB 之試管，培養在 35℃直至渾濁度相當於 0.5 McFarland 硫酸鋇標 準液，平均塗抹在 Mueller-Hinton agar 培養基的表面，再分別貼上 ampicillin (AM) 、 cefazolin(CZ) 、 gentamicin(GM) 、 amikacin(AN) 、 trimethoprim- sulfamethoxazole (SXT)、ceftazidime (CAZ)、ceftriaxone (CRO)、imipenem (IPM)、
ciprofloxacin (CIP) 、 cefepime (FEP) 、 ampicillin/sulbactam (AMS) 、 piperacillin/
tazobactam (TZP)、tigecycline(TG)及 colistin(CL)抗生素紙綻於瓊脂的表面，置於 35℃，一般培養箱隔夜培養 16-18 小時後判讀，觀察並測量抑制環的直徑大小 (mm)，菌株再以 Agar dilution 檢測 tigecycline (TG)檢測之最低抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)，並保存於-80℃之冰箱中，以待之日後進行分子流行病 學研究。來自同一病人之菌株，不論臨床檢體為何，並不重覆收集、計算。
2.
偵測Integron抗藥性基因及OXA typing [41]將所收集菌株於MacConkey agar上隔夜培養，取培養之新鮮菌落於500μl無菌 水中做成懸浮液，再使用InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA) Kit 做DNA萃取，萃取後之DNA儲存於-20℃冰箱直到需要時取用，DNA萃取步驟如下：
2.1 DNA 萃取
2.1.1 每個eppenedof 加 600μl digestion buffer。
2.1.2 將菌落加入，平均打散在digestion buffer 後，快速離心使瓶 蓋液體沉降，放入乾熱器65℃加熱 10 分鐘。
2.1.3 回溫後，加入200μl 的 5M NaCl 和 200μl 的 chloroform (CHCl3，氯仿) ，votex 20 秒。
2.1.4 離心12000 轉 10min，離心完後液體會分成兩層（下層氯仿，
上層溶有DNA）。
2.1.5 取上層700μl，加入 550μl 的 2-propenol，將其小心混合均 勻，會產生絲狀物，此即為DNA（用力過猛 DNA 可能會斷 裂）。
2.1.6 離心12000 轉 3min，倒掉上清液（可以擦手紙拭乾管口殘餘 液，注意檢體間不要互相汙染）。
2.1.7 加入700μl 的 70%EtOH（酒精）稍微搖動清洗殘餘液體，
再離心12000 轉 3min。
2.1.8 倒掉上清液後再快速離心，以pipette 吸走多於殘留液，然後 乾燥5min（以擦手紙覆蓋其上避免汙染）。
2.1.9 加入200-500μl 的 1.0TE buffer（視 DNA 濃度而定）。
2.2 DNA 濃度測定(以分光光度計(Spectrophotometer)測量 DNA 濃度)
2.2.1 取出石英管，以500μl 無菌水 pipetting 來清洗管壁，清洗動作重 複3 次，第三次 wash 後將水留在石英管中。
2.2.2 以拭鏡紙擦拭偵測試窗，按set/ref 後待＂嗶＂聲響起，迅速置入 石英管作儀器歸零動作，＂嗶＂聲再度響起後迅速取出石英管，
完成歸零。
2.2.3 吸出第三次wash 的水，用力甩兩下使管壁內殘留液體流至底部，
再用小tip(可使用 200μl 的 Pipette)吸乾殘留液體。
2.2.4 取儀器上放置已知濃度的陽性測定檢體8μl 至石英管中，再取 72μl 的無菌水（總體積 80μl），pipetting 使混合均勻。
2.2.5 以拭鏡紙擦拭，按sample 後，待＂嗶＂聲響起迅速置入石英管，
＂嗶＂聲再度響起後迅速取出石英管，完成測定並寫上陽性測定 值。（應在70-80μg/ml）。
2.2.6 吸出測定液體，取500μl 水清洗一次後甩兩下，用小 tip 吸乾淨。
2.2.7 依照陽性測定值測定方式依序測定完所有檢體，並在每次測定完 後施行清洗一次的動作。
2.2.8 最後一次檢體測定完後，先吸取1000μl（500μl x 2）滅菌水徹 底清洗管壁，吸除水後更換tip 再分別吸取 500μl 滅菌水清洗兩 次。
2.2.9 第三次wash 完後將水留在石英管中，測定並寫上清洗完後的吸 光值（最佳為0.0μg/ml），然後將石英管收入盒子，完成 DNA 濃度測定。
2.3 PCR 操作流程
2.3.1 Integrase PCR 流程
2.3.1.1 選取 10X running buffer 1μL、dNTP 0.8μL、Mg2+ 0.4μL、primer 各0.5μL ( integrase 1R、integrase 1F、integrase 2R、integrase 2F)、
DNA polymerase (DyNAzyme II) 0.5μL 及 ddH2O 4.3μL，依所需 的sample 量配製成每管總體積 10μL 之 matrix buffer。使用的 Primers 之 DNA 序列及其參考資料來源詳見表一。
2.3.1.2 將 matrix buffer 混合均勻後，分裝至 PCR 專用反應管，此時每管 總體積為9μL。
2.3.1.3 加入已調整成濃度 20μg/ml、所需量之 DNA 1μL 至各 PCR 專 用反應管，並pippetting 使之混合均勻，使每管最後總體積為 10 μL。
2.3.1.4 Blank 管加入所需量之 ddH2O 1μL 作為空白測試管。
2.3.1.5 確實蓋上 PCR 專用反應管之上蓋，並於可書寫處標示前後順序記 號。
2.3.1.6 Spin down。
2.3.1.7 打開 PCR 儀器，並設定所需之 program (Initialization step: 94℃, 5 min; denaturation: 94℃, 30 sec, annealing: 55℃, 30 sec, extension:
72℃, 30 sec, 35 cycle ; final elongation: 72℃ for 7 min, and final hold at 4℃) 。
2.3.1.8 將 PCR 專用反應管放置於 PCR 儀器凹槽中，並確認上蓋是否蓋 緊。
2.3.1.9 開始進行 PCR。
2.3.1.10 待 PCR 結束後，將產物存放於 4℃以備跑膠。
2.4 Integron (Gene Cassette) PCR 流程
2.4.1 選取10X running buffer 1μL、dNTP 0.8μL、Mg2+ 0.4μL、
primer 各 0.1μL ( Integron 3’-CS、Integron 5’-CS)、DNA polymerase (DyNAzyme II) 0.1μL 及 ddH2O 6.5μL，依所需 的sample 量配製成每管總體積 10μL 之 matrix buffer。
2.4.2 將matrix buffer 混合均勻後，分裝至 PCR 專用反應管，此時 每管總體積為9μL。
2.4.3 加入已調整成濃度20μg/ml、所需量之 DNA 1μL 至各 PCR 專用反應管，並pippetting 使之混合均勻，使每管最後總體
積為10μL。
2.4.4 Blank 管加入所需量之 ddH2O 1μL 作為空白測試管。
2.4.5 確實蓋上PCR 專用反應管之上蓋，並於可書寫處標示前後順 序記號。
2.4.6 Spin down。
2.4.7 打開PCR 儀器，並設定所需之 program (Initialization step: 96
℃, 5 min; denaturation: 96℃, 30 sec, annealing: 55℃, 30 sec, extention: 72℃, 30 sec, 35 cycle ; final elongation: 72℃ for 7 min, and final hold at 4℃) 。
2.4.8 將PCR 專用反應管放置於 PCR 儀器凹槽中，並確認上蓋是 否蓋緊。
2.4.9 開始進行PCR。
2.4.10 待 PCR 結束後，將產物存放於 4℃以備跑膠。
2.5 OXA-typing PCR 流程
2.5.1 選取10X running buffer 1μL、dNTP 0.8μL、Mg2+ 0.4μL、
primer 各 0.1μL ( OXA-23R、OXA-23F、OXA-24R、
OXA-24F、OXA-51R、OXA-51F、OXA-58R、OXA-58F)、
DNA polymerase(DyNAzyme II) 0.1μL 及 ddH2O 5.9μL，依 所需的sample 量配製成每管總體積 10μL 之 matrix buffer。
使用的Primers 之 DNA 序列及其參考資料來源詳見表一。
2.5.2 將matrix buffer 混合均勻後，分裝至 PCR 專用反應管，此時 每管總體積為9μL。
2.5.3 加入已調整成濃度20μg/ml、所需量之 DNA 1μL 至各 PCR 專用反應管，並pippetting 使之混合均勻，使每管最後總體 積為10μL。
2.5.4 Blank 管加入所需量之 ddH2O 1μL 作為空白測試管。
2.5.5 確實蓋上PCR 專用反應管之上蓋，並於可書寫處標示前後順 序記號。
2.5.6 Spin down。
2.5.7 打開PCR 儀器，並設定所需之 program (Initialization step: 96
℃, 5 min; denaturation: 96℃, 30 sec, annealing: 52℃, 40 sec, extention: 72℃, 1 min, 40 cycle ; final elongation: 72℃ for 7 min, and final hold at 4℃) 。
2.5.8 將PCR 專用反應管放置於 PCR 儀器凹槽中，並確認上蓋是 否蓋緊。
2.5.9 開始進行PCR。
2.5.10 待 PCR 結束後，將產物存放於 4℃以備跑膠。
2.6 DNA 膠體電泳
2.6.1 水平式膠體電泳 (又稱瓊脂糖膠體電泳，Agarose gel electrophoresis )
2.6.1.1 秤量 2.25g LE agarose powder，倒至三角錐瓶。
2.6.1.2 加入 150c.c. 的 0.5 倍 TBE buffer 泡製成 1.5%的 LE agarous。
2.6.1.3 將三角錐瓶放至 heater 上加熱，並加入 stir bar 攪拌使之完全 溶解至微微沸騰。
2.6.1.4 放置約 30 分鐘至手可以握的溫度。
2.6.1.5 倒入所需的 well，插上所需之 comb，放涼待凝（約 30 分鐘）。
2.6.1.6 將凝固好的 gel 安置在清洗過、乾淨的電泳槽中，並倒入 0.5 倍TBE 當 running buffer。
2.6.1.7 每個 sample 取 5-8μl，marker 取 8μl，分別與 1-2μl 的染劑 混合均勻後，loading 至 well 中。
2.6.1.8 蓋上電泳蓋，開始跑膠。
2.6.1.9 結束後，將 gel 置入 Ethidium Bromide (溴化乙錠，簡稱 EtBr) 中浸泡約5 分鐘，水沖洗約 1-3 分鐘。
2.6.1.10 照 UV 看結果，並且拍照留存。
3. PFGE 操作流程
依據脈衝場電泳分型法(Pulsed-Field Gel Electrophoresis Analysis) [42]，進行 extensively drug-resistant Acinetoacter baumannii菌株親源性(clonal relationship)分 析，分析之材料與方法分點敘述如下：
3.1 細菌之包埋、酵素處理與清洗 ( Bacterial Embeding , Enzyme Digesting, and Washing)
依據PFGE 標準操作方法進行菌體之包埋、酵素處理及清洗，其過程簡述 如下：
3.1.1 第一天挑取單一菌落接種於指定之培養基與培養條件；
3.1.2 第二天以棉捧刮取菌體，於Cell Suspension Buffer (100 mM
Tris.Cl, 100 mM EDTA,pH 8.0)中做成懸浮液，
3.1.3 以濁度計(Turbidity Meter, Dade Microscan™)測量，調整菌液 濃度至0.68 – 0.72 (in Falcon 2054 tubes)，
3.1.4 取400 μl 菌液至 1.5 ml Eppendorf 小管，
3.1.5 加20 μl proteinase K (20 mg/ml)，
3.1.6 混合後加入400 μl 融化後回溫至 56℃的 1% SeaKem® Gold agarose/1% SDS，
3.1.7 快速以micropipette 混均勻後注入模具中，
3.1.8 放置於室溫15 min 或 4℃ 5 min 使充份凝固，
3.1.9 再將膠片自模具中推入5 ml Cell Lysis Buffer (50 mM Tris.Cl;
50 mM EDTA, pH 8.0; 1% Sarcosine; 0.1 mg/ml proteinase K)，置於 56℃水浴器振盪 2 hrs；
3.1.10 膠體經酵素處理後，加 15 ml 預熱至 56℃的 ddH2O，置水浴 器振盪15 min，重覆 ddH2O 清洗一次，
3.1.11 再以 15 ml 預熱至 56℃的 TE buffer (10 mM Tris.Cl pH8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)清洗四次，
3.1.12 膠體最後保存於 5 ml 的 TE 中，置於 4℃冷藏，以供 PFGE 電泳分析使用。
3.2 PFGE 電泳分析 ( PFGE Analysis )
3.2.1 以刀片切取約2-mm 寬含 chromosome DNA 的膠薄片(slice)，
3.2.2 膠薄片先置入 200μl 的指定之限制酶(ApaI)緩衝液，室溫下放 置5 min，
3.2.3 以micropipette 吸出緩衝液，再注入 200μl 含指定 units 量之 限制酶之緩衝液，置於指定溫度下放置2 小時，
3.2.3 以micropipette 吸出緩衝液，再注入 200μl 含指定 units 量之 限制酶之緩衝液，置於指定溫度下放置2 小時，