第三章 材料與方法
第二節 方法
壹、細胞培養
人類正常腎臟近端小管上皮細胞株(HK-2，BCRC 60097)，購自新竹 食品工業發展研究所。HK-2 培養在keratinocyte serum-free basal medium (Gibco)中，含有 5 ng/ml的重組表皮生長因子，和 50 μg/ml的胎牛腦下垂 體萃取物，不含抗生素，在37°C和 5% CO2的培養箱中培養。
貳、藥物處理
馬兜鈴酸鈉鹽(AA-I (41%)和 AA-II (56%))購自 Sigma，並溶在滅菌 過的二次水中，儲存在-30°C。HK-2 細胞種在不同培養器皿中(75T、25T、
6 孔盤、24 孔盤，或 96 孔盤)培養 24 小時，加入不同濃度的馬兜鈴酸(10、
30 或 90 μM)，並再培養 24 小時；或者是加入 30 μM 的馬兜鈴酸，再培 養1、3、6、12 和 24 小時。離心去除含馬兜鈴酸的細胞培養上清液後，
細胞用PBS 清洗兩次，進行下面實驗。
参、MTT 存活率測試
MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)購 自Sigma並溶在phosphate buffered (PBS)中，細胞存活率測試藉由MTT來 分析。將HK-2 細胞種在 96 孔盤或 75T當中，經過 24 小時的培養，加入 不同濃度的馬兜鈴酸(10、30 或 90 μM)，並再培養 24 小時；或者是加入
30 μM的馬兜鈴酸，再培養 1、3、6、12 和 24 小時。離心去除含馬兜鈴 酸的細胞培養液後，並用PBS清洗兩次，再加入含有 0.5 mg/ml MTT的 細胞培養液。經過 4 小時的反應，MTT會和細胞中的琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase)反應形成藍色結晶(formazen)，再利用 10%
SDS/0.1N HCl溶解藍色結晶。利用microplate reader測 570 nm和 650 nm 的吸光值，650 nm波長當作背景值。細胞的相對存活率公式計算為：經 由 馬 兜 鈴 酸 處 理 的 細 胞 吸 光 值/ 只 加 入 等 量 水 處 理 的 細 胞 吸 光 值)*100%。數據以平均值±標準差(mean ± SD)表示，實驗的重複次數為 三次。
肆、Total RNA 萃取
將細胞種在 75T當中，翌日加入不同濃度的馬兜鈴酸(10、30 或 90 μM)，培養 24 小時；或者是加入 30 μM的馬兜鈴酸，再培養 1、3、6、
12 和 24 小時。離心去除含馬兜鈴酸的細胞培養液後，並用PBS清洗兩 次。利用RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA)進行細胞total RNA的萃 取。接著利用Beckman DU800 分光光度計(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)進行total RNA的定量。對於A260/A280比值大於1.8 的樣品，進 一步利用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA,
時，才會用於下述的基因微陣列實驗分析。
伍、基因微陣列分析
將 5 μg total RNA利用MessageAmpTM aRNA kit (Ambion)經由試管 外轉錄步驟來增加樣品量。增量後的RNA (amplified RNA , aRNA)再和 螢光物質Cy5 (Amersham pharmacia)進行標定。然後和Phalanx公司所提 供的雜合反應緩衝劑，將螢光標定的aRNA與Mouse Whole Genome OneArrayTM晶片(Phalanx Biotech group)進行雜合反應，於 50°C作用ㄧ 夜。在接後續的清洗處理步驟，將非專一性結合的標的物由晶片上移 除 。 再 將 晶 片 以 離 心 方 式 乾 燥 ， 並 利 用 掃 瞄 器Axon 4000 Scanner (Molecular Device)進行螢光強度的掃瞄。微陣基因分析實驗的重覆數為 3 次。
再利用Genepix 4.1 版(Molecular Device)分析軟體進行螢光強度分 析，每ㄧ點的訊號經由扣除周圍背景值的方式來校正其強度，並刪除作 為內在控制的探針，或是訊號雜訊比值小於零的點。剩餘通過此門檻的 點 則 藉 由Limma 進 行 Normalization[125]， 得 到 的 資 料 在 使 用Gene Expression Pattern Analysis Suite v. 3.1 軟體計算兩組實驗是否有統計上 有意義差異的基因[126]。我們已將原始的基因微陣列數據提交到Gene Expression Omnibus (GEO)，系列號碼為GSE18243。系列包含空白組與
處理組兩個樣品。樣品的號碼為GSM455880 (處理組)，and GSM455881 (空白組)。
利用Limma裡面的GeneSetTest功能，來探討在HK-2 細胞中，哪些 生物路徑會受馬兜鈴酸調控。基因選擇要件如下:需基因變化倍率(積分) 正負大於 2.7 倍，才進入下列路徑分析，路徑分析以ArrayTrack為主，
ArrayTrack包括KEGG路徑和PathArt 路徑(Jubilant Biosys) ，總共有 352
路 徑 進 入 分 析 。 ArrayTrack
(http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/ArrayTrack/) ， PathArt路徑(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) 。
此外 ，我們 也利用 BiblioSphere Pathway Edition軟 體(Genomatix Applications, http://www.genomatix.de/index.html)分析fold changes >2.0 和false discovery rates < 0.05 的基因之間交互網路圖譜，BiblioSphere Pathway Edition軟體是以知識庫分析為基礎來進行分析[127]。最後，以 Cytoscape軟體來構築馬兜鈴酸調控的基因之間的交互網路圖譜，包含 NF-κB相關基因的交互網路[128]。
陸、定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)
NF-κB和DNA修補路徑相關基因表現，進一步利用qRT-PCR確認其 表現量。將HK-2 細胞種在 75T當中，經過 24 小時的培養，加入不同濃 度的馬兜鈴酸(10、30 或 90 μM)，並再培養 24 小時；或者是加入 30 μM 的馬兜鈴酸，再培養 1、3、6、12 和 24 小時。抽取total RNA，利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit反式轉錄RNA。在定量反轉 錄聚合酶連鎖反應實驗中，使用 1 μl的cDNA和 2X SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進行反應。
條件為 95°C、10 分鐘後，進行 40 個循環的 95°C、10 秒，60°C、1 分鐘。
相對mRNA的量計算方式是用comparative CT方法。每一個反應是應用生 物系統公司的 7300 Real-time PCR系統。實驗用的正向(F)和反向(R) 引子序列於表 3.1 中。實驗的重覆數為 3 次。
柒、免疫染色(NF-κB p65) /共軛焦顯微鏡法
將細胞種在含有蓋玻片的 24 孔盤當中，經過 24 小時的培養，加入 不同濃度的馬兜鈴酸(10 和 30 μM)，並再培養 24 小時，去除含有馬兜鈴 酸的上清液，以PBS 清洗兩次。再加入冰的丙酮置於 4°C 冰箱進行固定
30 分鐘。接著加入一級抗體
p65 subunit of NF-κB rabbit polyclonalantibody (ab7970, abcam)在 4°C 作用一夜。接著加入二級抗體 Alexa Fluor® 488- conjugated secondary goat anti-rabbit antibody 在室溫作用 1
表3.1 qRT-PCR 實驗的正向(F)和反向(R)引子序列
Gene primer sequence
CCL20 sense: 5'- GCTCCTGGCTGCTTTGATGT-3'
antisense: 5'- GAATACGGTCTGTGTATCCAAGACA-3' CD68 sense: 5'- TCTGCCCACCCAGAACCA-3'
antisense: 5'- CACAGGGCTGGGAACCATT-3' CYP1A1 sense: 5'- ATGGGCAAGCGGAAGTGTAT-3' antisense: 5'- CCAGTGGCACGCTGAATTC-3' ERCC1 sense: 5'- TCTCCCGGGTGACTGAATGT-3'
antisense: 5'- GCGATGAGCTGTTCCAGAGAT-3' ERCC2 sense: 5'- GGCAAAGTGTCCGAGGGAAT-3'
antisense: 5'- CCTTGAGAATGCGGCTCTGT-3' GADD45B sense: 5'- TGTACGAGTCGGCCAAGTTG-3'
antisense: 5'- ATTTGCAGGGCGATGTCATC-3' IGFBP3 sense: 5'-CAGCGCTACAAAGTTGACTACGA-3'
antisense: 5'-ATTTCTCTACGGCAGGGACCAT-3'
IL8 sense: 5'-FCTTTCCACCCCAAATTTATCAAAG-3'
antisense: 5'-RAGAGCTCTCTTCCATCAGAAAGCT-3'
LTB sense: 5'-ACTTCTCTGGTGACCTTGTTGCT-3 antisense: 5'- AGCTTCTGAAACCCCAGTCCTT-3 MGMT sense: 5'- CCTGGCTGAATGCCTATTTCC-3'
antisense: 5'- TGTCTGGTGAACGACTCTTGCT-3' NAIP sense: 5'- CTGGATGCTGTCCCCTGTTAA-3'
antisense: 5'- AGGAGCTGGTCACAGATGATACTG-3' OGG1 sense: 5'- TTCCAAGAGGTGGCTCAGAAAT-3'
antisense: 5'- CGATGTTGTTGTTGGAGGAACA-3' PARP sense: 5'- GGAGTCGGCGATCTTGGA-3'
antisense: 5'- AGTAATAGGCATCGCTCTTGAAGAC-3' SAA2 sense: 5'-CCGATCAGGCTGCCAATAAA-3
antisense: 5'-GCAGAGTGAAGAGGAAGCTCAGT-3
TNFRSF9 sense: 5'-TGCGAGAGAGCCAGGACACT-3'-3
antisense: 5'-GAAACGGAGCGTGAGGAAGA-3'
TP53 sense: 5'- GGGTTAGTTTACAATCAGCCACATT-3'
antisense: 5'- GGGCCTTGAAGTTAGAGAAAATTCA-3'
小時。在NF-κB 染色後，加入 propidium iodide 染劑，在室溫作用 15 分 鐘進行細胞核的染色。利用雷射掃瞄共軛焦顯微鏡(TCS SP2 system, Leica)取得螢光影像。
捌、NF-κB/luciferase 報導基因分析
將細胞種在 24 孔盤當中，經過 24 小時的培養後，進行基因轉染，
利用SuperFect® transfection reagent (Qiagen, Valencia, CA, USA)轉入 5 μg 的NF-κB質體，或是轉入空的質體(pcDNA 3.1)。經過一夜的培養後，加 入10 μM的馬兜鈴酸，再培養 24 小時。接著利用冰的PBS清洗兩次，再 加入350 µl的細胞裂解液Triton lysis buffer (50 mM Tris-HCl、1% Triton X-100、1 mM dithiothreitol，pH 7.8)，利用刮削器將細胞收集起來。加 入luciferin進行反應，測試luciferase的活性。單位以relative luciferase unit (RLU)表示，活化倍率的計算方式為處理馬兜鈴酸的RLU除以未經處理 馬兜鈴酸的RLU來呈現。
玖、彗星試驗
將 HK-2 細胞種在 6 孔盤當中，經過 24 小時的培養，加入不同濃度 的馬兜鈴酸(10、30、90 和 150 μM)，並再培養 3 或 24 小時，去除含有 馬兜鈴酸的上清液，以PBS 清洗兩次。將處理過藥物的細胞收集下來，
以PBS 清洗一次，並且加入 1X PBS (稀釋成 10 μl 內含 10000 個細胞)。
將上膠與下膠以微波方式溶解後放在熱水中，避免凝固。在磨砂載玻片 上以鉛筆標上樣品代號，置入70 μl 下膠(0.5 g LMA + 0.5 g NMA)於載玻 片上，蓋上蓋玻片，凝固後拿下蓋玻片，完成第一層膠：接著取 10 μl 細胞液加上60 μl 上膠(0.5 g LMA)，加在第一層膠上，蓋上蓋玻片，凝 固後拿下蓋玻片(放置於冰上)。將含膠的載玻片置入染缸中，染缸中放 置Lysis Buffer (2.5 M NaCl、10 mM Tris-HCl、100 mM EDTA、1% Triton
X-100))中，靜置約一小時(放置於冰上)，再將含膠的載玻片移至含預冷
過Alkaline buffer 之電泳槽靜置 20 分。將電泳槽置於冰上，以 Alkaline buffer 為電泳液跑 30 min (固定 25 V;約為 300 mA)。將含膠的載玻片移 至置入含0.4 M Tris Buffer (pH=7.5)染缸中，靜置中和 15 分鐘(放置於冰 上)，再置入 Methanol 的染缸，靜置脫水 5-10 分鐘。取出玻片加入 40μl PI (5 μg/ml)蓋滿膠體，反應 5-10 分鐘，以螢光顯微鏡觀察細胞脫尾現 象，照相後以CometScore 軟體分析 DNA 脫尾程度。拾、8-OHdG 免疫染色法分析
將細胞種在含有蓋玻片的 24 孔盤當中，經過 24 小時的培養，加入 不同濃度的馬兜鈴酸(10、30 或 90 μM)，並再培養 24 小時，去除含有馬 兜鈴酸的上清液，以PBS清洗兩次。再加入冰的丙酮置於-20°C冰箱進行
固定 10 分鐘，固定完後將蓋玻片晾乾。染色之前，先利用PBS進行再水
合作用，接著加入RNase A (100 μg/ml)在 37°C作用50 分鐘，去除RNA，
以PBS清洗三次。接著加入proteinase K (1 μg/ml)在室溫中作用 7 分鐘，
以PBS清洗三次。為使DNA變性，加入 4 N HCl作用 5 分鐘，再用 50 mM Tris-base進行中和 4 分鐘，再以PBS清洗三次。用 3% H2O2 (溶於甲醇中) 反應15 分鐘減低內生性的過氧化氫酶反應。接著使用Novolink Polymer Detection System (Novocastra)進行免疫染色。加入protein block (RE7166, 0.4% Casein in phosphate-buffered saline)在室溫中作用 30 分鐘，減少非 專 一 性 的 鍵 結 。 接 著 加 入 一 級 抗 體anti-8-hydroxydeoxyguanosine (anti-8-OHdG) monoclonal antibody N45.1 (Fukuroi, Japan, 1:200 dilution) 在4 °C作用一夜，以PBS清洗三次。再加入post primary block (RE7167, 10
% animal serum)在室溫下作用 30 分鐘，以PBS清洗三次。最後加入 NovoLinkTM polymer (RE7168, anti-mouse/rabbit IgG-Poly-HRP)在室溫下 作用 30 分鐘，以PBS清洗三次。利用diaminobenzidine (DAB)進行呈色 反應。再將蓋玻片封片，以光學顯微鏡觀察8-OHdG染色的細胞數目。
拾壹、西方墨點法分析
將處理過馬兜鈴酸的細胞，以 PBS 清洗兩次，加入 SDS sample buffer 並利用刮削器收集細胞。將收集下的細胞以10,000 rpm 離心 5 分鐘，收
集上清液，利用Bradford 方法進行蛋白質定量。將定量完的蛋白質加熱 95°C 長達 5 分鐘，進行蛋白質變性。取 45 μg 的蛋白質以 10% SDS-PAGE 做蛋白質電泳。再將膠體上的蛋白質轉漬到硝酸纖維薄膜(nitrocellulose membranes)。利用 5%的脫脂奶粉進行 blocking 長達 1 小時，減少非專 一的鍵結。接著加入一級多株抗體OGG1 (Novus Biologicals, Littleton, CO)、c-fos 和 Bax (Santa Cruz Biotechnology)；一級單株抗體 p21、
caspase-3 和 α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology)，稀釋倍數為 1:1000 在 4°C 作用一夜。接著利用TBS-Tween 清洗三次，每次十分鐘。再加入二 級抗體(goat anti-mouse 和 goat anti-rabbit)，稀釋倍數為 1:10000 在室溫 作用1 小時，再利用 TBS-Tween 清洗三次，每次十分鐘。最後以 ECL 顯影。
拾貳、微核試驗分析
HK-2 細胞種在蓋玻片上，處理不同濃度的馬兜鈴酸，進行 24 小時 的培養後，去除含有馬兜鈴酸的上清液，以PBS 清洗兩次。為了獲得雙 核細胞，加入3 μg/ml 的 cytochalasin B 作用 16-24 小時。接著去除含有 cytochalasin B 的細胞培養液，以 PBS 清洗兩次後，利用甲醇在 4°C 中
進行固定 30 分鐘。將蓋玻片加入
0.1 mg/ml 的 acridine orange 在黑暗中 進行染色 10 分鐘，接著進行封片。利用螢光顯微鏡觀察微核現象，計數雙核細胞細胞質含有直徑介於1/3-1/20 細胞核大小的小核為微核，每 次實驗計數兩片玻片共1000 顆雙核細胞。
拾参、實驗統計分析
相關數據資料以平均值±標準差(mean ± SD)表示，並應用 Student’s t-test 及 one-way analysis of variance (ANOVA)進行統計分析。p <0.05 判 定為具有統計上顯著意義。