第二章 文獻探討
第二節 馬兜鈴酸
2. 馬兜鈴酸之毒性作用
馬兜鈴酸於1982 年被報導對Salmonella typhimurium可以直接誘發 突變[92] 。1983 年起Mengs陸續發表馬兜鈴酸對大鼠、小鼠具有致癌性，
可誘發胃癌(adenocarcinomas)、淋巴癌(malignant lymphomas)、腎臟癌 (aednomas)、肺癌(alveologenic carcinomas)，並且對腎臟的損害存在著劑 量反應關係[93-95]。在1991 年，Schmeiser 等人以馬兜鈴酸誘導小鼠及大 鼠產生腫瘤，然後觀察這些腫瘤組織與鄰近正常組織的基因變化。結果 發現這些腫瘤組織的c-Ha-ras codon 61 被馬兜鈴酸鍵結，並產生AT→TA transversion突變，進而引發癌症，但這些鄰近正常組織則無這樣的突變。
正常情況下，DNA複製時adenine會優先dTMP形成氫鍵鍵結，而guanine 優先和和dCMP形成氫鍵鍵結。Broschard等人發現，被馬兜鈴酸結合的 adenine位置可以和dAMP及dTMP機會平均地鍵結，而被鍵結的guanine 位置則如常地先和dCMP結合，所以馬兜鈴酸會誘發較高機率的ATÆTA transversion 點 突 變[96]。1995 年 Broschard 等 人 進 一 步 發 現 dA-AA-I, dG-AA-I and dA-AA-II會嚴重影響DNA的複製，而AA-adenine鍵結物比 AA-guanine鍵結物具有更高的致突變性[97]。馬兜鈴酸的致突變性研究在 λ/lac Z 基因轉植鼠(MutaTM Mouse)同樣獲得證實，Kohara等人以每日每 公斤 15 亳克馬兜鈴酸的劑量，一週一次經胃管餵食λ/lac Z 基因轉植 鼠，共餵食四周。然後觀察轉植基因lac Z基因和cⅡ基因的在十個器官 的突變率(mutant frequency, MF)，結果發現在標靶器官前胃、腎臟和膀 胱的突變率顯著高於控制組，進一步分析標靶器官在cⅡ基因序列的變 化，發現ATÆTA transversion的突變率增加[98]。
馬兜鈴酸的致癌作用，被認為是和DNA形成鍵結物相關，Schmeiser 等人於1988年利用放射性同位素32P後標定方法（32P-postlabelling assay）
在體外(in vitro)及動物(Wistar rats)體內測得AA-DNA鍵結物[99]，接著用 同樣的方法在Sprague-Dawley rats的前胃亦測得AA-DNA鍵結物[100]。馬 兜鈴酸會和DNA鍵結，deoxyadenosine是主要被修飾的地方，其次是 deoxyguanine。在比利時的馬兜鈴酸腎病變病人的腎臟組織可被偵測到
AA-DNA鍵結物[88, 101]，Schmeiser等人利用放射性同位素32P後標定方法 測定5位兜鈴酸腎病變病人及6位其它原因導致腎病的病人，結果發現 AA-DNA鍵結物(dA-AA-I adduct) 僅出現在這5位馬兜鈴酸腎病變病人 的腎臟組織裏[88]。Bieler 在兩位馬兜鈴酸腎病變病人的腎臟及泌尿道組 織測定並定量AA-DNA鍵結物，發現dA-AA-I adduct 的量遠比dG-AA-I adduct 及dA-AA-II adduct來的多，而此現象與大鼠單一口服AA-I所產生 的結果類似，因此推論馬兜鈴酸對動物的致癌及致突變作用機轉與馬兜 鈴酸腎病變病人對人類產生泌尿道癌機制類似[101]。
馬兜鈴酸的活性代謝物可以激活原致癌基因ras 基因與抑制抑癌基 因p53基因[102-103] ，因此，研究馬兜鈴酸的代謝活性與研究DNA鍵結物 的形成關係十分重要。不管是在體外或是在體內實驗研究都指出，AA-I 和AA-II會在體內經酵素還原代謝成具有活性的中間產物(馬兜鈴酸醯胺 化 合 物aristolactam) ， 其 形 成 為 一 親 電 子 的 活 性 代 謝 物 aristolactam nitrenium ion 會與體內大分子反應，進而形成馬兜鈴酸-DNA鍵結物[69,
99]。Schmeiser等人[99]首先在體外利用大鼠肝臟萃取物（S9）作為酵素系 統，來活化AA-I和AA-Ⅱ進而形成DNA鍵結物，S9內的還原酵素經由硝 基還原(nitroreduction)可以活化代謝馬兜鈴酸[104] ，證實nitroreduction為 馬 兜 鈴 酸 代 謝 活 性 的 重 要 步 驟 。 其 團 隊 假 設 馬 兜 鈴 酸 代 謝 成 N-hydroxyaristolactam ， 其 可 能 進 一 步 還 原 成 aristolactams 或 通 過
Bamberger 重 新 排 列 （ Bamberger rearrangement ） 而 被 重 新 排 位 成 7-hydroxyaristolactams[105] ，如圖2.2。之後的研究發現肝臟微粒體對於 馬兜鈴酸的活化代謝能力取決於cytochrome P450 (CYP) 1A1、CYP1A2 及NADPH:CYP還原酶[106-107] ，人類的腎臟的微粒體同樣地可以還原活 化馬兜鈴酸形成DNA 鍵結物[107-108] ，其中肝臟微粒體酵素CYP1A2及 腎臟的微粒體酵素NADPH:CYP還原酶對AA-I的還原活化力最強。另 外 ， NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) 、 xanthine oxidase (XO)[109]、DT-diaphorase、cytosolic nitroreductase、prostaglandin H synthase (PHS)[110]同樣可以還原活化AA，進而與DNA作用形成DNA鍵結物。
許多關於馬兜鈴酸致突變性和致癌性在齧齒類的研究現已被作為 人類情況的模型。AA-DNA鍵結物是偵測馬兜鈴酸暴露很好的的生物指 標，同時DNA鍵結物在馬兜鈴酸腎病變的病人停藥幾年後仍可被測量到
[111]，在馬兜鈴酸腎病變的病人的腎臟和泌尿道組織，馬兜鈴酸三個專一
的 鍵 結 物 ， 其 中 最 主 要 的 是dA-AA-Ⅰ，次要的兩個是dG-AA-Ⅰ和 dA-AA-Ⅱ已被確認出來，而這些相同的DNA鍵結物也在大鼠暴露馬兜 鈴酸的組織中被偵測到[112]。p53是腫瘤抑制基因，在許多的腫瘤可以發 現p53基因的突變，超過50%的人類腫瘤都與p53基因突變相關[89]。
(Pfau W et al., Chem Res Toxicol. 1991; 4(5):581-6.) aristolactam nitrenium ion
圖2.2 馬兜鈴酸的可能活化機轉與 DNA 共價鍵結物
Cosyns在AAN病患的泌尿道上皮細胞發現有不典型分化的情況，而且這 些泌尿道上皮細胞不典型分化都有P53 蛋白過度表現的情況，顯示p53 的突變可能和馬兜鈴酸腎病變病患的泌尿道上皮癌相關[86]。Arlt等人綜 合上述觀點，對馬兜鈴酸的致癌機轉提出了假說[85, 113]，如圖2.3。
(Arlt VM et al.,Mutagenesis. 2002 ; 17(4):265-77.)
圖2.3 馬兜鈴酸的可能致癌機轉
2.1 馬兜鈴酸致氧化 DNA 傷害
許多研究證實活性氧族群(reactive oxygen species，ROS) 會使DNA 單股斷裂或產生修飾性鹼基而導致氧化DNA傷害，而DNA發生氧化性傷 害與年老、癌症有關[114-115] 。8-OHdG ( 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine)被 認為是一個主要的氧化DNA的損傷指標，8-OHdG為一guanosine鍵結 物，鍵結在ROS 的氫氧自由基 (·OH) 上， deoxyuganosine (dG)是DNA 的組成之一，當細胞內DNA鹼基guanine的第八個位置被氧化後，便形成 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG)[116]，如圖2.4 示，8-OHdG可以被 OGG1 (8-oxoguanine DNA glycosylase)切除修復[117-120]。
圖2.4 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG)之形成
馬兜鈴酸被發現對肝癌細胞也會導致氧化DNA傷害。有研究利用微
(
Reactive oxygen species (ROS)
(Kasai H et al., Environmental Mutagen Research. 1988; p73-8)
核試驗 (micronucleus test，MN)來測試馬兜鈴酸對染色體的傷害，發現 在12.5 μM至 50 μM間的馬兜鈴酸濃度，微核有明顯的增加。在觀測DNA 傷害方面，則利用螢光的變化來偵測一氧化氮 (2,3-diaminonaphthalene (DAN) assay)和 8-OHdG免疫細胞染色，發現馬兜鈴酸的濃度大於 50 μM 會導致一氧化氮和8-OHdG有明顯的增加[121]。