第四章 結果
第二節 馬兜鈴酸在HK-2 細胞的基因表現圖譜分析
馬兜鈴酸(aristolochic acid)是馬兜鈴科植物中所含的主要活性成 分，最早於1943年在Aristolochia clematitis中發現[54]。以往的文獻指出，
馬兜鈴酸在很多生物實驗系統中，被發現可以抵禦感染和發炎，包括人 類在內。例如AA-I可以抑制細菌(E. coli, Ps. Aeruginosa, S. faecalis, S.
aureus, and S. epidermides)的生長[4] ；持續3-10天給予健康受試者馬兜鈴 酸(0.9 mg/day)的雙盲試驗中，結果顯示馬兜鈴酸會提高周邊白血球細胞 的吞噬作用[55]。另外還有許多研究證實馬兜鈴酸有抗發炎的作用，而此 作用與抑制phospholipase A2 (PLA2)有關：Vishwanath發現肌肉注射或腹 腔注射Vipera russelli蛇毒的PLA2 所引起小鼠腳掌水腫，可被馬兜鈴酸所 抑制[56]；Marshll同樣發現馬兜鈴酸可以抑制蛇毒PLA2引起的小鼠腳掌水 腫[57]；Vishwanath將純化自人類關節滑液(human synovial fluid，HSF)的 calcium-dependent neutral active phospholipase A2 注射於小鼠腳掌誘發 水腫後，若把馬兜鈴酸與HSF-PLA2 混合注射小鼠腳掌，同樣發現水腫 會被馬兜鈴酸抑制且呈劑量反應關係[58]。而在體外試驗中，馬兜鈴酸亦 被證實可以抑制多種來源的PLA2 (HSF、N. naja、porcine pancreas、human platelet)引起的磷脂質水解作用；Rosenthal亦同樣發現馬兜鈴酸可以抑制 由人類中性白血球而來的calcium-dependent neutral active phospholipase A2 活性[59]。Lindahl 發現Group I及 Group II PLA2 存在敗血性休克的病 人血清中，而馬兜鈴酸與indomethacin 對Group II PLA2的抑制效果3-4 倍於對Group I PLA2[60]
。在不同發炎模式當中，皆發現馬兜鈴酸有抗發
炎的功效[57-61]，因而促進內含馬兜鈴酸的藥物使用，含馬兜鈴酸的配方
用來治療關節炎、風濕病、痛風和慢性皮膚發炎疾病[62-63]曾經盛行於 1960年代的德國。
馬兜鈴酸除了有抗感染和抗發炎的藥理作用外，其止痛作用也可能 與抑制phospholipase A2 有關。Denson研究phospholipase A2 在全身麻醉 所 扮 演 的 可 能 角 色 ， 發 現 全 身 麻 醉 劑 在 臨 床 使 用 劑 量 下 ， 會 抑 制 calcium-activated potassium channels (“big” K+ or BK channels)，而此作用 是藉由破壞phospholipase A2－arachidonic acid 的訊息傳遞系統來達 成，馬兜鈴酸I (250 μM)會抑制BK channels 達47%[64]。另外，還有有研 究顯示馬兜鈴酸可以阻礙雙氧水誘導的血小板聚集，而馬兜鈴酸也可以 經由抑制arachidonic acid訊息傳遞路徑來降低羥自由基誘導的血小板活 化[65-66]。
貳、毒理研究 1. 馬兜鈴酸腎病變
1.1 馬兜鈴酸與中草藥腎病變的緣由
1992年比利時Vanherweghem[67] 等人，發現兩名婦女發生快速進行 性腎間質纖維化(rapidly progressive interstitial renal fibrosis)且近乎末期 腎衰竭的情形，另外還有7名婦女曾服用同一家減肥診所藥物，也分別 在1991年及1992年進行腎臟透析治療，此9人當中的8人曾經接受腎臟病 理切片，病理檢查皆顯示廣泛的間質纖維化而無腎絲球病灶(extensive interstitial fibrosis without glomerular lesion) ，這些患者不是立即開始透
析治療，就是在3個月內腎功能急速惡化。於是Vanherweghem等人進行 流行病學調查，發現在此一減肥診所在過去15年從未發生問題，直至 1990年5月更換處方加入含有二味中藥：粉防己(Stephania tetrandra) 和 厚朴(Magnolia officinalis) 的處方籤後，於1992年6月隨機抽樣25名從 1990年開始服用新處方籤至少3個月的患者，結果有3位患者腎功能有減 退的情形，在排除已知毒物的可能影響因素後，Vanherweghem等人在 1993年發表論文指出這些病例的腎間質纖維化與可能與中草藥有關，隨 後 於 1994 年 Vanhaelen[68] 等 人 以 薄 層 色 層 分 析 法 (thin-layer chromatography ， TLC) 檢 查 比 利 時 進 口 12 批 所 謂 粉 防 己 (Stephania
tetrandra)的中藥材，發現其中11批誤用廣防己(Aristolochia fangchi)的情
形，而廣防己因與使用中草藥有關，隨後遂有學者將此病變命名為中草 藥腎病變(Chinese herb nephropathy, CHN)。之後1996年Schmeiser 和 2000年 Nortier [69-70]在患者的病理腎臟組織標本中偵測得較高量的馬兜 鈴酸與去氧核糖核酸(DNA)共價鍵結物，認為可能與馬兜鈴酸致突變與 致癌作用有相關，進一步確認處方中含馬兜鈴酸之中草藥可能是導致中 草藥腎病變的主要原因，於是將之正名為馬兜鈴酸腎病變（Aristolochic Acid Nephropathy，AAN）並被定義為此類腎病之名稱。自 1993 年Vanherwegherm 等提出有關中草藥腎病變的報導後，陸 續有相同或相似的病例被提出與研究：例如英國2 例[71-72]，日本2 例[73]，
O O
台灣 19 例[74-75]等，由於馬兜鈴酸是引起中草藥腎病變的主因，因而含
馬兜鈴酸的馬兜鈴科植物被聯合國所屬國際癌症研究署(IARC)認定為 已知的人類致癌物，因此各國政府開始管制含馬兜鈴酸中藥的使用與進 口。我國衛生署亦於2003 年 11 月 4 日公布禁用五種含馬兜鈴酸的藥材 (廣防己、青木香、關木通、馬兜鈴、天仙藤)。
馬 兜 鈴 酸 為 馬 兜 鈴 屬 植 物 的 主 要 成 分 ， 其 基 本 化 學 結 構 為 3,4-methylenedioxy-10-nitro-phenanthrenic-1-acid，如圖2.1所示；其中馬 兜鈴酸I是最主要的活性成分，馬兜鈴酸II次之。
COOH
O
O COOH
NO2 NO2
OCH3 H
圖2.1 馬兜鈴酸 I (左圖)與馬兜鈴酸 II (右圖)的化學結構式
1.2 馬兜鈴酸腎病變（AAN）
在比利時發現標示為粉防己的中藥被廣防己替代誤用[68] ，因而造成 所謂的中草藥腎病變，即現在確認的馬兜鈴酸腎病變。在比利時布魯塞
爾的馬兜鈴酸腎病變的病人剛開始血壓正常、早期有嚴重貧血現象，並 有噁心、嘔吐、腹痛、頻尿、少尿或血尿等症狀；尿液檢查呈現 beta 2-microglobulin、cystain C、Clara cell protein、retinal-binding protein、alpha 1-microglobulin五種低分子量蛋白(low molecular weight protein, LMWP) 增加[76]及neutral endopeptidase (NEP)減少[77]，伴有紅血球、白血球增加，
血中尿素氮(blood urine nitrogen) 、肌酸酐(creatinine)上升，最後演變成 快速進行性腎間質纖維化，這變化可以在幾個月到兩年之間發生[78]。在 其他地區則有因服用含馬兜鈴酸而導致腎小管壞死(tubular necrosis)以 致呈現Fanconi 症候群或急性腎衰竭[79-81]。中國大陸的病例因使用含馬 兜鈴酸的中藥(關木通、廣防己)單次劑量、累積劑量不同，而有較多元 的臨床表現[82]，若是在短期(甚至一次)大量服用含馬兜鈴酸中藥，則呈 現急性馬兜鈴酸腎病變，可見到急性腎小管壞死，接著發展成急性腎衰 竭。患者若是持續或間斷小量服用含馬兜鈴酸藥物後出現症狀，則呈現 慢性馬兜鈴酸腎病變，可見到慢性腎小管間質腎炎，進展到慢性腎衰竭 或快速進行性腎間質纖維化，臨床表現為夜尿增多、尿量正常或增多，
水腫不明顯，早期出現嚴重且與腎功能不一致之貧血[83]。若是患者間斷 小量服含馬兜鈴酸藥物後數月出現症狀，則呈現腎小管功能障礙，而出 現腎小管酸中毒和(或)Fanconi 症候群。
另有一項研究從馬兜鈴酸造成的Fanconic syndrome 的患者尿液分
析中發現，尿中的脯氨酸(proline)升高，而甘氨酸(glycine)數值正常，因 腎 臟 近 端 腎 小 管 刷 狀 緣 的 低 親 和 性 運 輸 系 統(low-affinity transport system)及高親和性運輸系統(high-affinity transport system)共同分泌脯氨 酸，而高親和性運輸系統分泌甘氨酸，因而推測馬兜鈴酸可能主要作用 於腎臟近端腎小管刷狀緣的低親和性運輸系統[81]。
馬兜鈴酸腎病變的主要病理特徵為在腎臟皮質淺層有廣泛性寡細 胞腎間質纖維化(extensive hypocellular interstitial fibrosis)，伴隨著腎小管 壞死及萎縮(tubular atrophy) ，腎絲球相對較完整，但多見到微血管塌 陷、基底膜出現皺摺及鮑氏囊(Bowman’s capsule)變厚的情形；因內皮細 胞水腫，使得腎小葉間動脈及入球小動脈壁變厚，故Depierreux等人推 測馬兜鈴酸造成的病理變化是血管壁為最初病灶，接著形成缺血及腎間 質纖維化，破壞部位由皮質部近端腎小管逐漸延伸至遠端腎小管，最後 導致腎絲球硬化(global glomerular sclerosis)而造成腎衰竭[84]。
1.3 馬兜鈴酸與泌尿道上皮細胞癌
在臨床上，馬兜鈴酸腎病變多有併發泌尿系統上皮細胞癌的病例報
告[71-72, 85-86]。在1994年Cosyns最先提出報告三名中草藥腎病變患者在接
受腎移植手術時，在他們同時切除腎臟及輸尿管的標本裡發現有泌尿道 上皮細胞不典型分化的情形，其中一人手術後其殘餘的輸尿管很快就有
移形細胞癌（Transitional cell carcinoma, TCC）發生[87]。Schmeiser等人 從中草藥腎病變患者的腎摘除標本發現馬兜鈴酸代謝物的DNA鍵結物 (adducts)，這種馬兜鈴酸DNA鍵結物代表馬兜鈴酸暴露的特殊標記，而 且與馬兜鈴酸的致突變性和致癌作用有關[88]。1999年，Cosyns等人進一 步發現在10名中草藥腎病變患者的19個腎摘除標本裡，全部都有泌尿上 皮細胞不典型分化的現象，其中4人有移形細胞癌；另外還發現這些病 例的不典型分化泌尿道上皮細胞都有p53過度表現的情形[86]。p53是一種 腫瘤抑制基因，根據統計人類腫瘤超過50%都與p53的突變有關[89]，上 述觀察顯示中草藥腎病變患者的泌尿系統癌症與p53突變有關。接著於 2000年，有研究統計分析曾經服用比利時布魯塞爾診所減肥藥物的105 位病患的後續追蹤，其中共有43位需要接受透析治療或腎臟移植，而其 中共有39位患者曾經接受病理組織學檢查，其中18位病患（46.1%）有 泌尿道上皮細胞癌（urothelial carcinoma），19位病患（48.7%）的泌尿 道上皮細胞呈現輕中度的分化變異（dysplasia），僅有兩位患者呈現正 常組織細胞[70]。
除了比利時的研究報告，回顧國人罹患疑似馬兜鈴酸腎病變合併泌 尿道癌的文獻報告，其中新光醫院收集了20位病例(1994至1998年) ，國 泰醫院收集了12位病例(1995至1998年)，此32為病例共有的特點為臨床 出現不知原因及快速進行的腎衰竭，但其用藥史中並沒有能得到他們服
用具有腎毒性藥物的資訊。這些患者的病理切片檢查特徵呈現腎小管上 皮萎縮及間質性纖維化，但腎絲球尚完整，類似中草藥腎病變的病理組 織變化，而這32人中有二人在幾年後發展出膀胱癌[74-75]。臺北馬偕醫院 則有一病例報告為懷疑因服用含馬兜鈴酸 (AA-I 7 μg/g)的中藥二個月 而導致近端腎小管病變 (Fanconi’s syndrome)及低血鉀症[90]。台中榮總發 現有一10歲男孩因服用含馬兜鈴酸的中藥而導致嚴重貧血、Fanconi‘s syndrome及進行性腎衰竭[91]。有臨床研究也提出，比利時馬兜鈴酸腎病 變的病人持續食入馬兜鈴屬藥物(>200克)為罹患膀胱癌的顯著危險因子
[70, 87]。
2. 馬兜鈴酸之毒性作用
馬兜鈴酸於1982 年被報導對Salmonella typhimurium可以直接誘發 突變[92] 。1983 年起Mengs陸續發表馬兜鈴酸對大鼠、小鼠具有致癌性，
可誘發胃癌(adenocarcinomas)、淋巴癌(malignant lymphomas)、腎臟癌 (aednomas)、肺癌(alveologenic carcinomas)，並且對腎臟的損害存在著劑 量反應關係[93-95]。在1991 年，Schmeiser 等人以馬兜鈴酸誘導小鼠及大 鼠產生腫瘤，然後觀察這些腫瘤組織與鄰近正常組織的基因變化。結果
可誘發胃癌(adenocarcinomas)、淋巴癌(malignant lymphomas)、腎臟癌 (aednomas)、肺癌(alveologenic carcinomas)，並且對腎臟的損害存在著劑 量反應關係[93-95]。在1991 年，Schmeiser 等人以馬兜鈴酸誘導小鼠及大 鼠產生腫瘤，然後觀察這些腫瘤組織與鄰近正常組織的基因變化。結果