3.5 EGF 對 Cten mRNA 穩定性的影響
後轉錄 (post-transcription) 調控也是影響基因表現很重要的機制之一，研究顯示 EGF 的刺激可能會促使一些 RNA 結合蛋白質結合到 RNA 的特定區域，影響該 RNA 之穩定 性 (Chen and Shyu, 1995; Weiss and Liebhaber, 1995)。基於 3.4 結果，本論文發現 EGF 調 控 Cten 表現的機制可能不在啟動子轉錄層次上，因此本論文推測 EGFR signaling 可能在 後轉錄的層次上調控 Cten mRNA 的累積。本論文首先以 100 ng/mL EGF 處理已於無血 清培養基中培養一天之 RWPE-1 4 小時，目的為誘導 Cten mRNA 進行轉錄，再以 10 nM 轉錄抑制劑 actinomycin D 進行前處理 2 小時，抑制細胞中新的 Cten mRNA 產生，接 著同時處理不含或含有 EGF 及 actinomycin D 之細胞培養液，於不同時間點分析 Cten mRNA 的含量。圖 3.5 結果顯示，在 EGF 的刺激下，Cten mRNA 的穩定性相較於未處 理 EGF 的組別並沒有顯著的提升，因此排除 EGF 調控 Cten mRNA 穩定性的可能。
3.6 於表觀基因調控層次探討 Cten 受 EGF 誘導之機制
基因表現的差異性除了轉錄層次調控啟動子活性及後轉錄層次影響 mRNA 穩定性 之外，表觀基因調控 (epigenetic regulation) 也是近年來被廣泛探討可影響基因表現的重要 調控層次。根據 3.4 及 3.5 的實驗結果，本論文已排除 EGF 透過轉錄層次及後轉錄層 次影響 Cten 的表現，於是本論文推測 EGFR signaling 誘導 Cten 的表現可能經由表觀基 因調控。已有研究顯示，短暫性轉染 (transient transfection) 到細胞的質體，其 DNA packaging 與細胞中 chromatin 的結構不盡相同 (Deroo and Archer, 2001)，若基因表現是 受 chromatin remodeling 的調節，利用質體轉染的方法可能無法反映這種調控機制，目前 已 知 的 表 觀 基 因 調 控 機 制 包 含 chromosome looping 、 nuclesome positioning 、 histone modification 及 DNA methylation 等 (Chen et al., 2010)。由於 Cten 啟動子區域中並沒有 典型的 CpG island，因此，先排除 DNA methylation 參與調控的可能性。而 chromosome looping 可能牽涉到一些如 enhancer 的 DNA 區域，但 enhancer 的位置並不一定，並且 目前沒有足夠的實驗證據指出參與調控 Cten 表現的 enhancer 區域，因此本論文先探討 nuclesome positioning 及 histone modification 參與 Cten 受 EGF 調控機制的可能性。
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3.6.1 以 nuclesome positioning 探討 EGF 調控 Cten 表現之機制
針對 nuclesome positioning，本論文初步假設 Cten 啟動子區域的 accessibility 會 因為 EGF signaling 的活化而提高，導致 Cten mRNA 的表現量上升。因此，首先利 用 Chromatin accessibility by real-time PCR (CHART-PCR, 圖 3.6 A, modified from Rao et al., 2001) 的方法來測試此假設是否成立。此方法之原理是以 micrococcal nuclease (MNase) 進行分析，MNase 為一種非專一性之 endo/exonuclease，於適當反 應條件下可分解 chromatin 結構較鬆散之處，如圖 3.6 A 所示，若未受刺激的細胞 中，某段會受調控之區域其 chromatin 結構較緊密，因此 MNase 較無法作用；當接 受刺激後，可能促使該區域發生 nucleosome positioning 導致該區域的 chromatin 結 構較為鬆散，MNase 得以對其進行分解，接著純化 genomic DNA 進行 qPCR 分析 調控之區域，若其結構鬆散而被 MNase 分解，則其 PCR 產物會在 qPCR 的過程 中於較晚的 cycle 才被偵測到，以此結果表示 MNase 對該區域的 accessibility 較 好。
本論文針對圖 3.4 結果，將具有啟動子活性之 1.8 kb 分成六個區域，並設計專一 性引子 (圖 3.6 B) 進行 CHART-PCR。圖 3.6 C 結果顯示，在 MNase 作用不同時間 後，MNase 對處理 EGF 的細胞之 Cten 啟動子之 accessibility 都較好，表示 Cten 啟 動子在 EGF 刺激之後，其 chromatin 結構較為鬆散，推測可能可以使一些轉錄因子更 容易結合，促進基因之轉錄。
3.6.2 以 histone modification 探討 EGF 調控 Cten 表現之機制
Nuclesome positioning 的 機 制 是 透 過 一 些 chromatin remodeler 來 改 變 nuclesome 的位置，而研究發現，通常 histone tail 會先被修飾之後，這些 chromatin remodeler 才會被吸引至啟動子區域 (Fyodorov and Kadonaga, 2001)，因此本論文也探 討 histone modification 參 與 調 控 Cten 表 現 的 可 能 性 。 目 前 已 知 的 histone modification 包含 acetylation, methylation, ubiquitination, sumoylation, phosphorylation
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等，本論文初步先探討 histone acetylation 參與調控 Cten 表現的可能性，細胞中調 控 acetylation 的酵素有二類，分別為 histone acetyltransferase (HAT) 與 histone deacetylase (HDAC)，當 histone tail 被 acetylation 後，被中和正電荷的 histone tail 與 帶負電 DNA 之間的吸引力較小，使 chromatin 結構較鬆散，轉錄因子較能結合至 DNA 上並促進基因轉錄。本論文假設在沒有 EGF 的情況下，會有一些 HDAC 結 合到 Cten 啟動子上對 histone tail 進行 deacetylation，使 Cten 啟動子的 chromatin 結構較緊密，導致基因無法表現；而在 EGF 刺激之下，這些 HDAC 可能會被趕走 或吸引一些 HAT 至 Cten 啟動子上對 histone tail 進行 acetylation，使 Cten 啟動子 的 chromatin 結構較鬆散，基因得以表現。
針對 HDAC 的假設，本論文嘗試使用廣泛性的 HDAC 抑制劑 Trichostatin A (TSA) 處理沒有 EGF 刺激的 RWPE-1，結果顯示，不同濃度的 TSA 並不會增加 RWPE-1 細胞株中 Cten mRNA 表現量 (圖 3.7 A) 及 Cten 的蛋白質含量 (圖 3.7 B)；另一方面，由於 in silico 分析 Cten 啟動子發現有 histone acetyltransferase p300 的可能結合位，因此，本論文利用可抑制 p300 活性的抑制劑 anacardic acid (AA) 於 EGF 誘導下同時處理細胞，結果發現 AA 可明顯的抑制 EGF 所誘導的 Cten mRNA 表現量 (圖 3.7 C) 及 Cten 的蛋白質含量 (圖 3.7 D)，且 AA 的處理並不影響 Cten 在缺乏 EGF 的環境中之基礎蛋白質含量 (圖 3.7 E)，顯示 p300 參與在 EGF 調控 Cten 表現的機制中。
除了蛋白質層次外，由於 epigenetic regulation 直接影響基因的轉錄，因此本論 文以 AA 處理 RWPE-1 後，分析 Cten mRNA 表現，才能更瞭解 histone acetylation 對其基因表現的影響，結果顯示，AA 可顯著抑制 Cten mRNA (圖 3.8 A) 及 Cten 蛋 白質 (圖 3.8 B) 受 EGF 誘導的表現量。同時，本論文也發現 p300 mRNA 的表現 量不受 EGF 及 AA 的處理而影響 (圖 3.8 C)，本論文猜測 AA 是影響了 p300 的 酵素活性使其無法對 histone tail 進行 acetylation，進而抑制 Cten mRNA 的轉錄。
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3.7 用癌症細胞株 HeLa 及 DU145 探討 Cten 受 EGF signaling 誘導之