2.3 實驗方法
2.3.2 DNA 分析與質體之建構
TurboFect Transfection Reagent (Thermo, #R0531)
以 12 孔細胞培養盤為例，將 2 µg DNA 以 SFM 稀釋成 200 µL，加 入 4 µL 之 TurboFect transfection reagent，混合均勻後於室溫靜置 15 ~ 20 分鐘。每一孔加入 200 µL 之轉染混合物，混合均勻後置於 37℃ 細胞培 養箱中。其餘條件參照廠商建議之操作流程。
2.3.2 DNA 分析與質體之建構 2.3.2.1 Genomic DNA 純化
以 Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) (Geneaid, GB100) 進 行純化，純化方法依照廠商建議之操作流程。
2.3.2.2 以聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 增殖 DNA 片段
取 0.2 mL 微量離心管，以 100 ng 之 genomic DNA 作為模版，加入 0.5 µM 引子、200 µM dNTP、5xPhusion® GC buffer (含有 7.5 mM MgCl2， 最終反應濃度為 1.5 mM)、1 U Phusion® DNA polymerase (Thermo)，以無 菌水調整體積至 50 µL，置入 PCR 恆溫控制器中進行反應。根據廠商建 議之 Finnzymes’Tm calculator 計算引子 Tm 值，若 Tm 值大於 69℃ (>
20nt) 則以 2-step protocol 進行反應，反應條件如下：
Step 1 Initial denaturation：98℃, 30 sec Step 2 Denaturation：98℃, 10 sec
Step 3 Annealing/Extension：72℃, 30 sec/kb Step 4 Final extension：72℃, 10 min
重複 Step2、3，進行 30 cycles 。 (增殖啟動子之引子列於表一)
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2.3.2.3 TA cloning
將 PCR 增 殖 產 物 以 Gel/PCR DNA Isolation System (VIOGENE, GP1002) 進行純化。於純化過之產物中，加入 10xPowerTAQ buffer (100 mM Tris-HCl, pH 9.0; 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0.1% (w/v) gelatin, 1%
Triton X-100)、100 µM dNTP (以 dNTP 代替 dATP)、1 U PowerTAQ DNA polymerase (GeneTeks, GP5500)，以無菌水調整體積至 20 µL，於 PCR 恆 溫控制器中以 72℃ 反應 20~30 分鐘。
本論文嘗試使用兩種 TA cloning system：(1) StrataCloneTM PCR Cloning Kit (Agilent Technologies, 240205-5) (2) pGM-T Ligation Kit (TIANGEN, VT202-01)。TA cloning 方法依照廠商建議之操作流程。
2.3.2.4 重組質體之轉型與篩選
將大腸桿菌 E.coli DH5α (100 µL/管) 於 -80℃ 冰箱取出後於冰上解 凍，加入適量 TA cloning 或 ligation 反應液 (體積需小於大腸桿菌之十分 之一體積)，以手指輕彈使其混合均勻後置冰浴中靜置 30 分鐘，42℃ 乾 浴槽加熱 45 秒，立刻置冰浴 5 分鐘，之後加入 1 mL 之 LB 液態培養 基 (1% Bacto tryptone, 0,5% yeast extract, 1% NaCl, pH 7.0) 混合均勻，於 37℃ 震盪培養 1 小時。將菌液以 3000 xg 進行離心 10 分鐘並倒去上清 後，加入 200 µL LB 液態培養基後，塗抹於含 100 µg/mL ampicillin 之 LB 固態培養基 (1% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto agarose, pH 7.0) 上，若需進行藍白篩選，塗抹菌液前先塗抹 40 µL 2%
X-gal 於 LB 固態培養基上) 上，培養皿於 37℃ 倒置培養 16 ~ 20 小時。
已長菌之藍白篩選培養皿，可置於 4℃ 冰箱中過夜，使偽陽性 (false positive) 之菌落顏色加深。挑選轉形成功之白色單一菌落於 5 mL 含有 ampicillin (100 µg/mL) LB 液態培養液中，於 37℃、150 rpm 培養 16 ~ 20 小時。
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2.3.2.5 質體純化
以 Gene-SpinTM MiniPrep Plasmid Purification Kit – V2 (Protech Technology, PT-MP530XL-V2) 進行純化，純化方法依照廠商建議之操作流 程。
2.3.2.6 質體 DNA 之限制酶分析
取 1 µg 質體 DNA 加入 2 µL 之 10x restriction enzyme reaction buffer (依照限制酶選擇適用的 buffer 系統) 以及 10x BSA，再加入 1 µL 限制酶 (New England Biolab, NEB)，以無菌水調整體積至 20 µL，於 37℃
反應 1 小時，再以 65℃ 加熱 20 分鐘，終止反應後置於冰上。
2.3.2.7 DNA接合法 (DNA ligation)
取適量經適當限制酶作用之 vector 及 insert DNA 片段，以 vector : insert = 1:3 之比例，調整成 vector + insert = 150 ng，加入 2 µL 之 10x T4 DNA ligation buffer (L603L, Enzymatics) 及 1 µL 之 T4 DNA ligase (L603-LC-F, Enzymatics)，以無菌水調整體積至 20 µL，於 22~26℃ 反應 1
~ 2 小時，取 5 ~ 10 µL 之 ligation 混合物進行重組質體之轉型。
2.3.2.8 DNA瓊脂糖膠體電泳法
瓊脂糖 (agarose) 濃度為 1.2%，秤取適量的 agarose 粉末於 1xTAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0) 中，製備時於微波爐加熱溶解之 瓊脂糖溶液內加入 10000 倍稀釋之 SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen, S33102)，電泳緩衝液為 1xTAE。DNA 樣品加入 1/10 體積之 10x 電泳追 蹤染劑 (50% glycerol, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 0.1 M EDTA, pH 8.0)，混勻後加入電泳膠體樣品槽內，以電壓 100 V 進行電泳。
待追蹤染劑 bromophenol blue 移動至膠體約三分之二處時即停止電泳，以 UVP DNA 影像系統觀察結果。
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2.3.2.9 DNA 片段之純化
將瓊脂糖膠體電泳分離之 DNA 片段或 PCR 產物以 Gel/PCR DNA Isolation System (VIOGENE, GP1002) 進行純化，純化方法依照廠商建議之 操作流程。
2.3.3 RNA 分析