2.3 實驗方法
2.3.7 染色質免疫沉澱 (Chromatin Immunoprecipitation assay, ChIP)
本實驗以 Imprint Chromatin Immunoprecipitation Kit (Sigma, CHP1) 進行 2.3.7.1 Bind antibody to the assay wells
以 150 µL antibody buffer 潤洗 stripwells 一次，將 1 µg 抗體加入 100 µL antibody buffer 中，混合均勻後加入 stripwells 中，以 parafilm 覆蓋 stripwells 後於 orbital shaker 上於室溫以 100 rpm 反應 60 ~ 90 分鐘。Anti-normal mouse IgG 抗體當 作負控制組，anti-RNA polymerase II 抗體當作正控制組。
2.3.7.2 Cell culture sample preparation
將約 2x106 無血清培養之細胞或處理 EGF 之細胞以無菌 PBS 潤洗一次後，於 37℃ 進行 trypsinize 5 分鐘，以含有 FBS 之 DMEM 懸浮細胞，於 15 mL 離心管 中以 200 xg 離心 5 分鐘，去除上清後以 10 mL 無菌 PBS 懸浮細胞，再以 200 xg 離 心 5 分鐘，去除上清後以 9 mL 正常細胞培養液懸浮細胞，加入 270 µl 37%
formaldehyde 使最終濃度為 1% 進行蛋白質-DNA cross link，於 orbital shaker 上以 100 rpm 室溫反應 10 分鐘。加入 1mL 1.25 M glycine 溶液終止反應，以 200 xg 離 心 5 min，去除上清後以 10 mL 冰的無菌 PBS 潤洗細胞三次，期間以 200 xg 離心 5 分鐘並去除上清。
以 400 µL Nuclei Preparation Buffer 懸浮細胞沉澱後，至於微量離心管中於冰上靜 置 10 分鐘，以 vortex 劇烈震盪 10 秒後，以 200 xg 離心 5 分鐘。以尖頭吸管小 心去除上清後，以 300 µL 含有 protease inhibitor cocktail (1:100) 之 shearing buffer 懸浮細胞核沉澱，於冰上靜置 10 分鐘，期間偶爾進行 vortex。接著於冰上以超音波 細胞破碎儀 (Sonicator 3000) 將 chromatin DNA 震碎成片段約 200-1000 bp 之 DNA 大小 (以方法 2.3.7.3 進行電泳確認 DNA 片段大小)。以 12,000 rpm 進行離心 10 分鐘後，取上清並保存於 -80℃，或是直接進行 Protein/DNA immunoprecipitation。
2.3.7.3 Optimize shearing conditions
取 50 µL 已進行 sonication 之產物，加入 2 µL 5M 之 NaCl，使最終濃度為 0.2
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M。於 98℃ 乾浴槽中反應 15 分鐘，待回到室溫後，加入 0.5 µL 20 mg/mL RNase A (Invitrogen, part no. 8003090) 於 37℃ 乾浴槽中反應 10 分鐘，以 Gel/PCR DNA Isolation System (VIOGENE, GP1002) 進行純化並以電泳分析 DNA 片段大小。
2.3.7.4 Protein/DNA immunoprecipitation
將步驟 2.3.7.2 之上清與 dilution buffer 以 1:1 混合後 (如各 50µL)，取 5% (如 5 µL) diluted supernatant 置於新的微量離心管中，並標記 “Input 5%”。
移除步驟 2.3.7.1 之 antibody solution，以 150 µL antibody buffer 潤洗 (pipetting up and down) stripwells 3 次，每 well 加入 100 µL diluted supernatant，蓋上 stripcaps，
於 orbital shaker 上於室溫以 100 rpm 反應 60 ~ 90 分鐘。
接著去除上清後，以 150 µL IP wash buffer 潤洗 stripwells 6 次，每次潤洗 2 分 鐘 ， 每 次 潤 洗 後 可 於 數 張 擦 手 紙 上 以 敲 擊 的 方 式 將 液 體 甩 乾 。 再 以 150 µL 1xTris-EDTA buffer 潤洗 stripwells 1 次。
2.3.7.5 Cross-link reversal
於 stripwells 及 input vial 中加入 40 µL 含有 proteinase K (1:40) 之 DNA release buffer，以 pipetting 進行混合，蓋上 stripcaps 後於 65℃ 水浴槽中反應 15 分 鐘。加入 40 µL reversing solution，蓋上 stripcaps 後於 65℃ 中反應 90 分鐘。
2.3.7.6 DNA purification
將 GenElute Binding Column G 置於 Collection Tube 中，加入 500 µL Column Preparation Solution，以 12,000 xg 進行離心 1 分鐘後去除濾液。將 ChIP lysate 及 400 µL Binding Solution 混合後，短暫震盪後，將溶液加入 column 中，以 12,000 xg 進 行離心 1 分鐘並去除濾液。加入 500 µL diluted Wash Solution Concentrate，以 12,000 xg 進行離心 1 分鐘並去除濾液。再以 12,000 xg 進行離心 2 分鐘使 column 離心至 乾。加入 30 µL Elution Solution 後靜置 2 分鐘，再以 12,000 xg 進行離心 2 分鐘，
若想提高回收率，可將濾液重新加入 column 中再次進行離心。
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2.3.7.7 PCR 及電泳分析
取 5 µL ChIP DNA 進行 PCR，並將 PCR 產物以 1.5% 瓊脂糖膠體電泳分析。
PCR 反應條件如下：
Step 1 Initial denaturation：95℃, 2 min Step 2 Denaturation：95℃, 30 sec Step 3 Annealing：58℃, 30 sec Step 4 Extension：72℃, 30 sec Step 5 Final extension：72℃, 10 min 重複 Step2~4，進行 50 cycles。
(ChIP 實驗中增殖啟動子之引子列於表五)
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