第三章 結果
3.5 族群變動分析
要了解
膨腹煙管蝸
族群在過去是否發生過族群擴張現象(expansion)，本研究採用中性假說測試 (Neutral theory test) 以及核苷酸變異分佈檢測
(mismatch distribution)，探討族群過去是否有擴張的情形。
中性假說 (Neutral theory) 是 1968 年由 Motoo Kimura 所提出，此理 論認為基因的變化大多數是中性突變 (neutral mutation)，也就是對生物 個 體 既 沒 有 好 處 也 沒 有 壞 處 的 突 變 。 由 電 腦 軟 體 Arlequin 3.5.2.1 (Excoffier et al., 2010) 進行檢測，使用 Tajima’s D test (Tajima, 1989) 為 分析方法，測試族群是否經歷過擴張事件。
族群核苷酸變異分佈檢測是以 Population size changes 計算族群內兩 兩個體間的核苷酸序列差異 (pairwise difference) 在統計上的分布情 形，使用模型為 constant population model，為透過核苷酸差異分佈的
形式推估族群在過去的變動情形，即是否曾經歷族群擴張。此方法使
用電腦軟體DnaSP 5.0 (Librado & Rozas., 2009) 進行計算。
第三章 結果
本研究在南台灣恆春半島 17 個樣點採樣，皆位於屏東縣境內，成功 定序 171 隻個體 16S rRNA 的部分序列。
使用 16Sar/16Sbr 引子的組合進行16S rRNA 的聚合酶連鎖反應，增 幅後定序的核酸序列長度約為 470 ~ 480 bp 左右 (圖六)，經過 BioEdit 整理、排序後所有序列包括外群總長為 375 bp。
3.1 親緣地理關係重建
使用 MODELTEST 3.7 (Posada & Crandall, 1998) and PAUP* 4.0b10 (Swofford 2003) 找出最適合煙管蝸序列的演化模型的結果，顯示煙管蝸 序列最適合的演化模型為擁有最低 BIC (Bayesian Information Criterion) 值的 GTR (general time reversible) + I (proportion of invariable sites) +G (gamma distribution) (Tavaré, 1986)。套用以上的演化模型，使用 MEGA 7.0 以 Maximum Likelihood (ML) 法建構 ML 樹；而 BI 樹則以軟體 MrBayes v.3.2.2. (Ronquist et al. 2012) 進行 Bayesian Inference (BI)。
由 NJ 法、ML 法和 BI 法所建構出的親緣關係樹得到相似的樹形結構 (圖七、圖八)，大部分的 Bootstrap 值都達到 50%以上，而 BI 樹狀圖(圖 九) 的後驗機率大部分也都達 1.0 以上，顯示出高度的節點支持度。
3.2 核苷酸組成分析
使用 MEGA7 計算出全部
膨腹煙管蝸
族群個體的鹼基組成結果 為：A 所占比例平均為 32.6%，T 所占比例平均為 35.0%，C 所占比例 平均為 13.3%，G 所占比例平均為 19.1%，結果呈現 A-T rich 的情況，是屬於大部分物種都有的現象。在 375 bp 中有 112 bp 屬於 variable sites，而其中又有 103 bp 屬於 parsimony-informative sites，有 9 bp 屬 於 singleton sites。
3.3 族群內遺傳變異分析
由 171 隻
膨腹煙管蝸
個體序列中得到的 63 個單倍型(haplotype)， 經由 DnaSP 軟體分析 17 個族群的單倍型歧異度 (Hd, Haplotype Diversity，表二)顯示各族群的 Hd 介於 0.0~1.0 之間，而整體平均 Hd 值為 0.956，顯示整體族群平均而言有極高的遺傳歧異度，以族群來說，保 力 林 場 西 (BLW) 和 內 獅 瀑 布 (NS) 有 最 高 的 單 倍 型 歧 異 度 (Hd=1.0)，其次是社頂 (SD)、熱帶植物園望海臺 (BGWH)、山海國小 (SHGS)、保力林場東 (BLE)、巴士墨段橋 (BSM) 的 Hd 值>0.8，而港 口 (GK)、石牛 (SN)、萬里桐 (WLT)、七孔瀑布 (QK)、阿朗壹 (ALY) 有較低的單倍型歧異度 (Hd<0.5)，其中石牛 (SN)、萬里桐 (WLT)、阿
朗壹 (ALY) 的 Hd 值為 0.000，表示整個族群中只有一種單倍型。
核苷酸歧異度 (π, Nucleotide divergence，表二) 分析結果顯示整體 平均π 值為 0.0714，各族群 π 值介於 0.0000 至 0.0712 之間。其中大梅 (DM) 有最高的核苷酸歧異度 (π = 0.0712)，其次為熱帶植物園望海臺 (BGWH)、鵝鑾鼻 (OLB)、社頂 (SD)、保力林場西 (BLW)、保力林場 東 (BLE)、車程龜山 (CGS)、內獅瀑布 (NS) 等 π 值 > 0.0100，其餘 的族群 π 值皆小於 0.0100，其中石牛 (SN)、萬里桐 (WLT)、阿朗壹 (ALY) 有最小值 0.0000，顯示其族群核苷酸序列沒有差異。
3.4 族群間遺傳變異分析
使用 Arlequin 3.5.2.1 (Excoffier et al., 2010) 軟體的 AMOVA 分析，測 試在不同分群方法下，族群內、族群間的分化程度，找出最適合的分群方 式，此外計算出來的 F 值分為 FCT、FST、FSC三種層級，FCT代表地理區 間的遺傳分化程度，FST 表示族群間遺傳分化程度，FSC 代地理區內族群 間遺傳分化程度 (Wright, 1965) 。若 FST > 0.25 表示族群間呈現高度分化；
若 0.15 < FST < 0.25，表示族群間屬於中度分化；若 0.05 < FST < 0.15，表 示族群間為低度分化；若 FST < 0.05，則族群間幾乎沒有遺傳分化 (Wright, 1965)。本研究對以下三種不同分群進行檢測，經分析後所得之結果如下
1. 使用地理區進行分群，可以分為五組 (圖三)：1.1 (恆春半島東坡地 形-阿朗壹 ALY)、1.2 (恆春半島西坡地形-巴士墨段橋 BSM、內獅 瀑布 NS、大梅 DM、保力林場西 BLE 和保力林場東 BLW)、1.3 (恆 春西部臺地-車城龜山 CGS、山海國小 SHGS、萬里桐 WLT、恆春 關山 HGS)、1.4 (恆春東方丘陵-社頂 SD、滿州港口 GK、七孔瀑布 QK、熱帶植物園望海臺 BGWH)、1.5 (南部珊瑚礁海岸-香蕉灣 XJ、
鵝鑾鼻 OLB、石牛 SN)。AMOVA 分析的結果顯示每個地理區間的 變異達到 33.07%，FST = 0.8737 ( > 0.25) 分化指數高且皆達顯著水 準。
2. 以道路進行分組，可以分為七組 (圖四)：3.1 (阿朗壹 ALY)、3.2 (內 獅瀑布 NS)、3.3 (巴士墨段橋 BSM)、3.4 (大梅 DM)、3.5 (保力林場 東 BLE、保力林場西 BLW、七孔瀑布 QK、滿州港口 GK)、3.6 (車 程龜山 CGS、山海國小 SHGS、萬里桐 WLT、恆春關山 HGS)、3.7 (社頂 SD、熱帶植物園望海臺 BGWH、香蕉灣 XJ、鵝鑾鼻 OLB、
石牛 SN)。AMOVA 的分析結果每個分組區間的變異為 26.79%，FST
= 0.8880 ( > 0.25) 分化指數高且皆達顯水準。
3. 以斷層進行分組，可以分為五組 (圖五)：2.1 (草埔向斜以東-阿朗壹 ALY)、2.2 (楓港溪斷層以北-巴士墨段橋 BSM)、2.3 (枋山溪斷層以 北-內獅瀑布 NS)、2.4 (大梅溪斷層至恆春斷層之間-大梅 DM、滿州
港口 GK、七孔瀑布 QK、保力林場東 BLE、保力林場西 BLW、社 頂 SD、熱帶植物園望海臺 BGWH、香蕉灣 XJ、鵝鑾鼻 OLB、石 牛 SN)、2.5 (恆春斷層以西-車程龜山 CGS、山海國小 SHGS、萬里 桐 WLT、恆春關山 HGS)。AMOVA 結果顯示每個分組的區間變異 為 22.59%，FST = 0.8754 ( > 0.25) 分化指數高且達顯著水準。
比 較 三 種 分 群 方 法 ， 以 地 理 區 進 行 分 組 的 變 異 百 分 比 最 高 (33.0%)，然而三種分群方式的 FST值皆大於 0.25，顯示族群之間有很 高的分化指數。
另外從親緣關係樹 (圖七、圖八、圖九) 得到的結果 (圖十一)，
可以知道膨腹煙管蝸的祖先，從較早期的地方開始分化成不同的兩個分 支 (branch)，並隨後延伸出不同的族群 (clade)，若以此結果進行分群，
可以分成兩大區塊 (Group A、B)，再進行 AMOVA 分析所得到樹狀圖的 分群結果 (表三) 為 FST > 0.25，顯示族群有明顯分化。而分組區塊間 (among groups) 的變異百分比為 50.78，較前三種分群方式還高，表示以 樹狀圖的結果進行分群能將遺傳相似度較高的族群分在同一組。而分組 區內族群間 (among populations within groups) 的變異百分比為 38.27，較 前三種分群方式還低，顯示這樣的分組能將遺傳差異較小的族群分在同 一組。以上的結果顯示由於親緣樹和 AMOVA 有相似的理論基礎，所得 出的分群效果最佳。
3.5 族群變動分析
當 Tajima’s D 中性假說測試的數值顯著偏離 0 時，表示族群序列 曾受到選汰 (selection) 的影響，或是經歷過顯著的族群變動。若檢測結 果為顯著負值，表示族群受到正選汰的影響，使得族群有明顯擴張的現 象；若檢測結果為顯著正值，則表示族群受到負選汰影響，造成族群的縮 減 (decline) 。本研究的結果顯示全部族群平均的值為-0.10086，但 P 值
> 0.05，呈現不顯著，表示族群變異不受選汰 (selection) 的影響。
若族群曾發生過擴張事件，則核苷酸的變異分布會呈現符合普瓦松分 佈 (Possion distribution) 的單峰分佈 (uni-modal distribution )；若是族群 穩 定 或 是 族 群 有 明 顯 分 化 ， 分 佈 圖 譜 會 呈 現 多 峰 分 佈 (multi-modal distribution) (Slatking & Hudson, 1991；Rogers & Harpending, 1992)。本研 究中的結果 (圖十一)，膨腹煙管蝸整體族群的核苷酸變異分佈圖呈現多 峰分佈的狀況，顯示族群穩定或有分化的現象。以親緣關係樹狀圖 (圖七、
圖八、圖九) 來看，應是分為 Group A、B 兩大族群 (圖十一)。而透過核 苷酸變異分佈檢測 Group A、B 兩大族群的結果 (圖十一)，Group A 族群 圖譜偏向於單峰分佈，顯示族群在過去有族群擴張趨勢，而 Group B 族 群圖譜也顯示有族群擴張的趨勢。