資料分析

2.3.1 序列整理

使用 BioEdit 7.2.5 軟體 (Hall, 1999) 將定序所獲得 16Sar 的 DNA 序 列 進 行 適 度 地 裁 剪 與 排 列 ， 首 先 將 序 列 由 5’-3’ 排 列 ， 並 加 入 外 群 (outgroup)，所使用的外群為中國浙江與研究物種同為 Clausiliidae 煙管科 的 Euphaedusa aculus (Benson, 1842)，以及在分類上曾經被歸類為同種的 Hemiphaedusa similaris (Adams, 1867) 和台灣本地 Clausiliidae 煙管科的 Hemiphaedusa pseudosheridani (Zilch, 1954)。

使用 BioEdit 7.2.5 的附屬程式 Clustal W (Thompson et al., 1994) 進 行排列 alignment，完畢後統一將有 gap 的區域剔除，完成序列的整理並 存成 FASTA 格式以利後續的分析。

2.3.2 親緣關係分析

使用電腦軟體 DAMBE (Xia & Xie, 2001) 將相同序列合併，即可得 到獨特的單倍型 (haplotype) 的序列，並將其用來做後續的親緣分析。

使用電腦軟體 Mega 7.0 (Sudhir Kumar et al., 2015)，建立 NJ (Neighbor-joining) 樹狀圖：採用 Kimura 2-parameter model (Kimura, 1980) 的參數 作為演化模型，計算兩兩單倍型間序列取代率後轉換成遺傳距離矩陣，

以 Neighbor-joining (NJ) (Saitou & Nei, 1987) 的方法重新建構親緣關係 樹 ， 分 支 的 支 持 度 以 bootstrap 方 法 進 行 1000 次 重 覆 取 樣 來 檢 驗 (Felsenstein, 1985) 。

在建構親緣關係時，使用 MODELTEST 3.7 (Posada & Crandall, 1998) and PAUP* 4.0b10 (Swofford 2003)，找出最適合煙管蝸序列的演化模型與 參數，並參考此結果進行後續 ML 樹狀圖 (Maximum likelihood tree) 與 BI 樹狀圖 (Bayesian Inference) 分析。

Bayesian Inference (BI) 以軟體 MrBayes v.3.2.2. (Ronquist et al. 2012) 以運算，同時模擬兩條的馬可夫鏈分析，在最適模型下以兩百萬代來估 計後驗機率的分布 (the posterior probability distribution)，每經過 1000 個 世代進行一次取樣，前 1/4 的世代被丟棄，以確保樹形的穩定，由此建立 BI 樹狀圖。此外，由 MEGA 7.0 (Sudhir Kumar et al., 2015) 以最大相似 法 (Maximum Likelihood analysis) 建立 ML 樹狀圖，所使用的推論方法 (ML Heuretic method) 為 Subtree-Pruning-Regrafting (SPR) ， 並 使 用 NJ/BioNJ 建立初始樹 (initial tree)，而分支的支持度以 bootstrap 方法進行 1000 次重覆取樣來檢驗 (Felsenstein, 1985) 。

2.3.3 族群遺傳結構分析

2.3.2.1 核苷酸組成分析

使 用 電 腦 軟 體 Mega 7.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0) (Kumar et al., 2015) 分析序列的核苷酸數量，variable sites 和 parsimony-informative sites，並計算四種核苷酸 A、T、C、G 所占序列的 百分比值。

2.3.2.2 遺傳變異分析（Analysis of genetic variation）

要估算族群內遺傳組成的多形性，所用的指數分別為核苷酸歧異度 (π, Nucleotide Diversity) (Nei, 1987) 、 單 倍 型 歧 異 度 (Hd, Haplotype Diversity) (Nei et al., 1983)。以上歧異度的指數使用電腦軟體DnaSP 5.0 (Librado & Rozas., 2009) 進行計算，結果均可代表族群內的遺傳變異，

但所表現的觀點不同，π 表示族群中不同個體序列間的差異，和基因型 無關，而 Hd 代表族群內不同單倍型的數量與頻率，和不同個體間的序列 的差異無關，不會受到其序列上變異的影響 (Graur & Li, 2000 ; Avise, 2000)。

2.3.4 族群遺傳分析

使用電腦套裝軟體Arlequin 3.5.2.1 (Excoffier et al., 2010) 計算出族群 內、族群間的遺傳分化指數 (FST) 以及進行分子變異數分析 (AMOVA, analysis of molecular variance)。該軟體會將族群間的序列隨機排列1000次，

然後檢視F統計結果是否達到顯著水準。

找出造成族群破碎化的分群方式有三種，第一是以地理上的差異作 為分群標準，依據內政部國家營建署墾丁國家公園管理處，恆春半島分 為七大地理區：

1.恆春半島西坡地形 2.恆春半島東坡地形 3.車城尖山地形 4.恆春東方丘 陵 5.恆春西部台地 6.恆春縱谷平原 7.南部珊瑚礁海岸。第二則是以斷層 的走向作為分群標準，第三是以道路的分布作為分群標準。以上三種分 群方式會以 AMOVA 做為檢測，尋找出最適合的分群方式。

另外，也會以 AMOVA 檢測 17 個採樣點間族群的分化指數，並進行 討論。

2.3.5 族群變動分析

要了解

膨腹煙管蝸

本研究採用中性假說測試 (Neutral theory test) 以及核苷酸變異分佈檢測

(mismatch distribution)，探討族群過去是否有擴張的情形。

中性假說 (Neutral theory) 是 1968 年由 Motoo Kimura 所提出，此理 論認為基因的變化大多數是中性突變 (neutral mutation)，也就是對生物 個 體 既 沒 有 好 處 也 沒 有 壞 處 的 突 變 。 由 電 腦 軟 體 Arlequin 3.5.2.1 (Excoffier et al., 2010) 進行檢測，使用 Tajima’s D test (Tajima, 1989) 為 分析方法，測試族群是否經歷過擴張事件。

族群核苷酸變異分佈檢測是以 Population size changes 計算族群內兩 兩個體間的核苷酸序列差異 (pairwise difference) 在統計上的分布情 形，使用模型為 constant population model，為透過核苷酸差異分佈的

形式推估族群在過去的變動情形，即是否曾經歷族群擴張。此方法使

用電腦軟體DnaSP 5.0 (Librado & Rozas., 2009) 進行計算。