第一節 菌株來源
本研究收集 2014 年至 2017 年間，從國立臺灣大學生物資源暨農學院附設動 物醫院看診犬貓檢體，凡藉由 Vitek 2 Compact (Biomérieux, Marcy-I’Etoile, France) 鑑定出的微生物菌種為大腸桿菌者，則加以收集，並使用商品化凍菌管
(MicrobankT M, Richmond Hill, Canada) 保存菌種凍存於-80 ˚C 冰箱，以作為後續實 驗所需。
第二節 ESBL 表現型鑑定
根據 CLSI 規範 [54]，Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Escherichia coli、
Proteus mirabilis 四種細菌可以用紙錠擴散擴散 (disc diffusion) 方法進行 ESBL 表 現型確認試驗 (phenotypic confirmatory test)。此方法主要是利用 ESBL 抑制劑 clavulanic acid 去抑制 β-lactamase 後，導致第三代頭孢子素藥效增強，使抑菌圈增 加的特性加以區別。本實驗所分離之 E. coli 會依據 CLSI 所規範進行 ESBL 表現 型鑑定分析。首先將待測菌株從-80 ˚C 冰箱中拿取出來，使用無菌接種針將凍菌保 存管中的玻璃珠取出一顆放至於 3ml 的 Mueller-Hinton broth (MHB) (BD Difco™, New York, USA) 中，以 37 ˚C 培養至 McFarland 值為 0.5 時，以無菌棉棒沾取菌 液於 Mueller-Hinton agar (MHA) (BD Difco™, New York, USA) 塗盤，再貼上四種 不同抗生素紙錠，分別為：Ceftazidime 30 μg (CAZ) (Mast group)、Ceftazidime 30 μg - Clavulanic acid 10 μg (CAZ/CA) (Mast group)、Cefotazime 30 μg (CTX) (Mast group)、Cefotazime 30 μg -Clavulanic acid 10 μg (CTX/CA) (Mast group)，以 37 ˚C 培養 18-24 小時後判讀結果。
測量 CAZ/CA 與 CAZ 和 CTX/CA 與 CTX 的抑制圈差距，若 CAZ/CA-CAZ ≧ 5 mm 或 CTX/CA-CTX ≧ 5 mm 則判定為 ESBL 陽性菌株。
本實驗分別以 K. pneumoniae ATCC®700603 和 E. coli ATCC®25922 作為 ESBL 陽性與陰性對照組。
第三節 萃取細菌 DNA (加熱煮沸法)
以加熱煮沸法 (Boiling method) 進行 ESBL 陽性 E. coli DNA 萃取。先將保存 於凍菌管中的細菌以 37˚C 培養在 3 ml MHB 轉速 225 rpm 搖轉至隔天，取 1 ml 菌液，10,000 xg 離心 10 分鐘，倒掉上清液留下片狀沈澱物 (pellet)，加入 0.5 ml 二 次去離子水 (distilled deionized water, ddH2O) 並震盪搖晃均勻，套上微量離心管防 爆蓋後放入沸水中加熱 10 分鐘，以 12,000 xg 離心 10 分鐘，取出含核酸之上清液，
保存於-20˚C 冰箱中，待後續 PCR 作為模板 (template) 使用。
第四節 抗微生物藥物敏感性試驗
根據 CLSI (2011 年) [80]動物源分離菌株抗微生物藥物敏感性試驗規範建議進 行紙錠瓊脂擴散試驗 (Disc agar diffusion method)。
將待測菌株從-80 ˚C 冰箱中拿取出來，使用無菌接種針將凍菌保存管中的玻璃 珠取出一顆放置 3ml 的 MHB 中以 37 ˚C 培養 McFarland 值為 0.5 時，以無菌棉棒 沾取菌液於 MHA 塗盤，再貼上藥物測試紙錠後以 37 ˚C 培養 18-24 小時後判讀結 果，依據抑制圈直徑大小對照 CLSI 所規範的標準去做判讀結果。
本實驗所使用之抗生素紙錠分別為 Amoxycillin/ clavulanic acid 20 μg/ 10 μg (Oxoid)、Ampicillin 10 μg (Oxoid)、 Imipenem 10 μg (Oxoid)、 Ceftiofur 30 μg (Oxoid)、 Doxycycline 30 μg (Oxoid)、 Enrfloxacin 5 μg (Oxoid)、 Ciprodloxacin 5 μg
(Oxoid)、 Gentamicin 10 μg (Oxoid)、 Sulfamethoxazole/ trimethoprim 23.75 μg/ 1.25 μg (Oxoid)。
第五節 β-lactamase 基因型測定
將萃取之細菌核酸針對 blaT EM、 blaSHV以及 blaCT X-M groups 包含：CTX-M-1、
CTX-M-2、 CTX-M-8、 CTX-M-9 和 CTX-M-25 基因群所設計之引子對進行 PCR 片段的擴增。其操作方法如下：
於 0.2 ml 微量管中加入 5 μl DNA template、25 μl 2X master Mix (
TIANGEN, Beijing, China) 以及 10 μＭ引子對各加入 1μl，在加入 18 μl ddH2O 使反 應總體積為50 μl，放入 PCR thermocycler (SensoQuest GmbH, Goettingen, Germany) 進行 PCR 反應，各引子序列見 Table 1。
PCR 反應條件：Pre-denaturation 95˚C、5 分鐘。 Denaturation 95˚C、30 秒。
Annealing 溫度依引子對而定 (Table1)、40 秒。 Extension 72˚C、1 分鐘，共 35 循環。 Final extension 72˚C、10 分鐘反應，最後產物保存於 4˚C。
PCR 反應結束後將 50 μl之 PCR 產物加入 0.7% (w/v) agarose gel，使用 Mupid-2 plus (含電源供應器) 以 100 伏特並於 0.5X TAE 緩衝液 (Omics Bio, Taipei, Taiwan) 中進行凝膠電泳25 分鐘，之後將膠體置入核酸安全染劑 (Omics Bio) 進行染色 25 分鐘，再將膠片置於紫外光透照相中 (Major Science, Saratoga, State of California) 確認DNA 片段擴增結果。
將預期產物片段切膠送至明欣生物科技，利用 ABI 3730xl 毛細管電泳 (capillary electrophoresis, CE) 自動定序儀和相對引子對進行定序，將序列結果與 β-lactamase database (http://bldb.eu/BLDB.php?prot=A#CTX-M) [56]進行核酸序列 比對，判定各基因型別。
第六節 MLST 序列定序分析
為了瞭解 ESBL 基因是透過自體複製傳播 (clonal spread) 或垂直傳播
(horizontal gene) 的方式傳遞，將具有 ESBL 特徵的 E. coli 菌株以 MLST 的方式進 行序列分析，依據Wirth 等人 [81] 將 E. coli 七段管家基因 (housekeeping gene)：
adk (adenylate kinase)、 fumC (fumarate hydratase)、gyrB (DNA gyrase)、icd (isocitrate/isoprppylmalate)、mdh (malate dehydrogenase)、purA (adenylosuccinate dehydrogenase)、recA (ATP/GTP binding motif) 進行 PCR 片段擴增與定序，引子序 列見Table 2。其操作方法如下：
於 0.2 ml 微量管中加入 5 μl DNA template、25 μl 2X master Mix 以及 10 μＭ引 子對各加入1 μl，在加入 18 μl ddH2O 使反應總體積為 50 μl，放入 PCR thermocycler 進行 PCR 反應，各引子序列見 Table 2。
PCR 反應條件：Pre-denaturation 95˚C、5 分鐘。 Denaturation 95˚C、30 秒。
Annealing 溫度依引子對而定 (Table1)、40 秒。 Extension 72˚C、1 分鐘，共 35 循環。 Final extension 72˚C、10 分鐘反應，最後產物保存於 4˚C。
其各管家基因座定序結果與 MLST 資料庫 (https://pubmlst.org/) 做比對，最終 的Sequence types (STs) 以 BioNumerics Software version (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) 建構 ESBL-producing E. coli minimum spanning tree 親緣樹狀圖。
第七節 PCR 檢測 ST131 O25b 之測試
依據 Clermont 等人 [82] 所提供之方法，將萃取之細菌核酸進行針對 ST131 O25b 所設計之引子對 (詳見 Table1) 包含：trpA 和 pabB 進行 PCR 片段擴增。操 作方法如下：
於 0.2 ml 微量管中加入 5 μl DNA template、25 μl 2X master Mix 以及 10 μ Ｍ引子對 (trpA 和 pabB) 各加入 1μl，在加入 16 μl ddH2O 使反應總體積為 50 μl，
放入 PCR thermocycler 進行 PCR 反應，各引子序列見 Table 3。
PCR 反應條件：Pre-denaturation 94˚C、4 分鐘。 Denaturation 94˚C、5 秒。
Annealing 65 ˚C、10 秒，共 30 循環。Final extension 72˚C、5 分鐘反應，最後產物 保存於4˚C。