超廣譜性乙內醯胺酶

β-lactamase 為細菌所分泌的一種酵素，可以與 β- lactam ring 形成非共價性鍵結，

再藉由醯基化 (acylation) 的作用將 β-lactam ring 破壞打開，最後水解 (hydrolysis) 釋出β-lactamase 及被去活化的 β-lactam 類抗生素結構。ESBL 主要是由革蘭氏陰 性菌所產生β-lactamase 的胺基酸序列經突變而來的。

β-lactamase 的分子結構大致相同，僅有一到四個胺基酸上的差異。而並非所 有的 TEM、SHV均為超廣譜性乙內醯胺酶 (extended-spectrum β- lactamase, ESBL)，

如 TEM-1、TEM-2、TEM-13 以及 SHV-1 屬於原始的 β- lactamase，通常只對 penicillin、

第一代和第二代頭孢子菌素具有抗藥性，其抗藥性範圍較窄。若是β-lactamase 發 生胺基酸的突變 (mutation) 或者置換 (substitution)，使原來的分子結構構型的改 變，變得更穩定，增加對第三代頭孢子菌素和單環內醯胺類等抗生素產生抗藥性，

提高了原始的β-lactamase 的抗藥性，將此類的 β-lactamase 稱為 ESBL。

ESBL 可以被 β- lactamase 的抑制劑所抑制，β- lactamase 的抑制劑是由 β- lactam 結構所衍生出來的藥物 (如：clavulanic acid、sulbactam 以及 tazobactam)，具有 β-lactam ring 可以與 PBPs 結合或是與 β-lactamase 產生不可逆的反應。因此當 β-lactamase 抑制劑與 β-lactam 類抗生素一起使用時可以避免 β-lactam 類的抗生素 被β-lactamase 水解而失去活性，即使如此，細菌也產生出對應的生存之道，產生 過量的β-lactamase 或者改變外膜蛋白通透性等方式來抑制或者減少 β-lactamase 抑 制劑的活性而產生抗藥性。[42]。

2-4-1. β-lactamase 分類

目前對於β-lactamase 的分類主要可以分為兩大類：Bush Group 和 Ambler Class。

1. Bush Group

Bush 等人在 1989 年提出依據 β- lactamase 的功能性進行分類，但由於 TEM 和 SHV 衍生的 β- lactamase 數量增加，因此將其衍生物再加以分類，而分類的依據是 以 1989 年版本在新增子分類。分類方式是依據 β-lactamase 對抗不同 β- lactam 抗生 素的作用及受到 clavulanic acid 抑制程度可以分為四個 group 以及數個 subgroups [43]。

Group 1：以 cephalosporinase 且不被 clavulanic acid 抑制的為主，如 CMY、

ACT、DHA、FOX 和 MIR 等。在 Ambler 的分類中是屬於 Class C。

Group 2：以 cephalosporinase 或 penicillinases 且可被 clavulanic acid 抑制為主，

再依據對不同抗生素的水解能力再加以細分為 2a、2b、2be、2br、

2ber、2c、2d、2df、2e 和 2f 等 subgroups，其 TEM、SHV、OXA 和 CTX-M 衍生的 β-lactamase 屬於此類，TEM 和 SHV 所衍生的

β-lactamase 屬於 2b、2be、2br 以及 2ber，OXA 衍生的 β- lactamase 屬 於 2d、2de、2df，而 CTX-M 衍生的 β-lactamase 屬於 2be。在 Ambler 的分類中 Bush 2a、2b、2c、2e、2f 屬於 Class A，而 Bush 2d 屬於 Class D。

Group 3：含有鋅離子的酵素又稱金屬酵素 (metallo-enzyme)，水解 penicillins、

cephalosporins 和 carbapenems，不被 clavulanic acid 抑制，但會被 EDTA、dipicolinic acid 或 1,10-o-phenanthroline 抑制。在 Ambler 的 分類中是屬於 Class B。

Group 4：不受 clavulanic acid 抑制的 penicillinases，目前 Ambler 對於該分類尚

未找到適合相對應的 class。

2. Ambler Class

Ambler 等人依據水解酶的氨基酸序列進行分類，將 β-lactamase 分為四個 classes：A、B、C、D。Classes A、C 和 D 是屬於 active-site serine-β-lactamases，

其β-lactamases 是通過 active site serine 形成 acyl enzyme 水解 β-lactam，而 class B 是屬於 metallo-β-lactamases，該類的 β- lactamases 是利用至少一個的 active-site 和 鋅離子催化反應促進β-lactam 水解，其中現在又以 class A 和 C 是為最常出現的 classes [44, 45]。

Class A：在 serine-β-lactamases 中佔了最大多數，具有水解 penicillin 的能力，

不論是在序列或是結構上皆與 PBPs 極為相

似，包含 TEM、SHV、PER/VEB/TLA-1 和 GES/IBC types

ceftazidimases、 SFO-1/BES-1 和 CTX-M types cefotaximases [46]。在 Class A 中最具代表性的 β-lactamase 為 TEM、SHV 和 CTX-M type。

Class B：屬於 metallo-β- lactamases (MBLs)，需要二價離子的活化，通常以鋅離 子最為常見。IMP family、VIM family 等 carbapenemases 皆被歸類於 Class B β-lactamase 中。

Class C：屬於 cephalosporinases，多位於 Enterobacteriaceae 和一些其他生物的 染色體和質體上，第三代頭孢子菌素原本被使用來治療 β-lactamase- producing 的病原菌，但從 1980 年代開始，臨床上已經發現有可以對 抗第三代頭孢子菌素 (ceftazidime、cefotaxime、cefpodoxime 及 ceftriaxone) 和 monobactams (aztreonam) 的病原菌產生 [14]。

在 Class C 中其最具代表性的 β-lactamase 為 AmpC β-lactamase。

Class D：屬於 oxacillinase，主要是水解青黴素類的 oxacillin 和 cloxacillin，對

carbapenems 水解能力較差，在 Class D 中最具代表性的 β-lactamase 為 OXA-type β-lactamase。

2-4-2. ESBLs 基因型

ESBL 是在革蘭氏陰性菌中所發現，特別是在綠膿桿菌和腸內菌科，其中又以 Escherichia coli 和 Klebsiella pneumoniae 為最重要的兩種，在其他致病性細菌如 Salmonella、Shigella、Proteus、Enterobacter、Citrobacter 等細菌中也有發現 [47]。

ESBLs 的抗藥性基因大多位於質體上，藉由質體的複製與接合作用可以在不同細 菌間傳遞，也可能使原本不會產生β-lactamase 的腸道菌叢獲得抗藥性質體產生抗 藥性 [2]。

ESBLs 的相關基因型主要可以分為 TEM、SHV、CTX-M、OXA、PER、VEB、BES、

GES、TLA、SFO、IBC 等，其中又以 TEM、SHV、CTX-M 這三種為目前最常見 基因型 [2]。

1. TEM (Temoneria)

1965 年在希臘名為 Temoneria 的女性患者中，發現第一個存在於 E. coli 中藉由 質體傳播的β-lactamase，故就按照這名患者名字來命名為 TEM-1 [48]，而後來 在 1985 年發現了 TEM-2，與 TEM-1 結構差異僅一個胺基酸不同，且對青黴素 類或者其衍生藥物具有水解的能力，TEM-1 和 TEM-2 在分類上為非 ESBLs [49]。

然而所有的 TEM type ESBLs 皆是 TEM-1 和 TEM-2 的衍生物，TEM-3 在 1984 年法國的 K. pneumoniae 分離株所發現，與 TEM-2 差了兩個胺基酸，但卻對 cefotaxime 產生抗藥性。目前約超過 200 個 TEM type 被發現，對於不同 TEM type 對於抗藥性程度也有所差異 [50]。

2. SHV (sulfhydryl variable)

SHV type 跟 TEM type 在結構上有許多相似之處，SHV-1 是在 1980 年代於 歐洲發現，對青黴素和第一代頭孢子菌素具有活性，目前的 SHV type ESBLs 皆為 SHV-1 衍生物，透過質體傳遞。其中大部份 SHV type ESBLs 胺基酸序列 位於第 238 位點會由原來的 glycine 取代為 serine，有的則是在第 240 位點從 glutamic acid 轉變為 lysine 或 arginine 時，促使對 ceftazidime 和 aztreonam 具有 水解能力。目前大約有 46 種的 SHV type 是屬於 ESBLs，有 150 種為非 ESBLs，

其中最常見非 ESBLs 的為 SHV-11 [51]。

3. CTX-M (Cefotaximase-Munich)

CTX-M type 被視為目前最重要的 ESBL β- lactamase 族群之一，屬於 Class A β-lactamase，過去研究指出帶有 ESBL 基因的細菌以 TEM type 和 SHV type 為 主，但自從 1989 年在德國慕尼黑 (Munich) 發現 CTX-M type 後，到 1995 年 就快速擴張至全球，ceftazidime 對 TEM 和 SHV 具有活性可以有效抑制攜帶 TEM、SHV 抗藥性基因的細菌，但對 CTX-M 不具活性，促使 CTX-M type 成 為近年來新興的 ESBL 基因原因之一，快速的分佈在世界各地。

在 CTX-M 的分類中，依據 Bonnet 在 2004 年用親緣分析 (phylogenetic analysis) 的方法將其分為五個 groups 分別為：CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、

CTX-M-9 和 CTX-M-25，各 groups 之間約有大於 10%胺基酸差異，而各 groups 內每個 CTX-M type 彼此之間會以一個至數個不等的胺基酸差異 [52]。

2-4-3. ESBL 表現型的檢測

在 ESBL 表現型偵測中，不同實驗室使用不同的方法與參考的範圍可能 有所差異，在 ESBL 表現型偵測上目前比較常用的有雙紙錠協同測試法 (double disc synergy test, DDST)、最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration,

MIC)、等電點聚焦 (isoelectric focusing, IEF) 和分子生物法 (例如：聚合酶連 鎖反應 polymerase chain reaction, PCR) 等等。再依據美國臨床與實驗室標準協 會 (Clinical and Laboratory Standards Institutes, CLSI) 準則，進行紙錠擴散 (disc diffusion) 方法分析，及 ESBL 表現型確認試驗 (phenotypic confirmatory test) [53]。

i 雙紙錠協同測試法 (double disc synergy test, DDST)

標準的 DDST 是以第三代頭孢子菌素紙錠與 β-lactamases 抑制劑 (如：

clavulanic acid) 進行測試，當第三代頭孢子菌素產生的抑制圈邊緣有明顯的往 抑制劑的方向延伸時，即為協同作用。但有些 ESBL 菌株同時帶有 AmpC

β-lactamases 不受 clavulanic acid 抑制且同時具有水解第三代頭孢子菌素的能力，

造成結果呈現偽陰性，使其表現型上造成誤判，故目前大多是使用改良的雙紙 錠協同試驗 (Modification of double-disk test, MDDST) 進行表現型分析，避免 偽陰性的產生。MDDST 除了使用第三代頭孢子菌素之外還要加上第四代頭孢 子菌素紙錠 (如:cefepime) 做檢測，當協同作用只作用於第四代頭孢子菌素時，

就表示該檢測菌株是 ESBL 和 AmpC β-lactamases 的 co-producer。

ii 等電點聚焦 (isoelectric focusing, IEF)

抽取待測菌株之 β-lactamases 進行電泳，電泳結束後再利用 nitrocefin 為受 質來呈色，並量測距離，再依據目前已知的β-lactamases 的 pI 值作為標準值，

畫出回歸曲線，將得到的結果與已知的β-lactamases 的 pI 值去做推論可能的 β-lactamases 種類。但因為蛋白質在進行電泳時，容易受到干擾造成位移或誤 差，因此 pI 值只能做為參考。

iii ESBL 表現型確認試驗 (phenotypic confirmatory test)

根據 CLSI 規範 [54]，Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、

Escherichia coli、Proteus mirabilis 四種細菌可以用紙錠擴散擴散 (disc diffusion) 方法進行 ESBL 表現型確認試驗 (phenotypic confirmatory test)。此方法主要是 利用 ESBL 抑制劑 clavulanic acid 去抑制 β-lactamase 後，導致第三代頭孢子素 藥效增強，使抑菌圈增加的特性加以區別。

2-4-4. ESBL 基因型的檢測

在 ESBL 的基因型檢測中，較為常見的方法為聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)、脈衝式電泳 (pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) 與基 因定序 (DNA sequencing) 等方法。其中又以 PCR 為最常使用檢測 ESBL 基因 型別的方法 [55]。

依據 β-lactamase 基因序列 (如 blaT EM、blaSHV、blaCT X-M等) 設計相對應引 子 (primer)，萃取待測菌株之核酸進行 PCR 片段增幅，檢測待測菌株是否帶有 ESBL 基因，再將所增幅之產物送定序，再將序列結果與 β-lactamase database (http://bldb.eu/BLDB.php?prot=A#CTX-M) [56]進行核酸序列比對，判定各基因 型別，除了 TEM-1、TEM-2、TEM-13、SHV-1 和 SHV-11 為非 ESBLs 之外，

其餘型別均為 ESBLs。