9 週大體重約 200g 的自發性高血壓大鼠購自於國科會國家實驗動物 及研究中心，在 11 週大進入實驗之前飼養於台大醫學院動物中心。實驗 動物餵養以普通大鼠飼料(Lab Diet 5001)，並且供應充足飲水。飼養環境有 恆定的溫溼度控制，定期更換木屑墊底，以及固定的光週期控制系統。在 進入實驗之前接受定期的體重與健康檢查，已確定實驗動物的健康狀態。
第二節 生理訊號遙測監視系統
生 理 訊 號 遙 測 監 視 器 (model TL11M2-C50-PXT, Data Sciences International, St. Paul, MN, USA)以手術方式將感測與發報器植入實驗動物 體 內 後 ， 可 以 將 實 驗 動 物 包 括 體 溫 (Body Temperature) 、 心 電 圖 (Electrocardiography, ECG)和體位運動狀態等生理資訊利用無線電波頻 (Radio frequency)收發原理傳出體外。利用體外收訊器，將所接受到的生理 訊號收集到 IBM 個人電腦相容機型電腦裡以供在線監視與離線分析之 用。生理訊號遙測監視系統被譽為現代生理學研究的尖端科技，可以在清 醒而自由活動的實驗動身上監視其生理訊息而不會加重其壓力反應(Stress Responses)。對研究者而言，特別是在生理學與毒理學領域中，這套系統 可以有效地量測分子、細胞、乃至組織對生物體所產生的生理與病理反 應，從而提高將研究結果推論到人體身上時的有效性與安全性。到目前為 止，已經有足夠的證據顯示使用生理訊號遙測監視系統的有效性。除了能 夠收集大量生理資訊以做在線和離線分析之外，這個系統還能有效地照顧 到 實 驗 動 物 的 權 益 ﹝ 減 少 實 驗 動 物 量 以 及 減 少 收 集 訊 號 所 帶 來 的 痛
苦﹞，並且大量降低實驗成本(Kramer and Kinter, 2003)。
實 驗 持 續 的 期 間 以 美 國 D.S.I 公 司 無 線 電 信 號 收 集 器 (Radiotelemetry)，以無間斷式全天候收集生理訊號，包括活動量、體溫、
心電圖三個參數。心電圖的取樣頻率為 1000Hz，活動量和體溫的取樣頻率 為 250Hz，其數位資料由 IBM 個人電腦相容機型儲存於硬碟以供事後分析 (off-line analysis)。
第三節 主要的生物活性成分
根據新莊超級測站所進行的微粒毒性研究結果顯示，微粒中有三大 類具有生物活性的成份：金屬成份、細菌內毒素(Endotoxin)、與含碳成份。
我們以此三大類成分懸浮液 0.25cc，以氣管灌注模式在自發性高血壓大鼠 身上分別測試其所產生的心血管毒性。我們以金屬成份硫酸鎳([NiSO
4
]=263 μg/0.25ml 以及 526 μg/0.25ml)和硫酸鐵([Fe
2
(SO4
)3
]= 105 μg/0.25ml 以 及 210 μg/0.25ml) (Campen et al., 2002)和細菌內毒素(Endotoxin 500μg in Normal Saline 0.25cc, LPS, Escherichia coli O26:B6, contains not less than 500 EU/mg from Sigma, St. Louis, MO) (Arimoto et al., 2005)水溶液進行氣 管灌注實驗。另外一方面，Phenanthraquinone (PAQ, 15μg in Normal Saline 0.25cc) ( Hiyoshi et al., 2005b)懸浮液將被用來代表 PAH 的成分進行測試。此外，參照本實驗室過去的研究成果，我們也以超細粒徑碳黑(ultrafine Carbon Black, 14 nm, [ufCB]= 2870 μg/kg)同時合併低劑量的硫酸鐵和硫酸 鎳進行暴露實驗。
另外，爲了建立起國內關於不同季節與不同粒徑懸浮微粒的實驗動 物自主神經系統毒性資料，藉以提供風險評估及法規控制有用的資訊，我 們參照本實驗室過去的研究成果，探討了自發性高血壓大鼠動物暴露於不 同季節與粒徑的超級測站濃縮微粒以及模擬超級測站濃縮微粒成分之心 血管毒性效應。取自環保署新莊超級測站的濃縮空氣微粒，依照不同的季
節﹝秋季微粒為 2005 年 9 月到 11 月所收集者，春季微粒為 2006 年 2 月 到 4 月所收集者﹞，以及不同粒徑﹝細粒徑為 PM
2.5
以下的微粒，粗粒徑 為 PM2.5
到 PM10
之間的微粒﹞分別予以處理，並懸浮於 0.25cc 的 PBS 中，以每隻 SHR 200 μg的劑量進行氣管灌注的暴露實驗。
此外，爲了便於表述各類測試物質的相對毒性，我們也以柴油引擎 微粒標準品(Diesel Exhaust Particles, DEPs)暴露所得的心血管毒性當作比 對標準。標準柴油引擎微粒，購自美國國家標準局(NIST SRM 2975, National Institute of Science and Technology)，將微粒配置成懸浮溶液(in normal saline)，為了減少柴油引擎微粒在懸浮溶液中凝結(aggregation)，在 溶液配置及氣管灌注前，於超音波震盪器震盪 15 分鐘，並在 1 分鐘之內 完成均勻混和。實驗組各給予氣管灌注500μg in Normal Saline 的懸浮溶液 0.25cc。
第四節 氣管灌注暴露
實驗動物在吸入性麻醉氣體 Sevoflurane®全身麻醉之下，採仰角 60 度仰臥姿勢固定四肢。另以器械張開實驗動物之口腔，以 14 號鐵氟龍靜 脈留置管經由口腔伸入氣管內。以小型抽吸球(Suction Ball)少量灌氣數 次 ， 並 觀 察 實 驗 動 物 胸 部 氣 動 的 方 式 來 確 認 灌 注 管 在 氣 道 中 的 位 置 (Mauderly 1977)。各實驗動物以 1cc 空針將待測懸浮溶液 0.3ml 灌注進入 氣管內。再以抽吸球灌氣數次，以求灌注物均勻抵達深部肺頁組織，並防 止實驗動物因氣道異物窒息致死。移除灌注管後，將實驗動物至於溫暖烤 燈下進行麻醉恢復。
第五節 實驗步驟與流程
如下圖所示，自發性高血壓大鼠於植入生理訊號遙測監視器後至少 休養 10 天以上才進入實驗(Day 1)。以 self-control 實驗設計進行短期暴露，
於實驗的第一週接受生理食鹽水 0.25cc 之氣管灌注。並於氣管灌注後以美 國 D.S.I 公司無線電信號收集器(Radiotelemetry)，以無間斷式全天候收集生 理訊號達 72 小時作為基線數據(Baseline Data)。於實驗第二週的同一時段 (Day 8)接受待測微粒懸浮液 0.25cc 之氣管灌注，並收集其生理訊號 72 小 時作為暴露數據(Exposure Data)。自發性高血壓大鼠於暴露數據收集完畢 之後，在 Pentobarbitol 進行全身麻醉之下以腹主動脈採集血樣方式犧牲。
其中的待測微粒懸浮液包括：硫酸鎳 263μg 以及 526μg in PBS 0.25cc 和硫酸鐵 105μg以及 210μg in PBS 0.25cc 水溶液；細菌內毒素 500μg in PBS 0.25cc 和 PAQ 懸浮液 15μg in PBS 0.25cc；超細粒徑碳黑 2870 μg/kg 同時 合併硫酸鎳 263 μg以及硫酸鐵 105 μg的暴露；秋季細粒徑濃縮空氣懸浮 微粒﹝Fall PM
2.5
﹞200 μg；秋季粗粒徑濃縮空氣懸浮微粒﹝Fall PM2.5-10
﹞ 200 μg；春季細粒徑濃縮空氣懸浮微粒﹝Spring PM2.5
﹞200 μg；春季粗粒 徑濃縮空氣懸浮微粒﹝Spring PM2.5-10
﹞200 μg；以及柴油引擎微粒標準品 500 μg in PBS 0.25cc。第六節 心跳速率與心跳速率變異性分析
實驗持續的期間以無間斷式全天候收集生理訊號，包括活動量、體 溫、心電圖三個參數。心電圖的取樣頻率為 1000Hz，活動量和體溫的取樣
Day 1 Day 3 Day 8 Day 11
Baseline data collection
（3 days）
Exposure data collection
（3 days）
IT normal saline IT Testing Materials 0.3ml
頻率為 250Hz，其數位資料由 IBM 個人電腦相容機型儲存於硬碟以供事後 分析(off-line analysis)。
心跳速率以套裝軟體DataquestA.R.T.™ Analysis(A.R.T.™ Analysis version 2.20 Data Sciences International, St. Paul, MN, USA)將所收得訊號運 算而得。同一軟體並可以測量 ECG 中每個 RR Intervals 間距，我們將以自 行開發的軟體程式計算其時間義域的心跳速率變異性參數 SDNN 和 rMSSD，此一程式在過去的研究中已經被證實為有效可靠(Chang et al., 2005)。
第七節 統計分析
由於疾病動物之間存在著相當大的歧異性，傳統的個案-對照式研究 架構(Case-Control Study Design)需要很大的樣本數才能在極強的背景雜音 下顯現出相對而言較小的暴露效應。再加上晝夜循環性的關係，使得傳統 式的數據分析更顯得效度受限。因此本研究採用自我控制式研究架構 (Self-Control Study Design)。每一隻實驗動物在第一週先接受測試物載體 (Vehicle)的氣管灌注，並收集 72 小時資料作為控制組。同一隻實驗動物在 第二週的同一時段接受測試物的氣管灌注，並收集 72 小時資料作為對照 組。
心電圖所擷取到的正常 RR 波時間距(NN intervals)參數資料以 D.S.I.
公司出品之 A.R.T. 2.20®軟體輸出。並藉以計算時間義域的心跳速率變異 性參數 SDNN 和 rMSSD。基於資料對稱性的需求， SDNN 和 rMSSD 先 經 過 自 然 對 數 轉 換 (Natural Logarithm Transformation) ， 分 別 定 義 為 LnSDNN 和 LnRMSSD 後，才進入資料分析階段。每 6 小時計算一筆平均 正常 RR 波時間距(Average NN Intervals, ANN)，LnSDNN 和 LnRMSSD 三 個參數原始資料的平均值及其 5 到 95 百分比資料點分佈帶，以作為初步 分析的參考。其時間圖如圖 1 至圖 7 所示。
每隻 SHR 在當實驗組與對照組時的 ANN，LnSDNN 和 LnRMSSD 三個參數原始資料均扣除掉自己控制組資料的每小時平均值，所得之所有 殘差(Pooled Residual)定義為粗估效應(Crude Effects)。每 6 小時計算一筆 ANN，LnSDNN 和 LnRMSSD 三個參數粗估效應的平均值及其 5 到 95 百 分比資料點分佈帶。其時間圖如圖 8 至圖 14 所示。
我們再以 Generalized Estimation Equation (GEE)模型配適來估計調整 過時間和個別差異之後的暴露效應。以 SAS 8.0 版進行統計分析與模型配 適的結果如表 1 至表 8 以及圖 15 至圖 23 所示。
為了便於比較同時暴露高劑量超細粒徑碳黑和低劑量硫酸鐵和鎳的 交互作用，我們以每 6 個小時為基礎，將各個成分效應的實際值以時間性加 成(Temporal Summation)的方法計算其加總值，將此加總值定義為聯合暴露 的預期值；而將各個成分效應的變異值(Variance)以時間性加成的方法計算其 總變異量，藉以估計其信賴區間。並將之與同時暴露高劑量超細粒徑碳黑 和低劑量硫酸鐵和鎳的實際值作一比較。其結果如圖 20 所示。