第一節 材料:
一) 基因晶片：中研院 白果能博士提供 9600 點晶片及方法。(45) cDNA Probe Preparation：
Heat block Centrifuge Water bath
Hybridization oven Heat sealer
RNAzol B(Cat.,TEL-TEST,INC;#CS-105) Oligotex mRNA Mini Kit(Qiagen;70042)
Hybridization Bags (GibcoBRL; #18278-010) Easi Seal(Hybaid,cat.No.HBOSSSEZIE)
Microscope Slides(3×2 inch)(Kimble; #75001)
Aerosol Resistant Tips(ART tip)(molecular BIO-Product,#2139) Random hexamer primer(GibcoBRL; #48190-011)
Reverse transcriptase and 5×buffer(GibcoBRL; #18064-014) RNase inhibitor (GibcoBRLLL; #110777-019)
Biotin-16-dUTP(Roche; #1558706)
Blocking power for hybridization(Roche; #10096176) Bovine serum album (Sigma; #A2153)
220X SSC(Amresco) SDS(Sigma)
Salmon sperm DNA (GibcoBRL; #15632-011) Human Cot-1 DNA(GibcoBRL; #15279-011)
Poly d(A) 10(10 mer of dA,any primer synthesis company) Dextran sulfate(Sigma; #D6001)
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments(Boehhringer Mannheim;
#1093274)
X-gal (GibcoBRL; #15520-018) Maleic acid (Sigme; #1125)
N-lauroylsarcosin(Sigma; #L5777)
Fast red TR/AS-MX substrate kit(cat. No.34034, PEIRCE)
二) 中藥 :順天藥廠科學中藥
1.六味地黃丸:每 12.0 克中含熟地黃 8.0 克 山藥 4.0 克 山茱萸 4.0 克 澤 瀉 3.0 克 茯苓 3.0 克.牡丹皮 3.0 克.以上生藥製成浸膏 7.2 克. (生藥 與浸膏比 25.0:7.2=3.5:1)澱粉 4.8 克
2.桂附八味丸:每 12.0 克中含有熟地黃 8.0 克 山藥 4.0 克 山茱萸 4.0 克 澤瀉 3.0 克 茯苓 3.0 克.牡丹皮 3.0 克.肉桂 1.0 克 炮附子 1.0 克.以 上生藥製成浸膏 7.0 克.(生藥與浸膏比 27.0:7.0 =3.9:1)澱粉 5.0 克
三) Purify RNA :
1. TRIZOL Reagent (GIBCOBRL, 15596-018) 2. Chloroform
3. Isopropanol 4. Resin
5. 75% ethanol 6. DEPC water
四) Purify mRNA:
Oligo(dT) Cellulose Columns (GIBCOBRL,15939-010)
五) 1×hybridization buffer:
20×SSC 16ml
1%N-lauryolsarcosine 8ml
10%SDS 160ë
ddH2O 52ml
filter(0.22ìm)
BM blocking powder 0.8g
total 80ml
置於 65OC 使其溶解後,存放於-20 OC 冰箱中
六) 50%PEG
PEG-8000 10g
add water to 20ml
置於 65 OC 使其溶解,高溫高壓滅菌後,存放於-20 OC 冰箱中
七) 10×TBS (PH 7.4)
Tris base 12.11g
NaCl 87.66g
add ddH2O to 1000ml 滅菌後即可使用
八) 120mM X-gal
X-gal 100mg
DMF 2ml
存放於-20 OC 冰箱中
九) X-gal Subtrate Buffer
10×TBS(PH7.4) 50ml 3mM Potassium Ferrocyanaide
K3 Fe(CN)6
0.6335g
3mM Potassium Ferricyanide K4 Fe(CN)6
0.4939g
1mM MgCl26H2O 0.10165g add H2O to 500ml 過濾後儲存於-20 OC 冰箱中
十) BM Blocking Dilution Buffer PH 7.5
1 M Maleic acid 100ml 5 M NaCl 30ml
NaOH 7.5g
add H2O to 1000ml 滅菌後即可使用
十一) 10% Blocking Reagent
Blocking powder 10g Blocking Dilution Buffer 100ml
置於 70 OC 中使其溶解,高溫高壓滅菌後存放於 4 OC 冰箱中
十二) 20% Dextran Sulfate
Dextran Sulfate 2g add H2O to 8ml 滅菌後存放於-20 OC 冰箱中
十三) DEPC H2O
Diethyl pyrocarbonate (store in 4 OC)
400µl
H2O 800ml
置於 37 OC 中溫和的搖晃 4 小時,然後放在 37 OC 中到第二天,高溫高壓 滅菌後,存放於室溫環境即可
第二節 準備藥品:(10mg/ml) (一). 中藥製備
1. 將 0.3g 的科學中藥粉末加入 27ml 的培養液 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Hyclone),以超音波震盪 60 分鐘,使粉末 溶解均勻.
2. 以 3000rpm 的轉速離心 15 分鐘,將沉渣去除.
3. 用濾紙過濾藥液.
4. 再用 0.45μm 孔徑的過濾膜過濾藥液.
5. 在無菌操作檯中用 0.22μm 孔徑的過濾膜過濾藥液.
6. 加入 3ml 的 FBS(Fetal Bovine Serum),即培養液中含 10% FBS.
7. 加入 Penicillin 及 Streptomycin.
8. 此培養液即可用來處置細胞,或是儲存在-20oC
(二). 培養 293 細胞:
1. 使用直徑 150mm 的培養盤及 20ml 的培養液 DMEM 培養 293 細胞.
2. 待細胞達預定數量時,吸掉培養液.
3. 加入 19.6ml(或 19ml，或 18ml)的 DMEM 及 0.4ml(或 1ml，或 2ml) 已加入中藥之培養液共 20ml.
4. 最後的藥品濃度為:0.2mg/ml(0.5mg/ml，1.0mg/ml) 5. 在 37 oC 的恆溫箱中培養兩天.
(三). 純化 RNA:
1. 吸掉培養液
2. 加入 2ml 的 TRIZOL reagent.
3. 使 reagent 在培養盤表面平均分佈,與細胞混合,並儘快將與細胞混 合好之 TRIZOL 吸到小型離心管中.
4. 將離心管放置冰上 5 分鐘.
5. 每 1ml 的 TRIZOL 加入 0.2ml 的 chloroform, 震盪 15 秒使其混合均 勻.
6. 置於冰上 5 分鐘.
7. 以 12000rpm 的轉速,4 oC 離心 15 分鐘.
8. 液面會分為兩層,上層為 aqueous phase,小心的吸出上層液體,移至 新的離心管.
9. 加入 isopropanol (份量為吸出液體總體積的一半).
10. 震盪使混合均勻.
11. 加入 RNA Tack Tm Resin (份量為此時總體積的二十分之一).
12. 震盪 30 秒
13. 離心 1 分鐘(小型桌上型離心機即可).
14. 將上清液吸掉.
15.用 75%酒精 1ml 清洗:加入酒精後震盪 30 秒使均勻,再離心一分鐘後 將上清液去除.
16. 重覆步驟 15 再洗一次.
17. 置於無菌操作檯空氣中乾燥(約 20 分鐘).
18. 加入 DEPC 處理過的水 50μl.
19.震盪均勻後離心以 8000rpm 轉速離心 1 分鐘.
20.吸出上清液移至新的離心管即得 RNA
(四). 純化 mRNA:
1. 將 total RNA 做酒精沉澱: 加入 5M 的 NaCl 溶液 90μl.及 3ml 的酒 精,放置於-20 oC 中至隔天.
2. 以 8000rpm 的轉速離心 10 分鐘.
3. 將上清液去除.
4. 置於無菌操作檯中空氣乾燥.
5. 加入 3ml 的 binding buffer 6. 置於 70 oC5 分鐘.
7. 置於冰上 5 分鐘.
8. 另一方面需同時準備好 column 供使用: 加入 3M 的 NaCl 0.1ml, 滴 乾後再加入 4ml 的 binding buffer, 一樣等滴乾後再加入 1ml 的 binding buffer, 留置 0.5ml 在 column 中,即可供使用或保存於 4 oC
中.
9. 將處置好的 RNA 溶液加入 column 中.
10. 加入 4ml 的 binding buffer 清洗.
11. 用 1.5ml 的 elution buffer 溶出 RNA
12. 將溶出的 RNA 溶液置於 70 oC 5 分鐘,然後放冰上 5 分鐘,再置於室溫 20 分鐘.
13. 同時加入 4ml 的 binding buffer 清洗 column 待使用.
14. 在 RNA 溶液中加入 90μl 3M 的 NaCl 溶液.
15. 將 RNA 溶液加入已準備好的 column 中.
16. 加入 4ml 的 binding buffer 清洗 column.
17. 用 1.5ml 的 elution buffer 溶出 RNA.
18. 在 RNA 溶液中加入 3M 的 NaCl 溶液 90μl 及酒精 3ml.
19. 在-20 oC 中冰存到第二天.
20. 在 4 oC 以 7000g 離心 20 分鐘.
21. 去除上清液,加入 75%的酒精清洗.
22. 在 4 oC 以 7000g 離心 2 分鐘.
23. 去除上清液,置於無菌操作檯中空氣乾燥 30 分鐘.
24. 以適量 1mM 的 EDTA 溶液(5~50μl)溶出 RNA.
(五). cDNA 探針標記:
1. 混合 2μg 的 mRNA 與 Random hexmer(50μM) 6λ,並補水至總體積為 28.5λ
2. 置於 70 oC 10 分鐘使其變性, 然後置於冰上 5 分鐘 3. 標記: 混合以下成份
步驟 2 之 RNA 混合物共 28.5μl 5 倍緩衝液 10μl
0.1M 的 DTT 5μl
dATP,dCTP,dGTP(25mM) 1ìl dTTP (2mM) 1ìl
Biotin-16-dUTP(1mM)或 Dig-11-dUTP (1mM) 2μl RNAsin(40U/ìl)1ìl
Superscript Ⅱ(200U/μl)1.5μl Total: 50ìl
4. 將步驟 3.的混合溶液置於 25 oC 的環境中 10 分鐘,再放到 42 oC 中 90 分鐘
5. 將溶液置於 94 oC 中 5 分鐘,以終止反應
6. 加入 3M 的 NaOH 溶液 5.5μl,並置於 50 oC 中 30 分鐘 7. 加入 3M 的 CH3COOH 溶液 5.5μl,並置於 50 oC 中 30 分鐘 8.將下列成份加入溶液中:
H2O 38ìl
Ammonia acetate(7.5M) 50ìl Glycogen(20ìg/ìl) 1ìl
EtOH 380ìl
9.置於-80 oC 中 30 分鐘之後,以 13000rpm 的轉速離心 15 分鐘
10.小心的吸掉上清液,加入 75%的酒精清洗沉澱物, 以 13000rpm 的轉速 離心 10 分鐘
11.吸掉上清液後,以真空乾燥 2 到 3 分鐘 12.加入 20μl 的水溶解沉澱物
(六). 雜交反應及呈色
1. 準備雜交膜:將 Salmon sperm DNA (10μg/μl) 10μl 放在 95 oC 中 5 分鐘使其變性,再加入 5ml 的 1×hybridization buffer 中混合,
把雜交膜放入,置於 63 oC 中 1.5 小時以上
2. 準備 DNA 探針:將溶於水的 DNA 探針加入以下成份:
poly d(A) (10ìg/ìl) 2ìl
human Cot-1 DNA (10ìg/ìl) 2ìl 2×hybridization buffer 45ìl total:90ìl
將上列混合物放入 95 oC 中使其變性,靜置冰上 5 分鐘,
3. 將混合溶液加在雜交膜正面,然後密封,置於 95 oC 中 3 分鐘,再放置 於 63 oC 約 16~18 小時,進行雜交反應
4. 在反應之後,取出雜交膜,以 5ml 的 2×SSC+0.1%SDS 溶液在室溫環境 下輕輕震盪清洗 2 次,每次 5 分鐘
5. 然後以 5ml 的 0.1×SSC+0.1%SDS 溶液在 63 oC 環境下輕輕震盪清洗 3 次,每次 15 分鐘
6. 將雜交膜置入以下成份的混合溶液中,在室溫中輕輕震盪 1 小時 blocking dilution buffer 4ml
20%dextran sulfate 0.5 ml 10%blocking reagent 0.5ml total: 5ml
7.將雜交膜置入以下成份的混合溶液中,在室溫中輕輕震盪 1.5 小時 1×TBS+0.3%BSA(PH 7.4) 4.1ml
10%blocking reagent 0.5ml 50%PEG-8000 0.4ml
Streptavidin â-galactosidase (1.38U/ml) 7.2ìl Anti-Dig-AP (0.075U/ml) 0.5ìl
Total: 5 ml
8.將雜交膜以 5ml 的 1×TBS buffer 在室溫狀態下清洗 3 次,每次 5 分
鐘
9.呈色Ⅰ: 將雜交膜置入以下成份的混合溶液中,在 37 oC 中避光溫和搖 晃 45 分鐘
X-gal substrate buffer 4.85ml X-gal (20mg/ml) 150ìl
Total: 5ml
10.以 mini-Q water 清洗乾淨
11.呈色Ⅱ: 將雜交膜置入以下成份的混合溶液中,在室溫中溫和搖晃 45 分鐘
Fast Red TR salt (fresh prepare) 5mg Subtrate Buffer 5 ml
Naphthol AS-Mx Phosphate Concentrate 0.75ml 12.以 mini-Q water 清洗乾淨
13.將雜交膜置入 5ml 的 1×PBS+20mM EDTA, 在室溫下搖晃 20 分鐘以終 止反應
14.空氣乾燥
(七).掃瞄儀:雜交後晶片呈色掃瞄，電腦記錄及影像資料定量分析
RNA Concentration and Quality 分開萃取兩種待比較細胞 RNA (六味地黃丸和桂附八味丸培養的腎細胞)
Isolation of mRNA from total RNA 從 RNA 分離出 mRNA
293 Cells cultured in herbs 腎細胞培養(六味地黃丸和桂附八味丸)
cDNA Probe Labeling 兩種呈色物對 mRNA 反轉 cDNA 基因標誌
圖 1:DNA 基因晶片萃取兩種待比較細胞 mRNA 偵測基因表達操作步驟.