3.1 儀器、材料與藥品
3.1.1 使用儀器
（1）桌上型高速冷凍離心機 Sigma 3K18；
（2）旋轉減壓濃縮機 EYELA N-N 系列；
（3）超低溫冷凍櫃 Thermo Forma Model 725；
（4）冷凍乾燥機 EYELA FD-1000；
（5）全自動生物分子相互作用分析系統 （Amersham Biomolecular Interaction Analysis System） Biacore 3000：Biacore AB；
（6）高效能液相層析儀：Hewlett Packard 1100 型，配備有 Model G1322A 真空脫氣機（Vacuum Degasser）、 Model G1311A 四溶媒梯度幫浦（Quaternary Pump）、 Model G1313A ALS 自動進樣器（auto sampler）、 Model G1328A 手動進樣器
（manual injector）、 Model G1315A DAD 光電二極管陣列檢 測器（Diode Array Detector）。
（7）酵素免疫分析儀（ELISA reader）：Multiskan EX，Thermo；
（8）分液收集器（fraction collector）：型號 FC203B，Gilson；
3.1.2 使用材料與藥品
（1）CM5 晶片：Code No. BR-1000-14，Biacore AB；
（2）HPLC 分析型管柱：Discovery
○
R BIO Wide Pore C18, 25 cm x 4.6 mm, 5 µm，SUPELCO；（3）HPLC 製備型管柱：Discovery
○
R BIO Wide Pore C5, 25 cm x 10 mm, 5 µm，SUPELCO；（4）過濾膜：0.22 µm，MILLEX
○
RGS，MILLIPORE；0.45 µm，MILLEX
○
RHA，MILLIPORE；（5）α-glucosidase（EC 3.2.1.20）：固定晶片用濃度為1 mg/ mL、
酵素活性分析使用濃度為14 units/ mg protein/ mL，G-5003,
1000 units, from Bakers Yeast（Type Ⅰ），SIGMA；
（6）HBS-EP buffer：成分為 10 mM HEPES、 0.15 M NaCI、3 mM EDTA、 0.005%（v/ v）Surfactant P20、 pH 7.4，Code No.
BR-1001-88，Biacore AB；
（7）1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
（縮寫EDC）：Biacore AB；
（8）N-hydroxysuccinimide（縮寫 NHS）：Biacore AB；
（9）ethanolamine HCl（縮寫 EA）：Biacore AB；
（10）phosphate buffer solution（縮寫 PBS）：10X concentrated，
GeneMark；
（11）(－)-epigallocatechin gallate（縮寫 EGCG）：用 PBS 配製 濃度如下3 mg/ mL、 1 mg/ mL、 0.5 mg/ mL、 0.1 mg/ mL、
0.05 mg/ mL，E4143-50MG, from green tea，SIGMA；
（12）醋酸鈉緩衝液：pH 4、 pH 7，Biacore AB；
（13）NaOH：50 mM；
（14）西藥：acarbose（醣祿錠（Glucobay
○
R）, 50 mg/ Tab., 德國 拜耳藥廠）；（15）科學濃縮中藥：仙鶴草、乾薑、黃水茄、石斛、益母草，順 天堂藥廠股份有限公司；
（16）中草藥：綠茶、白龍船、白石榴、白豬母乳、銅垂玉帶草、
含羞草、芭樂乾、破布子根、倒地苓、紅豆杉；
（17）10%（v/ v）HCl（
aq
）；（18）甲醇（試藥級）：Fluka；
（19）甲醇（HPLC 級）：Riedel-deHaen；
（20）Acetonitrile（縮寫 ACN，HPLC 級）：J.T. Baker；
（21）p-Nitrophenyl α-D-Glucopyranoside（縮寫 pNPG，HPLC 級）：Fluka；
（22）酵素緩衝液：0.1M pH 7.0 磷酸緩衝液，內含 0.2% BSA 及 0.02% NaN
3
。（23）caffeine（HPLC 級）：Fluka；
（24）(－)-epicatechin gallate（縮寫 ECG）： E3893-10MG, from green tea，SIGMA-ALDRICH；
3.2 待測物之製備
3.2.1 中草藥及科學中藥之前處理
取50 克科學中藥粉末或中草藥研碎，至錐形瓶中，再加入 250 mL 甲醇（methanol）浸泡；用超音波震盪 1 小時，以上步驟重覆 三次後，將甲醇萃取液集中後過濾去除殘渣。以減壓濃縮方式將萃 取液之甲醇溶劑抽乾。再以 1000 mL d.d.water 回溶抽乾的萃取 物，用震盪或攪拌方式儘量使其溶解後，以抽氣過濾去除不溶物，
再將濾液減壓濃縮至50 mL 以下。
接著將濃縮後之濾液倒入50 mL 離心管中，使用 5000 g 之相 對離心力（relative centrifuge field, RCF）進行離心 10 分鐘。離心 後，取上層澄清液體，以減壓濃縮至約 10～20 mL 的體積，並將此 濃縮液放入-80 ℃冰箱一天，最後置於冷凍乾燥機脫乾水分，便完 成樣品前處理步驟（圖3.1）。
3.2.2 acarbose 前處理
取10 顆（500 mg）acarbose 研磨成粉狀，至錐形瓶中，再加 入250 mL 10% （v/ v）HCl（
aq
）浸泡acarbose 粉末；用超音波震 盪 1 小時，以上步驟重覆三次後；用震盪或攪拌方式儘量使其溶解 後，將鹽酸萃取液集中後以抽氣過濾法去除不溶物，再將濾液減壓 濃縮至50 mL 以下。接著將濃縮後之濾液倒入50 mL 離心管中，使用 5000 g 之相 對離心力（relative centrifuge field, RCF）進行離心 10 分鐘。離心 後，取上層澄清液體，以減壓濃縮至約20 mL 的體積，並將此濃縮 液放入-80 ℃冰箱一天，最後置於冷凍乾燥機脫乾水分，便完成樣 品前處理步驟。
超音波震盪 1 hr，至少重覆三次 50 g科學中藥或中草藥樣品+ 250 mL甲醇
減壓濃縮方式將甲醇溶劑抽乾
1000 mL d.d.water 回溶
減壓濃縮方式濃縮至50 mL 以下
離 心
取上層澄清液
濃縮至10～20 mL
- 80 ℃冷凍一天
冷凍乾燥，得萃取物粉末
圖3.1 中草藥及科學中藥前處理流程圖
3.3 α-glucosidase-CM5 晶片製備原理與最佳化固定條件
3.3.1 α-glucosidase-CM5 晶片製備原理
Biacore AB 公司生產的 CM5 晶片是以玻璃為基材，玻璃表面 覆蓋一層厚度約為50 nm 的金膜，在金膜層表面上再覆蓋一層羧基 化的葡萄聚醣（carboxymethylated dextran）。由於 Biacore AB 公 司所推出CM5 晶片已被大量使用在生化研究及分析上，而且蛋白質 固定化（immobilization）的方式已經有許多商業化程序可依循，所 以為本實驗考量選擇此CM5 晶片的原因（圖 3.2）。
圖3.2 CM5 晶片構造圖
SIGMA 公司所生產的 G-5003 系列產品是從 Bakers Yeast
（Type Ⅰ）取得 α-glucosidase（EC 3.2.1.20），而不是從哺乳類動 物（Type Ⅱ）的小腸抽取而來，所以 α-glucosidase 的純度高。利 用這種已商業化的酵素，依照蛋白質固定步驟，將其固定在 CM5 晶片上。
當以上實驗材料準備及緩衝溶液 pH 值設定好後，接下來需將 α-glucosidase 固定在 CM5 晶片上。本實驗是先利用 EDC/ NHS 的 混合液活化CM5 晶片表面上葡萄聚醣（dextran）的羧基（圖 3.3）；
然後將配置的 α-glucosidase 溶液在 CM5 晶片表面上流動，使 α-glucosidase 的胺基能和葡萄聚醣（dextran）的羧基形成醯胺鍵 結而固定在晶片上（圖 3.4）。最後注入 EA，將未與 α-glucosidase 作用之葡萄聚醣（dextran）上的活化羧基去活化（圖 3.5）。
圖3.3 EDC/ NHS 活化 CM5 晶片的作用圖
α-glucosidase
NHS
選擇Biacore AB 公司推出 CM5 晶片做為本實驗的生物晶片。
選購自 SIGMA 公司所生產的 α-glucosidase（G-5003），做為晶片 上的酵素接受器，並依照3.3.2.2 節所敘述的方式，將本酵素固定在 CM5 晶片上。並利用金屬表面電漿共振（SPR）的光學原理，直接 偵測金屬表面上的質量改變，同時能精確的控制反應組成的接觸時 間與流速，並且可立即顯示反應分子結合、解離的情形。
3.3.2 α-glucosidase-CM5 晶片的最佳化固定條件 3.3.2.1 α-glucosidase 溶液之配製
將α-glucosidase 分別以不同 pH 值(pH 4.0、7.0)的醋酸鈉緩衝 液，配製成1 mg/ mL 的溶液，以 HBS buffer 當 running buffer，將 流速設定在5 μL/ min，分別注射不同 pH 值的 α-glucosidase 醋酸 鈉溶液，觀察其與CM5 晶片間的作用情形。
3.3.2.2 α-glucosidase 酵素之固定法與程序
將CM5晶片放入Biacore 3000儀器中，先用HBS buffer為流動 相沖洗儀器內的管路，待表面電漿共振訊號圖（SPR sensorgram）
的基線穩定後，開始α-glucosidase之固定。
首先，將流速設定為5 μL/ min，注射70 μL EDC/ NHS的混合 液（1：1比例混合，濃度為5 μL/ mL）；接下來，注入100 μL由醋 酸鈉緩衝液（pH 4.0）配置約1 mg/ mL的α-glucosidase溶液；最後 注入70 μL的EA。
3.4 α-glucosidase-CM5 晶片活性及穩定度之確認方法與步驟
3.4.1 α-glucosidase-CM5 晶片活性之確認方法與步驟
由於酵素和受質的結合具有專一性，利用受質會作用在酵素特 定結合位置的特性，選擇適當的 ligand 在本實驗中扮演重要的角
色。通常ligand 的選取最好能具備下列幾項條件：
（1）具有重覆性：ligand 可和接受器進行可逆性鍵結，這樣生 物晶片才能重覆使用來篩選樣本。
（2）具有競爭性抑制能力：本實驗期望能從生藥中尋找可抑制 α-glucosidase 作用的有效成分，因此選擇適當的 ligand 也需具備某 種程度能和生藥中的有效成分形成競爭性抑制 α-glucosidase 的能 力。
（3）具有訊號放大作用：希望表面電漿共振訊號圖（SPR sensorgram）上呈現的訊號曲線明顯。
選擇EGCG 當作本實驗的 ligand（或 inhibitor）。因為從EGCG 抑制α-glucosidase 效能的研究
40
中，可知其抑制 α-glucosidase 百 分之五十的有效濃度（IC50
）是50.9 μM。首先，先用 PBS 製備 1 mg/ mL EGCG 溶液。隨後，將已固定 α-glucosidase 的 CM5 晶片（簡稱 α-glucosidase-CM5 晶片）放入 Biacore 3000 儀器中，利用 PBS 當 running buffer，將流速固定在 10 μL/ min 的條件下進行，EGCG 溶液的注射量為 60 μL；等待表 面電漿共振訊號圖（SPR sensorgram）的 EGCG 訊號線執行結束 後，注入NaOH（50 mM）5 μL 清洗晶片上的 EGCG 兩次。以上 步驟重覆至少兩次以上。
其次，用PBS 製備五種不同濃度的 EGCG 溶液（0.05 mg/ mL、
0.1 mg/ mL、0.5 mg/ mL、1 mg/ mL、3 mg/ mL），接下來的操作 步驟如同上。
3.4.2 α-glucosidase-CM5 晶片穩定度之確認方法與步驟
將 α-glucosidase-CM5 晶片放入 Biacore 3000 儀器中，利用 PBS 當 running buffer，將流速固定在 5 μL/ min 的條件下進行，
EGCG（1 mg/ mL）的注射量為 60 μL；等待表面電漿共振訊號圖
（SPR sensorgram）的 EGCG 訊號線執行結束後，注入 NaOH（50 mM）5 μL 清洗晶片上的 EGCG 兩次。以上步驟重覆至少 50 次以 上。
3.5 α-glucosidase-CM5 晶片篩選樣品條件與步驟
將經過前處理之科學中藥及中草藥，用PBS 配製成 10 mg/ mL 的溶液，並使用過濾膜（0.22 µm）過濾去除微粒，避免造成 Biacore 儀器內通道的阻塞。設定Biacore 流速在 10 μL/ min 的情況下，分 別注入60 μL、濃度為 10 mg/ mL 的科學中藥溶液或中草藥溶液，
觀察其與α- glucosidase 接受器作用的情形。
同樣地，將經過前處理之acarbose，用 PBS 配製成 100 mg/ mL 的溶液，並使用過濾膜（0.22 µm）過濾去除微粒，設定 Biacore 流 速在 10 μL/ min 的情況下，注入 60 μL、濃度為 100 mg/ mL 的 acarbose 溶液，觀察其與 α- glucosidase 接受器作用的情形。
3.6 α-glucosidase-CM5 晶片的樣品回收條件與步驟
將欲回收之科學中藥、中草藥和 acarbose 的粉狀樣品，以磷酸 鹽緩衝溶液（PBS）配製成 10 mg/ mL 溶液，並用過濾膜（0.22 µm）
過濾，以去除微粒。利用 Biacore 3000 儀器的分析物回收（analyte recovery）功能，選定當天實驗所使用的 flow cell，將磷酸鹽緩衝溶 液流速設定為10 μL/ mL，樣品的注射時間為 3 分鐘。回收時的滯 留時間設為10 秒，按照 Biacore 3000 儀器內套裝的軟體指示，依 次將裝有50 mM NaOH、水、磷酸鹽緩衝溶液、生藥溶液及空的回 收瓶放入樣品架內，以進行分析樣品的回收。
3.7 HPLC 指紋圖譜建立標定方法、條件與步驟
3.7.1 經過前處理之待測物與標準品的指紋圖譜分析
將經過前處理之科學中藥、中草藥和標準品，用d.d.water 配製 成1 mg/ mL 的溶液；acarbose 用 d.d.water 配製成 100 mg/ mL 的 溶液。接下來，使用過濾膜（0.45 µm）過濾去除微粒，避免高效能 液相層析儀（HPLC）內的管柱阻塞。本實驗使用 Hewlett Packard 1100 型高效能液相層析儀建立生藥初萃取物的指紋圖譜。
本實驗使用的分析型管柱為 SUPELCO 公司製造 Discovery
○
R BIO Wide Pore C18（25 cm x 4.6 mm, 5 µm）。其沖提條件為：流 速設定為1.0 mL/ min，以 95%水+ 5%甲醇為起始沖提 5 分鐘後逐 漸增加甲醇比例沖提 15 分鐘後到達 40%水+ 60%甲醇，接下來維 持相同比例繼續沖提10 分鐘後繼續逐步增加甲醇比例沖提 20 分鐘 至100%甲醇，最後以 100%甲醇沖提 10 分鐘後結束。以光二極體 陣列檢測器進行偵測，並以固定波長210nm、254 nm、280 nm、330 nm 等繪製層析圖。
3.7.2 標的物成分之分析
利用之前 3.6 節敘述的回收方法所收集到的樣品，隨後將樣品 體積濃縮至約 20 μL，以高效能液相層析儀進行分析。其分析條件 與經過前處理之待測物的指紋圖譜分析相同。
3.8 抑制 α-glucosidase 活性分析與步驟
利用酵素活性分析（enzyme activity assay）試驗的原理來做 抑制α-glucosidase活性的分析，酵素活性分析試驗的作用原理如 下：
p-Nitrophenyl α-D-Glucoside ──────────>α-D-Glucose + p-Nitrophenol
黃α-glucosidase 具 有 活 性 作 用 時 ， 會 將 p-Nitrophenyl α-D-Glucoside（pNPG）分解成 α-D-Glucose 和 p-Nitrophenol 而 使試劑呈現黃色；當 α-glucosidase 活性被抑制時，則分解反應進
α-glucosidase 具 有 活 性 作 用 時 ， 會 將 p-Nitrophenyl α-D-Glucoside（pNPG）分解成 α-D-Glucose 和 p-Nitrophenol 而 使試劑呈現黃色；當 α-glucosidase 活性被抑制時，則分解反應進