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第三章、材料與方法
一、實驗設計
3T3-L1 Cell
探討 HBP1 在脂肪分化(adipocyte differentiation)過程的表現 Aim 1
Aim 2
HBP1 的表現量影響脂肪細胞分化過程
利用 siRNA 將細胞中 HBP1 表現降 解，觀察 HBP1 對脂肪分化的影響
Aim 3
Quercetin 透過對 HBP1 的調控影響 脂肪分化過程
Quercetin 是否可抑制 脂質生合成
Quercetin 階段性調控 HBP1 影響脂質生合成
第三章 材料與方法 Bovin Serum Albumin USBiological USA 4℃
Bromophenol Blue Bio Basic Inc. Canada 室溫
DNase I stock solution Qiagen Germany -20℃
第三章 材料與方法
3-isobutyl-1-methyl-xanthine Sigma US -20℃
L
L-Glutamine Gibco USA -20℃
Luria Bertani medium Himedia India 室溫 Luria Bertani Agar Himedia India 室溫 Lipofectamine TM 2000 Invitrogen USA 4℃
Lipofectamine TM RNAi MAX
Invitrogen USA 4℃
第三章 材料與方法
Penicillin/Streptomycin Gibco USA -20℃
Phosphatase Inhibitors Cocktail
Sigma US -20℃
Polybrene Sigma US -20℃
Protease Inhibitors Cocktail Sigma US -20℃
Protein Assay Dye Reagent Bio Rad CA 4℃
第三章 材料與方法
MultilmageTMLight Cabinet Alpha Innotech Corporation Mulpid®-2 plus electrophoresis ADVANCE
CLC-110 chemiluminescence detector TOHOKU
CLC-10 CL counter TOHOKU
PowerPacTM Basic Power Supply BioRad Thermo Scientific NanoDrop 1000
第三章 材料與方法
25
三、細胞培養
資料來源：10 (一) 細胞株
3T3-L1前脂肪細胞株：購自ATCC®Catalog NO. CL-173TM，組織來源：小 鼠纖維母細胞。
HEK-293T人類胚胎腎臟上皮細胞株，由賴志河老師實驗室機構所贈。
(二) 試劑配置
DMEM ( high glucose)
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 粉末溶於800 ml 的無菌水中，
加入1.5 g Sodium Bicarbonate (Sigma)，再以1N HCl 調整pH值為7.1~7.2之間，定 量1 L後以過濾膜 (0.22 μm) 過濾，加入 10％Bovine serum (3T3-L1 cell) /Fetal Bovine Serum (293T cell)、2% L-Glutamine 與1% Antibiotic Antimycotic，而成為 最終之細胞培養液。
1X磷酸緩衝液(Phosphate-buffer saline；PBS)
以10X PBS (UniRegion Bio-Tech)以滅菌水稀釋為 1X PBS，經 121℃、30分鐘高 壓滅菌後使用並存放於室溫備用。
第三章 材料與方法
3-isobutyl-1-methyl-xanthine/10 μg/mL insulin 於 high glucose DMEM 培養兩 天，每兩天更換 10 μg/mL Insulin / 100 μg/mL Biotin 培養液，持續培養至分
Dexamethasone(Sigma) 0.098g 0.25M
DMSO 1 mL
先將0.098 g DEX power 溶於 1 mL DMSO中，即為0.25M
第三章 材料與方法
27
藥品 需要量 Stock conc. conc.
0.25M DEX 10 μl 0.25 mM 0.25μM
DMSO 10 mL
先將0.25M DEX以DMSO 稀釋為0.25 mM DEX，分裝於滅菌 eppendorf中，
貯存於-20℃。
2、0.5 M 3-isobutyl-1-methyl-xanthine(MIX) ：1000x stock
藥品 需要量 Stock conc. conc.
3-isobutyl-1-methyl-xanthine(MIX) (Sigma)
0.111g 0.25 M 0.25 mM
DMSO 1 mL
先將0.111g MIX power 溶於 1 mL DMSO中，分裝於滅菌 eppendorf中，貯存 於-20℃。
3、100μg/ mL Biotin：1000x stock
藥品 需要量 Stock conc. conc.
Biotin(Sigma) 0.01 g 100 μg/ mL 0.1 μg/ mL
二次水 100 mL
先將0.01g biotin power 溶於 100 mL二次水中，以0.2μm filter過濾分裝於 eppendorf中，貯存於-20℃。
第三章 材料與方法
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4、10 mg/ mL Insulin：1000x stock
藥品 需要量 Stock conc. conc.
第三章 材料與方法
取Oil-red O 212 mg加入isopropanol 60 mL中，蓋上蓋子，stir at 4℃ overnight，
以 Whatman 3MM paper過濾，過濾後Oil-Red O solution：dd water＝3：2混勻後，
4 ℃ overnight ， 最 後 再 以 Whatman 3MM paper 過 濾 ， 4 ℃ 待 使 用 。 10 ％ formalin/PBS 是取 27.3 mL 37％ formaldehyde solution＋ 72.97 mL PBS。
細胞染色
將分化至第八天的3T3-L1 脂肪細胞，吸除培養液，以 PBS潤洗兩次，加入 2 mL 的10％ formalin/PBS固定細胞一小時，再以dd water清洗數次，加入 1.5 mL Oil-red O(蓋過細胞即可)染10 min，吸除染劑，以dd water 清洗數次，室溫倒扣 晾乾於顯微鏡下即可照相。
第三章 材料與方法 PGL3-HBP1-LUC transient overexpressing HBP1 RSV-β-gal (Rous sarcoma virus β-galactosidase) internal vector control
質體來源：Dr. Yee Lab 機構.
(二) 實驗步驟
轉型 (Transformation)
將 DH5α competent cells (ECOS 101；Yeastern Biotech) 自-80℃取出後回
第三章 材料與方法
質體小量製備--使用QIAGEN® Plasmid Mini Kit (QIAGEN)
將上述培養 24 小時之菌體離心15 分鐘 (6000g，4℃) 後，將上清液倒掉，
第三章 材料與方法
質體大量製備--使用QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN)
將上述質體鑑定正確之小量質體，放入含有Ampicillin之LB培養液300 ml 培
第三章 材料與方法
33
pellet使其乾燥5~10 分鐘後，以200~300μl 二次水將其溶解，保存於-20℃。
七、冷光酵素報導基因分析法--Luciferase Gene Reporter Assay
資料來源：73 (一) 原理
生物發光現象是 Luciferin 在 Luciferase 的催化下進行氧化反應所產生。
Luciferase + O2
Luciferin---products + CO2 + light Other+ elements
(二) 實驗步驟 轉染
以 lipofectamineTM 2000 轉染 0.4 μg HBP1 -2kb promoter 和 0.2 μg RSV-β -gal (internal control)質體至培養於 24 well 每一孔盤中的 293T 細胞，24 小時後，
給予不同濃度的 insulin、TZD 和 GW9662 24 小時後，以 luminometer 分析 Luciferase 活性。
打破細胞
使用 4℃的 PBS 清洗細胞兩次，加入含有 DTT 的 Lysis buffer(DTT final 0.5mM)，24 well 每一個 well 25μl，在搖晃機上搖 30 分鐘（冰上），將細胞放置 eppendorf，以 11800 rpm，離心 2 分鐘，將上清液放置新的 eppendorf，放到-80
℃冰箱中保存備用。
分析
加入 12.5μl 的 buffer A 至每一 well，將 2-10μl（5μl）的 test sample 加入 至 well，等待 10 分鐘，等待的時間配置 bufferB，稀釋 galacton-plus substrate 至 bufferB （1：100），加入 buffer B，每個 well 加入 50μl，測量 Luciferase。放置 室溫 30 分鐘，加入 50μl Accelerator II，等 1-2sec，立刻測量β-galactosidase。
第三章 材料與方法
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八、Transient HBP1 knockdown 之3T3-L1 細胞株
資料來源：74 (一) RNA干擾術(RNA interference；RNAi)
背景
RNAi 最早 於 1990 年時 被 發 現， 植 物學 家 Jorgensen 等 將 查 爾酮 合 酶 (chalcone synthase) 的基因置於一個 promoter 後面，於矮牽牛花中，希望藉由增 加一套基因使花色更鮮豔，結果發現不但多一套的基因沒有表現，原本存在的那 一 套 基 因 反 而 失 去 功 能 而 出 現 白 花 ， 當 時 稱 此 現 象 為 「 共 同 抑 制 (co-suppression)」。1995年，Guo 和Kemphues 利用反義股RNA (anti-sense RNA) 阻斷了parf-1 肌肉蛋白的表現，同時，在對照組實驗中，發現 sense RNA 亦可 抑制parf-1的表現。1998 年，Fire 與Mello 在線蟲(Caenorhabditis elegans) 上也 發現這種RNA 干擾現象，並首度被稱為RNAi。直到2001 年初，Thomas Tuschl 證明了在哺乳動物細胞中，亦可以使用RNAi 來抑制特定基因的表現，因此RNAi 核酸誘導沉默複合體 (RNA-induced silencing complex；RISC) 辨識並結合，使雙 股的siRNA解開，形成sense 與antisense 兩個單股的RNA，並將其中的正義股 (sense) 分解，保留反義股 (antisense)。而保留的反義股則會引導RISC結合至互 補的 mRNA上，之後，mRNA會被RISC切斷進而降解，使其無法轉譯成蛋白質，
因此，目標基因遭到抑制並失去功能。
第三章 材料與方法
35
應用
RNAi 技術的應用相當廣泛，在疾病治療應用上，許多疾病的發生是因為特 定基因表現異常或過度表現，我們可以依所需來關閉非必要或致病基因的功能，
以抑制這些異常或過度活化的基因。理論上說，若能關閉致病基因的表達，則很 多疾病將被治癒。因此，利用RNAi 技術可應用於抑制病毒感染與複製能力、對 抗癌症、心血管與腦血管疾病、糖尿病…等各種疾病的新療法。
圖3-1 RNAi 之作用原理 資料來源：(75)
第三章 材料與方法
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(二) 使用的siRNA
StealthTM RNAi Negative Universal Control Duplexes Lot. 130942A01做為控制組 Mouse HBP1 siRNA購自Thermo SCIENIFIC，其target Sequence如下：
TARGETplus SMARTpool L-054764-01-0005，Mouse HBP1，NM_153198，5 nmol ON-T TARGETplus SMARTpool siRNA J-054764-09，HBP1
Target Sequence：AAUAAAGGUUGGUCGUCAU ON-T TARGETplus SMARTpool siRNA J-054764-10，HBP1
Target Sequence：CCUCAGAUAUACCGGAAAA ON-T TARGETplus SMARTpool siRNA J-054764-11，HBP1
Target Sequence：GGUCAAGAGUUUUCGGGAU ON-T TARGETplus SMARTpool siRNA J-054764-12，HBP1
Target Sequence：CUGAAAGGCACGCGGCUGU
(三) 實驗步驟 轉染至3T3-L1細胞
將3T3-L1細胞培養至10 cm 培養皿中，待長滿後進行繼代培養2~3次，進行 實 驗 。將100 nM siRNA與serum free medium(Opti-MEM®) 混 合 ， 加 入 RNAi duplex-Lipofectamine TM RNAi/MAX反應10-20分鐘後，進行Reverse Transfection，
接著加入500μl含有400,000顆3T3-L1細胞於3.5 cm 培養皿，置於37℃、5% CO2
之培養箱內培養，待細胞長滿後即可移至6 well培養皿進行分化和並抽取RNA和 蛋白質以做鑑定。
第三章 材料與方法 (13000rpm)，接著換到含有SUPERase-In(RNase inhibitor) 1.5 ml collection tube，
加入30 μl RNase-free water，於室溫下靜置1分鐘，離心1 分鐘(10000 rpm)，再
第三章 材料與方法
十、RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)--使用SuperScriptTMⅢ One-Step
RT-PCR System with Platinum
®Taq DNA Polymerase Kit (Invitrogen)
資料來源：77 (一) 原理
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR，反轉錄酶PCR），其原理是將一段待測 的RNA序列經反轉錄酶的作用轉錄成cDNA，再利用PCR技術將基因片段以幾何
第三章 材料與方法
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Reaction protocol：
Temperature Time Cycle cDNA synthesis
55℃ 30 min 1
Denaturation
94℃ 2 min 1
PCR amplification
94℃ 15 s
55℃ 40 s 40
68℃ 45 s
Final extension
68℃ 5 min 1
4℃ ∞
將 RNA、primer 與試劑混合後，放入PCR 專用之小管中，放入iCycler，
設定上述之反應條件即可。反應完成後，每管加入6 倍之DNA loading dye，再 以含有0.26%之EtBr 之1% Agarose 跑膠，並以MultilmageTMLight Cabinet 分析影 像並儲存。
第三章 材料與方法
HBP1 Forward 5’-ACTCCTGTGATGAGCACATGGA-3’ 501bp Reverse 5’-AGCAGTGCCAAATGGTGGAT-3’
PPAR-γ Forward 5’-TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3’ 198 bp Reverse 5’-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3’
CEBP/α Forward 5’- GAACAGCAACGAGTACCGGGTA-3’ 225 bp Reverse 5’- GCCATGGCCTTGACCAAGGAG-3’
C/EBPβ Forward 5’- GCAAGAGCCGCGACAAG-3’ 154bp Reverse 5’- GGCTCGGGCAGCTGCTT-3’
C/EBPδ Forward 5’- AAAGTGCAGGCTTGTGGACT-3’ 87bp Reverse 5’- TTACTCCACTGCCCACCTGT-3’
aP2 Forward 5’-AAGACAGCTCCTCCTCGAAGGTT-3’ 183 bp Reverse 5’-GCGTAAATGGGGATTTGGTCACCA-3’
十一、Quantiative -PCR(Quantiative Reverse Transcription-PCR)使用Taq Man®
One-Step RT-PCR Master Mix Reagents (Roche)
資料來源：78 (一) 原理
Quantiative RT-PCR(即時螢光定量 PCR) 其原理為在 PCR 反應系統中，加入 螢光基團，利用螢光信號積累即時監測整個 PCR 過程，最後以標準曲線對未知 的樣品進行定量分析的方法。Ct 值的含義是 C 為 Cycle，t 代表 threshold，每個
第三章 材料與方法
41
反應管內的螢光信號到達設定的閾值時所經歷的 cycle 數，因此，即時螢光定量 PCR 是一種採用外標準曲線定量的方法。
(二) 實驗步驟 Reaction set up：
Component Volume TaqMan®2X Universal PCR Master Mix 20 μl 40X MultiScribeTM and RNase Inhibitor Mix 1 μl
25X primer＆probe 1.6 μl
RNA (60 ng) X μl
DEPC-H2O to 40μl
將 RNA、primer 與試劑混合後，放入 real time PCR 96 well 專用之小管中，
放入 Applied Biosystems PRISM®7900HT，上機，設定所需之反應條件即可。
十二、蛋白質萃取
(一) 原理
利用細胞刮除法使細胞破裂並使用 RIPA 裂解液讓細胞快速裂解，使蛋白 溶解變性並抑制蛋白酶的活性使蛋白穩定，再利用超高速離心，取上清液蒐集總 蛋白。
(二) 實驗步驟 藥品配置
第三章 材料與方法
第三章 材料與方法
第三章 材料與方法
第三章 材料與方法
Stock solutions 8％Resolving gel 10％Resolving gel 4％stacking gel
40％Acrylamide 1.6 ml 2 ml 0.39 ml
第三章 材料與方法
第三章 材料與方法
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實驗步驟
膠體的配製依蛋白質分子量的大小而決定配製成 8、10 % 的 SDS-PAGE。
待鑄好的 SDS-PAGE 組合放置電泳槽中，倒入適量的 1× running buffer。將製備 好的蛋白樣品以及標準品小心加入於固定於垂直電泳槽內的 stacking gel 的 well Western lightening chemiluminescence reagent plus 進行呈色反應，利用LAS-4000 mini FUJIFILM 冷光影像系統分析。
第三章 材料與方法
第三章 材料與方法
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樣品分析(每秒不超過 300 顆細胞，每個數據收集 10000 顆細胞)，數據以 Modfit LT 軟體進行分析。
十六、統計分析
實驗結果均以平均值 ± 標準差 (Mean ± SD) 表示，利用 Student’s t test 或 Duncan’s multiple range test 比較組間差異。所有數據通過常態分佈檢定，否則 轉型為對數值 (Log)。統計分析以 SAS 套裝軟體 ( version 9.0, SAS institute，
Cary, NC ) 分析，統計比較以 p< 0.05 為具有顯著之差異。