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第四章、結果
一、HBP1 在脂肪細胞分化過程的表現
(一) 脂肪細胞分化後期 HBP1 表現明顯增加
典型的 in vitro 脂肪分化模式中，前脂肪細胞株如 3T3-L1、Ob1771、
3T3-F422A 和初代脂肪細胞為常用的細胞，其中，3T3-L1 在 1974 年由 Green 和 Kehinde 由 Swiss mouse embryo cloning 出來，具高度分化為成熟脂肪細胞潛力的 前脂肪細胞株，當以 DEX/MIX 協同 Insulin 誘導時，3T3-L1 將分化為成熟脂肪 細胞，也是我們此次研究所選用的實驗細胞模式。
第四章 結果
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(二) Insulin 誘導 HBP1 的表現
由於 HBP1 在分化第四天的表現量增加，加上之前的研究發現，在成熟的大 鼠脂肪細胞，insulin 增加了 HBP1mRNA 的表現，因此，我們假設，可能是 insulin 在分化後期誘導了 HBP1 表現。於是，我們在 3T3-L1 post-confluence 時，給予 DEX/MIX 二天後，分別給予 5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml 和 40 μg/ml 不同濃度的 insulin 48 小時後，以 Western blot 分析 HBP1 的蛋白表 現量。結果顯示，insulin 隨著濃度的增加，HBP1 蛋白的表現也隨之增加 (圖 4-3)。
此結果表示，insulin 具活化 HBP1 的能力，也可能是 HBP1 於 3T3-L1 分化後期 增加的主要原因。
由於 insulin 的給予增加了 HBP1 蛋白的表現，我們推測，insulin 可能藉由 活化 HBP1 的 promoter 增加 HBP1 的表現。因此，我們運用冷光酵素報導基因 分析法(Luciferase Gene Reporter Assay) 檢視其可能性，首先，我們轉染 0.4 μg 連接 HBP1 -2kb promoter 的 luciferase 基因的載體和 0.2 μg RSV-β-gal (internal control)質體至 24-well 的 HEK-293T 細胞，24 小時後，加入 0~20 μg/ml 不同 濃度 insulin，24 小時後，收集 cell lysate，以 luminometer 分析 luciferase 和β-gal 活性，圖 4-4 結果顯示，insulin 明顯誘導 HBP1 -2kb promoter 的活性。證實了我 們的假設；insulin 透過活化 HBP1 啟動子而增加 HBP1 蛋白的表現量。
第四章 結果
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二、HBP1 的表現量影響脂肪細胞分化過程
(一) HBP1 reduction 造成脂肪細胞分化不完全
既然 HBP1 的含量隨著脂肪細胞分化的進行而有所改變，表示，HBP1 具調 控脂肪分化的潛在功能。為了驗證此假設，我們運用 RNA 干擾技術降低 3T3-L1 細胞內 HBP1 的含量，觀察脂質生合成是否受到影響。首先，我們利用 western blot 和 RT-PCR 確認 HBP1 專一的 siRNA 的確降解 3T3-L1 細胞中 HBP1 蛋白質和 mRNA 的表現(圖 4-5)。接著，我們分別給予 DEX/MIX 協同 Insulin 誘導控制組 和 HBP1 siRNA 3T3-L1 細胞分化為成熟脂肪細胞，於分化第八天，分別以 RT-PCR 分析 PPARγ、C/EBPα和 aP2 mRNA 的表現、 real time PCR 分析 leptin mRNA 含量和油紅染色觀察細胞內油滴的生成。圖 4-6 的結果為顯微鏡下觀察脂肪細胞 型態的改變情形；HBP1siRNA 組的細胞在分化實驗八天後，圓形型態細胞明顯 低於控制組，同樣地，圓形細胞內油滴的油紅染色，HBP1siRNA 細胞明顯低於 控制組。當我們進一步比較成熟脂質生合成的指標基因 PPARγ、C/EBPα和 aP2 的表現時，其 mRNA 的含量，HBP1 siRNA 組明顯低於控制組 (圖 4-7)，leptin mRNA 的含量也具有相同的結果(圖 4-8)。此結果顯示，HBP1 表現量減少導致了 脂肪分化不完全，表示，HBP1 具調控脂質生合成的生理功能，但其調控機制需 進一步探討。
第四章 結果 knockdown 造成較快的細胞週期進行，G2/M 期的較早出現。同樣地，HBP1 siRNA 也造成較高的 MCE 期相關分化基因 C/EBP β 和 C/EBP δ 表現(圖 4-10)。由此實 驗得知，HBP1 在 MCE 期的生理功能，如一般地，調控細胞週期和細胞增生。
值得探討的是，較快的 MCE 期細胞增生，應該有助 3T3-L1 脂肪細胞分化的完 成，但是，HBP1 knockdown 雖然出現 MCE 期細胞週期的促進，卻導致最終分 化的不完全。為追尋答案，我們進而探究 HBP1 在分化後期的角色。
第四章 結果
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(三) 於分化後期，HBP1 可能是 PPARγ的調控標地
PPARγ是分化後期重要的調節轉錄因子，通常在 3T3-L1 分化的第 4 天，表 現明顯增加，這與我們觀察到的 HBP1 表現相似(圖 4-1 和 4-2)，因此，我們懷疑，
PPARγ和 HBP1 之間可能出現相互調節的功能。當我們進行 CHIP-Mapper (http://mapper.chip.org/) 搜尋時發現，HBP1 啟動子上 -274~-258 和-688~-660 位 置有可能的 PPAR-γ 連結處 (圖 4-11)。是故，我們假設，HBP1 可能是 PPARγ
第四章 結果 變少，效果則以高濃度 100μM quercetin 最為明顯。顯示，quercetin 確實降低脂 肪細胞分化程度。已知脂肪細胞在分化過程中，數種的關鍵轉錄因子參與調控，
於是，我們進一步檢測此相關因子的表現，以確證 quercetin 所抑制的脂肪分化。
同樣地，3T3-L1 細胞以 10 至 100 μM quercetin 與分化劑同時加入培養後，以 DMSO 做為對照組，萃取分化第八天細胞之 total RNA，利用 RT-PCR 檢測 PPAR γ和 aP2 mRNA 的表現，結果顯示，quercetin 抑制轉錄因子 PPARγ和 aP2 mRNA 的表現呈現劑量效應；隨著 quercetin 濃度的增加，PPARγ和 aP2 mRNA 表現量 隨之下降(圖 4-16)。因此，我們確認 quercetin 抑制了 3T3-L1 脂肪細胞的分化。
第四章 結果
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(二) Quercetin 造成 3T3-L1 MCE 期細胞週期停滯
最近的研究指出，H2O2 促使 3T3-L1 MCE 期細胞週期的進行，進而促進脂 質生合成，而當給予 resveratrol 和 genistein 則導致 MCE 期細胞週期停滯和分化 不完全，因此，我們想觀察 quercetin 是否造成 3T3-L1 MCE 期細胞週期停滯，
進而抑制脂肪細胞分化。首先，我們觀察 quercetin 影響 MCE 期細胞生長的情形，
如上述相同之實驗程序，在 quercetin 和分化劑處理後兩天，即 MCE 期結束後，
計算細胞數以比較 quercetin 是否影響 MCE 期細胞的生長，結果如圖 4-17 所示，
quercetin 顯著減少 MCE 期 3T3-L1 的細胞數目。接著，我們進一步探究 quercetin 造成的 MCE 細胞數目減少，是透過對細胞生長的抑制，抑或是細胞凋亡的促進。
於是，我們以 PI 染色配合流式細胞儀分析 MCE 期的細胞週期，圖 4-18 結果明 顯指出，50μM quercetin 促使細胞週期停滯於 S 期，而 100μM quercetin 則明 顯造成 G1 期的相對細胞分佈數目增加，伴隨著 G2/M 期相對細胞數目的減少，
表示著，quercetin 導致 MCE 期細胞週期停滯於 G1 期。同時，quercetin 並未造 成 MCE 期細胞的凋亡 (流式細胞儀未偵測到凋亡細胞)。當進一步確認 quercetin 造成 MCE 期不完全時， 我們檢測此期的相關活化因子 C/EBP β和 C/EBP δ 的表現，結果證實，quercetin 的確明顯造成 C/EBP β和 C/EBP δ mRNA 的表 現下降(圖 4-19)。可見，quercetin 造成了 MCE 期細胞生長停滯，細胞增生不完 全(細胞數目減少)，而這可能是 quercetin 抑制脂質生合成重要因素之一。
第四章 結果
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(三) Quercetin 促進分化初期 HBP1 的活化
先前 HBP1 調控 MCE 期的實驗結果推測，假若，HBP1 的表現在分化初期 增加，將可能造成細胞週期進行的停滯，進而影響分化的完整。加上，quercetin 也造成 MCE 期細胞生長停滯於 G1，我們假設，quercetin 具活化分化初期 HBP1 的功能。首先，我們檢測 quercetin 是否增加 3T3-L1 前脂肪細胞 HBP1 的表現，
給予 3T3-L1 前脂肪細胞 10 至 200 μM quercetin 48 小時後，結果發現，quercetin 隨著劑量的增加顯著誘導 HBP1 蛋白質的表現 (圖 4-20)，我們緊接著試驗，
quercetin 增加 HBP1 的表現是否透過對 HBP1 啟動子的活化，在轉染 0.4 μg HBP1 -2kb promoter 和 0.2 μg RSV-β-gal (internal control)質體至 HEK-293T 細 胞 24 小時後，給予不同濃度的 quercetin 24 小時，以 luminometer 分析 Luciferase 活性，圖 4-21 結果顯示，quercetin 隨著劑量的增加顯著誘導 HBP1 -2kb promoter 的活性。表示，quercetin 透過對 HBP1 啟動子的活化而增加其表現。
最後，我們觀察 MCE 期，當 quercetin 造成細胞週期停滯時，是否伴隨著 HBP1 的表現增加。顯然地，如圖 4-22 所示，100 μM quercetin 增加了 3T3-L1 MCE 期(0 到 2 天) HBP1 mRNA 的表現。表示，HBP1 可能是 quercetin 造成 MCE 期細胞週期停滯的調控標地。
綜合以上結果顯示，quercetin 活化 MCE 期 HBP1 mRNA 表現，並促使 MCE 期細胞週期生長停滯於 G1，伴隨著轉錄因子 C/EBPβ和 C/EBPδ mRNA 的表 現降低，而抑制脂肪細胞分化。
第四章 結果
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圖 4-1 HBP1 蛋白質在脂肪分化過程的表現。培養 3T3-L1 細胞，於 post- confluence 加入分化劑，以西方墨點法分析不同分化天數 HBP1 蛋白質的表現，實驗至少重 複二次。
1 1.01 1 0.97 1.05 1 1.26 2.44 4.7 2.56
HBP1
α-tubulin
0 2 4 6 8 (Day)
Adipocyte Differentiation
第四章 結果
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圖 4-2 HBP1 mRNA 在脂肪分化過程的表現。培養 3T3-L1 細胞，於 post- confluence 加入分化劑，以 RT-PCR 分析不同分化天數 HBP1mRNA 的表現，n＝
3。
0 1 2 4 6 8 (Day)
HBP1
18S
Adipocyte Differentiation
1 2.12 2.77 1.37 3.83 4.36 3.09
1 0.97 0.99 0.97 0.99 1.03 1.03
第四章 結果
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圖 4-3 Insulin 活化 HBP1 蛋白質的表現。在分化的 MCE 期加入 DEX/MIX 48 小 時後，給予 5 至 40μg/ml 不同濃度的 insulin 48 小時後，利用西方墨點法分析 HBP1 蛋白的表現，實驗至少重複二次。
insulin
1 0.86 0.82 0.94 0.86 0.86
HBP1
α-tubulin
Con 5 10 20 30 40 (μg/ml) )
1 1.03 2.46 1.86 4.63 8.47
第四章 結果
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圖 4-4 Insulin 誘發 HBP1-2kb promoter 的活性。在 24 well 293T 細胞中，利用 報導基因分析法觀察 insulin 對 HBP1 -2kb promoter 的影響，以 lipofectamine TM 2000 分別轉染 0.4 μg HBP1-2kb promoter 及 0.2 μg RSV-β-gal，轉染 24 小時 後，給予 5 至 20 μg/ml 的 insulin 24 小時後，以 luminometer 分析 Luciferase 的 活性。數據結果以 mean ± SD 值表示，* p＜0.05 v.s.control，實驗至少重複二 次。
insulin (μg/ml)
第四章 結果
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圖 4-5 HBP1 siRNA 影響 3T3-L1 細胞中 HBP1 蛋白質(A)和 mRNA(B)的表現量。
利用 RNA 干擾術將細胞中之 HBP1 knockdown 之後，以 western blot 和 RT-PCR 來觀察蛋白質和 mRNA 的表現，以空的載體轉染之細胞當作控制組，
α-tubulin 、18S 為 internal control，n＝4。
1 1.04 1 0.34 1 0.99
control HBP1 siRNA
HBP1
α-tubulin
HBP1
18S
1 0.33
(A)
(B)
第四章 結果
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圖 4-6 HBP1 siRNA 對脂肪細胞分化之影響。給予 DEX/MIX 協同 insulin 誘導控 制組和 HBP1 knockdown 3T3-L1 細胞分化為成熟脂肪細胞，分化八天後，以油 紅染色觀察細胞內脂肪滴生成的現象。放大倍率 400X。
control HBP1 siRNA
第四章 結果
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圖 4-7 HBP1 siRNA 影響脂肪分化相關因子的表現。給予 DEX/MIX 協同 insulin 誘導控制組和 HBP1 knockdown 3T3-L1 細胞分化為成熟脂肪細胞，以 RT-PCR 分析 PPAR γ、C/EBP α和 aP2 mRNA 的表現，實驗至少重複二次。
1 1.03 1 0.57 1 0.57
18S aP2 PPAR γ control (Day 8)
HBP1 siRNA
1 0.25
C/EBP α
第四章 結果
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圖 4-8 HBP1 siRNA 對脂肪細胞 leptin 表現量之影響。以 DEX/MIX 協同 insulin 誘導控制組和 HBP1 knockdown 3T3-L1 細胞分化為成熟脂肪細胞後，以 real time-PCR 分析 leptin mRNA 的含量，實驗至少重複二次。
第四章 結果
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圖 4-9 HBP1siRNA 影響 MCE 期細胞週期的進行。以 PI 染色配合流式細胞儀偵 測 3T3-L1 控制組和 HBP1 knockdown MCE 期 4 小時細胞週期分佈情形。數據結 果以 mean ± SD 值表示，n＝3，* p＜0.05 v.s. control。
control HBP1 siRNA
Cell cycle progression during MCE
(4 hour after MDI treatment)
第四章 結果
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圖 4-10 HBP1 siRNA 影響 MCE 期 C/EBP β 轉錄因子 mRNA 的表現。以 RNA 干擾技術將 3T3-L1 細胞中之 HBP1 knockdown 之後，利用 RT-PCR 觀察在 HBP1 表現降低與控制組細胞中 C/EBP β 和 C/EBP δ 轉錄因子的表現，實驗至少重複二 次。
。
1 1.03 1 1.26 1 1.84
C/EBP β
C/EBP δ control
HBP1 siRNA
18S
第四章 結果
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圖 4-11 HBP1 的啟動子上兩個可能的 PPARγ連結位點。CHIP-Mapper 搜尋發現，
HBP1 啟動子上 -274~-258 和-688~-660 ，有可能之 PPAR-γ 連結處。
第四章 結果
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圖 4-12 PPARγ促進劑 TZD 對 HBP1-2kb promoter 活性的影響。在 24 well 293T 細胞中，利用報導基因分析法觀察對 HBP1 -2kb promoter 的影響，以 lipofectamine
TM 2000 分別轉染 0.4 μg HBP1-2kb promoter 及 0.2 μg RSV-β-gal，轉染 24 小 時後，給予 5 至 30 μM 的 TZD 24 小時後，以 luminometer 分析 Luciferase 的活 性。數據結果以 mean ± SD 值表示，n＝3，* p＜0.05 v.s. control。
TZD (μM)
第四章 結果
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圖 4-13 PPARγ抑制劑 GW9662 對 HBP1-2kb promoter 活性的影響。在 24 well
圖 4-13 PPARγ抑制劑 GW9662 對 HBP1-2kb promoter 活性的影響。在 24 well