材料與方法

1.

實驗所使用的大腸桿菌 (Escherichia coli) 菌株為 EPI-300 與 BL21(DE3)，培 養於 Luria-Bertani (LB) 培養基 (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.2)之中 (Scott, 1968)，並於 37^oC 培養。細胞實驗則使用秋夜盜蛾 (Spodoptera

frugiperda) Sf21、Sf9 細胞株，並以含有 10% 胎牛血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen)

2.

本實驗室日前以白點症病毒的極早期基因 wssv108 的 ORF (Open reading frame) 的 3’端與 wssv108 的 5’UTR 設計 PCR 引子 (Primer) (表 1)，以感染病毒後 白蝦之 cDNA 作為模板，PCR 放大出 DNA 片段，再將 PCR 產物以 BamHI/NotI 與 HindIII/KpnI 限制酵素切位轉殖於 pIB-V5/His (Invitrogen) 及熱誘導表現載體 pDHSP-V5 載體 (Liu et al., 2007) 中，命名為 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His。此外，利用 BamHI/NotI 限制酵素切位將不含有

wssv108 的 5’UTR 序列的 wssv108 轉殖入載體 pGEX-4T1 與 pET-32a(+) (Novagen)

中，命名為 pET32a-wssv108 與 pGEX-4T1-wss108。pGL3-wssv304-(-412~+82) 利 用 WSSV-304-500-F 與 WSSV-304-500-R (表 1)，PCR 放大出極早期基因 wssv304 的轉譯起始點上游序列 500 個核苷酸 (nt)，以 SmaI/HindIII 限制酵素切位轉殖於 pGL3-basic (Invitrogen) 載 體 中 ； 而 不 同 長 度 片 段 的 啟 動 子 刪 除 株 報 導 質 體 pGL3-wssv304-(-93~+82)、pGL3-wssv304-(-54~+82) 與 pGL3-wssv304-(-36~+82)，

是利用不同的 PCR 引子 F 端與同一個 R 端放大出不同長度片段的 wssv304 啟動子 (表 1)，再以限制酵素切位分別轉殖於 pGL3-basic 載體中。除此之外，wssv108 結合位突變株是利用 p304(-59~-50)mut-F、p304(-59~-50)mut-R (表 1)，對 wild type pGL3-wssv304-(-412~+82) 進行點突變，將原始序列突變後，利用 PCR 放大出 DNA

片段 (表 1)，以 SmaI/HondIII 限制酵素切位轉殖於 pGL3-basic (Invitrogen) 載體 中 ， 並 命 名 為 pGL3-wssv304-(-412~+82)-(-59~-50)mut 。 載 體 pGL3-wssv113 、 pGL3-wssv124、pGL3-wssv164、pGL3-wssv228、pGL3-wssv234、pGL3-wssv243、

pGL3-wssv462、pGL3-wssv484、pGL3-wssv524、pGL3-ie3 使用基因轉譯起始點上 游序列 500 個核苷酸 (nt)，PCR 放大出 DNA 片段，以 SmaI/HindIII 限制酵素切 位轉殖於 pGL3-basic (Invitrogen) 載體中。G5p35BAS、GAL4-DBD 及 GAL-IE1 利用前人研究所做出的質體 (Liu et al., 2008)。將 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 以 KpnI 限制酵素進行截切，同時將 GAL4-DBD 以 SacII 限制酵素進行截切，之後將 兩者以 DNA Polymerase I，Large (Klenow) Fragment 作用 30 分鐘，純化並以 AgeI 限制酵素進行截切，將兩者連接反應後，轉型至大腸桿菌內以 Zeocin 抗生素篩選 出質體 GAL4-WSSV108。

3.

接種大腸桿菌於 5 ml 的 LB 培養液中，在 37^oC 搖晃培養 14 至 16 小時後，

將 500 µl 菌液加入 50 ml 的 LB 培養液當中，並在 37^oC 搖晃培養至細菌濃度 OD600

值達到 0.3 至 0.5 後，將菌液放入冰中作用 10 分鐘使細菌停止生長，再於 4^oC 以 3000 rpm 離心 10 分鐘沉澱菌體並去除上清液。加入 10 ml 的 transformation buffer (10 mM MOPS, 85 mM CaCl2, 27 mM D-glucose, 15% glycerol, 2 mM NaOH, pH 6.3) 並均勻回溶菌體，再於 4^oC 以 3000 rpm 離心 10 分鐘。除去上清液後以 2 ml 的 transformation buffer 回溶菌體，將 100 µl 菌液分裝於 1.5 ml 微量離心管中，並保 存於 -80^oC 冰箱 (Dagert et al., 1979)。

4.

將勝任細胞置於冰上緩慢解凍，加入適量質體 DNA 混和後，在冰上靜置反 應 20 分鐘，以 42^oC heat shock 作用 90 秒後置於冰上冷卻一分鐘，再加入 500 µl LB

培養液於 37^oC 靜置培養 30 分鐘，取 200 µl 菌液塗盤後於 37^oC 培養箱培養 14 至 16 小時 (Froger et al., 2007)。

5.

根據 Presto^TM Mini Plasmid Kit (Geneaid) 的說明書操作。

6.

將抽出的質體 DNA 加入 0.2X 體積的 TXS Buffer [6% (w/v) TritonX-114, 3.0%

7.

實驗以 Sf9 細胞表現重組蛋白質，首先取 9x10⁵個 Sf9 細胞加入 6 孔細胞培 養盤中靜置一小時。均勻混合適量的 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen)、質體 DNA 以及不含血清、不含抗生素的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 後於 27^oC 靜置反應 30 (Invi-trogen)、質體 DNA 以及不含血清、不含抗生素的 Schneider’s Drosophila Medium

(Invitrogen) 後於 27^oC 靜置反應 30 分鐘，之後將混合液加入已附著在培養盤上 的細胞之中並均勻搖晃混合，再置於 27^oC 培養 2 天，最後進行冷光分析。

8.

以 1300 rpm 離心五分鐘收集 Sf9 細胞，並以 1 X phosphate-buffered saline (PBS) 沖洗 2 次，接著以 200 µl 含有 1:500 protease inhibitor [4-(2-Aminoethyl) benzene-sulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF)、Leupeptin]、1:1000 Dithiothreitol (DTT) 與 1:10000 IGEPAL (SIGMA IGEPAL^® CA-630) 的 20mM HEPES buffer 懸浮細胞，置 於冰上反應 15 分鐘後，以超音波震盪 30 秒使細胞完全破碎，於 4^oC 以 12000 rpm 離心 10 分鐘後，取出之上清液即為細胞蛋白萃取物。

9.

收集轉染目標表現載體之 Sf9 昆蟲細胞，以 400 µl 含有 1:200 protease inhibitor 的 Buffer A (10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) 懸浮 細胞，並放置於冰上作用 10 分鐘，接著加入 25 µl 10% NP-40 震盪作用 15 秒後 再放置於冰上作用 1 分鐘，接著以 2000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘，離心完畢後迅 速取出上清液，此部分即為細胞質分劃，再加入 50 µl 含有 1:200 protease inhibitor 的 Buffer B (20 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 並強 力震盪，再放置於冰上作用 15 分鐘，重複三次後，以 12000 rpm 於 4°C 離心後 10 分鐘，將上清液取出，此部分即為細胞核蛋白質，並貯存於 -80°C 冰箱。

10. 冷光報導活性分析 (Luciferase reporter assay)

將 Sf21 細胞培養於 24 孔培養盤，轉染 36 小時後，除去上清液並加入 200 µl lysis buffer (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100) 搖晃反應 10 分鐘以打破細胞，最後取 50 µl 上清液至冷光分析

盤中並加入 100 µl 的冷光受質液 [20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO3)4Mg(OH)2‧ 5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 270 mM coenzyme A, 470 mM luciferin, 530 mM ATP]，再立即放入冷光儀 (Orion II, Berthod, Bad Wildbad, Germany) 測量冷光數值 (De Wet et al., 1987)。

11. 電泳流動性轉移分析 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

EMSA 實驗根據 LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo) 的操作流 程進行，並以5’端標定 biotin 的 wssv304 啟動子序列為探針 (Probe) 進行實驗。 cross-linking)。接著利用 Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate 偵測，並以 HRP 冷光受質呈色，最後以底片顯影進行結果分析。在競爭實驗中，

需先在蛋白質與 DNA 反應過程中加入未標記 biotin 的雙股 DNA 競爭者核苷酸序 列 (Competitors)，使用量為 biotin 探針的 5 倍。同時也使用抗 V5 與抗 His 抗體 進行 supershift assay，以確定 DNA-蛋白質複合體為目標蛋白質。

12. Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay

將以 IPTG 誘導表現之 GST-wssv108、His-LvYY1 與 His-wssv108 的 E. coli

BL21(DE3) 收集下來，並以含有 1:200 protease inhibitor、1:1000 DTT 與 1:10000 IGEPAL 的 NETN buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40) 懸浮，將細菌以超音波震盪打破 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750)，以 12000 rpm 於 4°C 離心後取出上清液備用。首先將誘導表現 GST-wssv108 之 蛋 白 質 樣 品 與 30 µl Glutathione Sepharose 4B 膠 體 (GE Healthcare)，於 4°C 作用一小時，並以 NETN buffer 清洗三次。接著分別加入 His-wssv108、His-LvYY1 蛋白質樣品以及控制組樣品 pET32a(+)，於 4°C 下共同 作用一小時，以 NETN 清洗膠體三次後移除上清，加入 30 µl 2X sample buffer (20%

α-mercaptoethanol ethanol,100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 4 mM EDTA, 0.01% bromophenol blue, 2% SDS) 將結合於膠體上的蛋白質樣品流洗下來，接著 以 SDS 膠體分離樣品，並以西方點墨法分析成果 (Sambrook et al., 2006)。

13. 西方點墨法 (Western blotting)

將蛋白質樣品加入 4X sample buffer (40% glycerol, 240 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% SDS, 0.04% bromophenol blue, 8% β-mercaptoethanol)，於 95°C 加熱 5 分鐘後 進行 SDS-PAGE 電泳分離蛋白質樣品，並於轉印溶液 (25 mM Tris-base, 183 mM

以 TBST 清洗 3 分鐘，共 3 次，最後加入 chemiluminescent substrate (BD OptEIA™) 500 µl 作用 3 分鐘呈色，最後以底片顯影進行結果分析。本研究所使用的一級抗 體為抗 His 抗體 (Sigma) 偵測大腸桿菌所表現的 His-LvYY1 與 His-wssv108，以 及利用抗 V5 抗體 (Santa Cruz Biotech.) 偵測 Sf9 細胞所表現的 WSSV108。