結果

1. WSSV108 蛋白質的表現

為了表達 WSSV108 蛋白質，首先建構 WSSV108 表現載體，將感染白點症 病毒 24 小時的白蝦 (Litopenaeus vanammei) 總 RNA 進行反轉錄酶-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)，並以所製備出之 cDNA 為模板，擴增 wssv108 基因譯讀區全長，並選 殖到表現載體 pDHSP-V5/His 中，接著轉染至昆蟲細胞 Sf9 誘導表現後以抗 V5 抗 體進行偵測，結果發現表現量極差 (圖 1, lane 3)。為了提高 WSSV108 表現量，

實驗嘗試將 wssv108 基因的 5’UTR 序列連同 wssv108 譯讀區一併選殖到表現載體 中，製備新的 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His 表現載體，接著檢查表現量，結果 發現 WSSV108 在加入 5’UTR 序列後能穩定表現，其重組蛋白質大小約為 40 kDa (圖 1, lane 2)，以同樣方式製備 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His。

同時也將 wssv108 譯讀區選殖到 E. coli 表現載體中，製備 pET32a-wssv108 與 pGEX-4T1-wss108 表現載體，並轉型至 E. coli BL21(DE3)中以 IPTG 誘導表 現，同時以帶有控制組質體 pET32a(+) (圖 2A, lane 1) 或 pGEX-4T1 (圖 2B, lane 1) 的 E. coli BL21(DE3) 作為對照組。結果發現，GST-WSSV108 與 His-WSSV108 重組蛋白質大小分別約為 65 kDa (圖 2A, lane 2) 及 55 kDa (圖 2B, lane 2)，綜合以 上結果，WSSV108 能穩定表現在昆蟲細胞與大腸桿菌中。

2. WSSV108 蛋白質在 Sf9 昆蟲細胞中的分布

為了瞭解 WSSV108 蛋白質在細胞內的分布狀況，實驗分別將綠色螢光蛋白 質 (Green fluorescent protein, GFP) 表 現 載 體 pDHSP-GFP-V5/His 以 及 pIB-GFP-wssv108-V5/His 轉染至 Sf9 昆蟲細胞中，於 48 小時後將細胞固定並偵測 細胞中，GFP-WSSV108 融合蛋白質的分布狀態 (圖 3)，細胞核則以 DAPI 染色。

細胞核受到 DAPI 染色後呈現藍色，GFP-WSSV108 融合蛋白質則呈現綠色，結 果發現，GFP-WSSV108 融合蛋白質會分布在細胞核當中，且在細胞質中也有少

量的存在，與 GFP 在細胞中的分布相同，因此推測 WSSV108 蛋白質存在於細胞 性，將報導載體 G5p35BAS-Luc 與表現載體 GAL4-DBD、GAL4-IE1 及

GAL4-WSSV108 分別共轉染至昆蟲細胞 Sf21 中，48 小時後偵測冷光活性數值。

由結果可以發現，正控制組表現載體 GAL4-IE1 能活化報導載體達 1.76 倍 (圖 4)，

而實驗組表現載體 GAL4-WSSV108 則會抑制報導載體至原本的 0.38 倍 (圖 4)，

與控制組相比，GAL4-IE1 及 GAL4-WSSV108 皆具有顯著差異 (p value<0.05)，

WSSV108 在 Sf21 昆蟲細胞中明顯抑制下游基因轉錄活性，顯示 WSSV108 具有 影響下游基因轉錄活性的能力。

4. WSSV108 蛋白質調控白點症病毒基因表現

為了測試白點症病毒極早期蛋白質 WSSV108 是否能影響病毒基因基因啟動 子，利用表現載體 pIB-V5/His、pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與含有白點症病毒基 因啟動子的報導質體共轉染到 Sf21 細胞中做初步測試，結果發現 WSSV108 可活 化極早期基因 wssv304、wssv113、wssv462、wssv524、wssv418 (ie3) 以及早期基 因 wssv124、wssv228 的基因啟動子 (圖 5)。而其中 WSSV108 可活化極早期基因

wssv304 達 6.5 倍 (圖 5)，利用 Student's t-test 分析數據之後，確認與負控制組相

wssv304 之機制作為後續研究的主要目標。

5. WSSV108 蛋白質調控白點症病毒極早期基因 wssv304 的表現

接著進一步探討 WSSV108 蛋白質在極早期基因 wssv304 啟動子上可能的調 控位置，利用帶有不同啟動子長度的刪除株縮小 WSSV108 在極早期基因 wssv304 的基因啟動子的可能調控區域，並將不同的啟動子報導質體分別與表現質體 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 或控制組表現質體 pIB-V5/His 共轉染到 Sf21 細胞中，

進 行 冷 光 活 性 分 析 ， 發 現 WSSV108 會 活 化 pGL3-wssv304-(-412~+82) 與 pGL3-wssv304-(-93~+82) 達 5.46 及 5.90 倍 (圖 6)，而對於 pGL3-wssv304-(-36~+82) 的活化倍率只有 1.43 倍 (圖 6)，因此推斷 WSSV108 蛋白質對於極早期基因 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His 轉染進入 Sf9 昆蟲細胞，48 小時後進行細胞核蛋白 質萃取，並以 wssv304 啟動子的 -104 nt 至 -36 nt DNA 片段製備 Biotin 標定探針，

5)，綜合以上結果，推測此蛋白質-DNA 複合體由 WSSSV108 參與組成，而結合

區域位於 wssv304 啟動子的 -63 nt 至 -36 nt 區域。

前述結果成功地將 WSSV108 結合區域縮小至 wssv304 啟動子的 -63 nt 至 -36 nt 區域，而冷光活性分析結果顯示，WSSV108 對於 pGL3-wssv304-(-54~+82) 的 活化倍率下降到 2.41 倍 (圖 6)，推測 WSSV108 的調控可能位於 wssv304 啟動子 (5’-^-65GATTTCTGGGAAGAGGGTGT^-46-3’)。為了進一步探討此 WSSSV108 的結 合範圍在 WSSSV108 活化 wssv304 啟動子的調控機制中所扮演的角色，因此建構

wssv304 啟 動 子 突 變 株 之 報 導 質 體 進 行 冷 光 活 性 分 析 。 首 先 將 報 導 質 體

pGL3-wssv304-(-412~+82) 與突變株 pGL3-wssv304-(-412~+82)-(-59~-50)mut 分別 與表現質體 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 或控制組表現質體 pIB-V5/His 共轉染到

Sf21 細胞中，進行冷光活性分析。結果顯 示 WSSV108 活化 pGL3-wssv304-

動子的活化能力大幅下降，因此證實 wssv304 啟動子的 -59 nt 至 -50 nt 區域對於 WSSSV108 調控 wssv304 啟動子之轉錄活性是不可或缺的。

8. WSSV108 蛋白質形成多聚體及與 LvYY1 直接結合

以上實驗結果指出，極早期蛋白質 WSSSV108 為具有調節其他基因轉錄活性 的功能，推論 WSSV108 應為轉錄因子或是共激活因子。為了瞭解 WSSV108 是 否能形成同源二聚體，本實驗以細菌表現的蛋白質進行 GST pull-down assay 分 析。將含有 GST-WSSV108 的 E. coli BL21(DE3) (圖 10, lane 1) 之細菌溶裂液中與 能表現 His-WSSV108 與含有 His-LvYY1 的 E. coli BL21(DE3) 細菌溶裂液 (圖 10, lanes 3、4) 進行結合分析，並以 pET32a(+) 作為負控制組，樣品利用抗 His 抗體 進行西方點墨法分析。實驗結果發現，GST-WSSV108 能與 His-WSSV108 結合 (圖 10, lane 7)，同時也能與 His-LvYY1 結合 (圖 10, lane 6)，而 GST-WSSV108 無法 和 pET32a(+) 細菌溶裂液中的蛋白質有相互作用 (圖 10, lane 5)，顯示 WSSV108 能形成多聚體並與 LvYY1 直接結合，且不需要透過其它蛋白質的參與。