白點症病毒WSSV108蛋白質對極早期基因wssv304之轉錄調控

國立臺灣大學生命科學院生化科技學系 碩士論文

Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science

National Taiwan University Master Thesis

白點症病毒 WSSV108 蛋白質對極早期基因 wssv304 之 轉錄調控

Regulation of the transcription of wssv304 of white spot syndrome virus by WSSV108

吳智宇 Zhi-Yu Wu

指導教授：張麗冠 博士 Advisor：Li-Kwan Chang, Ph.D.

中華民國 105 年 6 月

June, 2016

誌謝

當兵完回來實驗室之後時間過得好快，在 LKC lab 的生活是開心而且令人難 忘的，雖然常常會被大家嗆，不過這兩年的日子總是充滿了歡笑。謝謝麗冠老師，

在我人生沒有方向的時候願意接納我回實驗室，在我遇到困難的時候伸出援手，

在實驗上給我了很多的建議，也讓我成長了許多。謝謝口委劉宛菁老師、王涵青 老師跟陳慧文老師，在我緊張的口試過程中給我很大的幫助，仔細地指出我不足 的地方，也給我許多未來實驗能繼續進行的方向。謝謝柄翰學長，在老師詢問的 時候二話不說地收我進入蝦組，在我常常犯錯的時候一直不厭其煩的幫助我，在 各方面都讓我學到了很多，我想不管從哪方面來看你都是我最需要感謝的前三 名。還有開立跟小翁，是做實驗的好夥伴，有你們當實驗室同學真的很舒壓，忍 受我各式各樣的抱怨，尤其是在實驗炸裂的時候，有你們真好！還有暁涵跟陳則 堯，謝謝你們在實驗室給我的一堆幫助。庭安、士瑋跟紀元，你們的鼓勵真的給 我很大的前進動力。謝謝大黃，在實驗上給了我很多的建議，讓我找出實驗的方 向。還有大學部的學弟妹們，可以跟你們聊很多奇怪的話題讓我收穫很多。最後 一定不能忘的是實驗室的守護神宇璇，總是會無條件支持實驗室的每個人，在我 低落的時候給我有用的建議，時時刻刻都在鼓勵我繼續走下去。

謝謝我的家人，在我難得幾個月一次回家的時候，還要聽我抱怨一堆聽不懂 的東西，支持我好好地唸完這兩年的研究生生涯，還在畢業典禮的時候大老遠跑 上來台北參加，真的是說不完的感動，最後要謝謝我的女友亮因，這兩年陪在我 身邊承受我越來越低落的心情，雖然完全聽不懂細節但是也好好的聽我說完每天 發生的一大堆瑣事。

謝謝大家，希望大家都能夠在未來事事順利完成各自的夢想。

中文摘要

白點症病毒 (White spot syndrome virus, WSSV) 為一 DNA 病毒，對於海洋甲 殼類具有廣泛之感染性，特別對於對蝦類 (Penaeid shrimp) 有極高之致死率。

WSSV 首次於 1990 年代初期在中國漳浦爆發後，疫情便迅速地擴散到世界各地，

造成全世界蝦類養殖業嚴重之經濟損失，至今仍無有效治療方式。大型 DNA 病 毒如人類皰疹病毒，在感染宿主後，會潛伏於宿主細胞中，在接收到適當的環境 刺激後，病毒會由潛伏期 (latency) 進入溶裂期 (lytic cycle)，溶裂期基因會以階 段性的方式表現，依序表現極早期 (immediate-early)、早期 (early) 以及晚期 (late) 基因。目前白點症病毒已被報導具有 21 個極早期基因，其中 WSSV108 被報導具 有轉錄因子活性，而本研究進一步探討 WSSV108 對於白點症病毒極早期基因的 調控。冷光報導分析 (Luciferase reporter assay) 顯示 WSSV108 在 Sf21 昆蟲細胞 株中能促進 wssv304 基因啟動子轉錄活性至 6.5 倍。接著利用 wssv304 啟動子序 列刪除株進行冷光報導分析，結果發現 WSSV108 蛋白質會透過 wssv304 啟動子 上-93 到-36 的位置活化啟動子活性。並利用電泳游動性轉移分析 (Electrophoretic mobility shift assay) 發現 WSSV108 蛋白質能結合到 wssv304 啟動子上-65 到-46 的位置。同時，將 wssv304 啟動子-59 到-50 之序列突變後，WSSV108 即無法調 控轉錄活性，進一步確認 WSSV108 利用此段 DNA 序列調控 wssv304 啟動子。除 此之外，本研究利用 GST pull-down assay 發現 WSSV108 會形成多聚體，同時也 會與宿主轉錄因子 LvYY1 直接結合，推測 WSSV108 可能以二聚體形式結合上 DNA，並與 LvYY1 有協同活化的功能，其相互作用可能與致病機轉相關。本研 究首次發現 WSSV108 蛋白質具有調控白點症病毒極早期基因 wssv304 轉錄活性 的能力，對於病毒極早期基因的相互調控有了進一步的了解。

關鍵字：WSSV108、wssv304、White spot syndrome virus (WSSV)

Abstract

White spot syndrome virus (WSSV) is a large DNA virus with highly infectious and

high mortalities to Penaeid shrimp. Since the first outbreaks of WSSV in southeast

China in early 1990s, it spreads all over the world and causes serious economic losses.

However, there’s no treatment for WSSV. After infection of DNA virus, it remains la-

tency and switches into lytic cycle with appropriate environmental stimulation, subse-

quently expressing immediate-early genes, early genes and late genes. So far, twenty

one WSSV immediate-early genes (IE genes) have been found. Among these IE genes,

wssv108 contains transcriptional activity. Transient transfection experiments showed

that WSSV108 activated the promoter of wssv304 about 6.5-fold in insect cells. Dele-

tion analysis of the promoter suggested that nucleotides -93 to -36 in wssv304 promot-

er is important to the activation by WSSV108. Moreover, electrophoretic mobility shift

assay verified that wssv108 binds to the nucleotide -65 to -46 in wssv304 promoter.

Meanwhile, site-directed mutagenesis proved that -59 to -50 in wssv304 promoter is

important to the activation by WSSV108. In addition, GST pull-down assay showed

that wssv108 forms dimer and interacts with LvYY1 directly. Therefore, this study

demonstrated that wssv108 enhances the transcription of wssv304, suggesting that

WSSV108 acts as a transcription factor in the regulation of other viral genes.

Keywords：White spot syndrome virus (WSSV), WSSV108, wssv304

目錄

誌謝 ... i

Abstract ... iii

第一章 前言 ... 1

1. 白點症病毒 (White Spot Syndrome Virus, WSSV) 與台灣蝦產業現況 ... 1

2. 白點症病毒的生活史 ... 2

3. 白點症病毒的極早期基因 ... 3

4. 極早期基因 wssv108 ... 4

5. YY1 家族轉錄因子 ... 5

第二章 材料與方法 ... 7

1. 菌種與細胞株 ... 7

2. 質體建構 (Construct plasmid) ... 7

3. 勝任細胞製備 (Competent cell preparation) ... 8

4. 細胞轉型 (Transformation) ... 8

6. 質體內毒素清除 (Removal of bacterial endotoxins) ... 9

7. 細胞轉染 (Transient transfection) ... 9

8. 細胞蛋白質萃取 (Protein extraction) ... 10

9. 細胞核蛋白質萃取 (Nuclear protein extraction) ... 10

10. 冷光報導活性分析 (Luciferase reporter assay) ... 10

11. 電泳流動性轉移分析 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) ... 11

12. Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay ... 11

13. 西方點墨法 (Western blotting) ... 12

第三章 結果 ... 13

1. WSSV108 蛋白質的表現 ... 13

2. WSSV108 蛋白質在 Sf9 昆蟲細胞中的分布 ... 13

3. WSSV108 蛋白質在 Sf21 昆蟲細胞中具有調控轉錄活性的能力 ... 14

4. WSSV108 蛋白質調控白點症病毒基因表現 ... 14

5. WSSV108 蛋白質調控白點症病毒極早期基因 wssv304 的表現 ... 15

6. WSSV108 蛋白質結合於白點症病毒極早期基因 wssv304 啟動子 ... 15

7. WSSV108 蛋白質藉由其 DNA 結合位調控 wssv304 的轉錄活性 ... 16

8. WSSV108 蛋白質形成多聚體及與 LvYY1 直接結合 ... 17

第四章 討論 ... 18

第五章 圖表 ... 24

圖 1、WSSV108 蛋白質在秋夜盜蛾細胞 （Sf9） 中的表現 ... 28

圖 2、WSSV108 蛋白質在 E. coli BL21(DE3) 中的表現 ... 29

圖 3、WSSV108 蛋白質在 Sf9 細胞中的分布 ... 30

圖 4、WSSV108 蛋白質在 Sf21 細胞中具有調控轉錄活化的能力 ... 31

圖 5、極早期蛋白質 WSSV108 對極早期與早期基因啟動子轉錄活性的影響 ... 32

圖 6、極早期蛋白質 WSSV108 對 wssv304 啟動子片段轉錄活性的影響 ... 33

圖 7、WSSV108 結合在 wssv304 基因啟動子上 -63 nt 至 -36 nt 區域 ... 34

圖 8、WSSV108 結合在 wssv304 基因啟動子上 -65 nt 至 -46 nt 區域 ... 36

圖 9、WSSV108 結合位突變影響 WSSV108 對 wssv304 啟動子的調控 ... 38

圖 10、WSSV108 蛋白質形成多聚體及與 LvYY1 直接結合 ... 39

參考文獻 ... 40

附錄 ... 47

附錄 1、白點症病毒之外觀型態 ... 47

附錄 2、WSSV108 蛋白質之結構預測 ... 48

附錄 3、WSSV108 蛋白質之進核序列預測 ... 49

附錄 4、WSSV108 蛋白質之進核序列預測示意圖 ... 50

第一章 前言

1.

Rahman et al., 2008)。白點症病毒為一個大型 DNA 病毒，具有約 300 kbp 的環狀 雙股 DNA，病毒顆粒大小約為長 250-380 nm、寬 70-150 nm，並具外套膜，外型 為橢圓型且具有一個類似尾巴的結構 (附錄 1)，被分類為 Nimaviridae 病毒科、

Whispovirus 病 毒 屬 ， 是 此 屬 內 唯 一 的 物 種 (Escobedo-Bonilla et al., 2008;

Sanchez-Paz, 2010)。目前已被鑑定出四種白點症病毒分離株分別為台灣分離株 (WSSV Taiwan isolate, AF440570)、中國分離株 (WSSV China isolate, AF332093) (Yang et al., 2001)、泰國分離株 (WSSV Tailand isolate, AF369029) (van Hulten et al., 2001) 與韓國分離株 (WSSV Korea isolate) (Chai et al., 2013)，本實驗使用之病毒 株為台灣分離株，其基因體大小為 307287 bp，被鑑定出 532 個 ORF (Open reading frame)，其中約 180 個可能轉譯出具有功能的蛋白質，但目前大部分的 ORF 無法 經由序列比對預測其功能。

白點症病毒最先於 1990 年代初期在中國大陸東南沿岸一帶被發現爆發嚴重 疫情，其後迅速往台灣北部、日本以及東南亞等蝦類養殖國家傳播，目前已成為 全球性的蝦類養殖傳染病，使養殖蝦類產量難以有效的提升 (Hasson et al., 2006;

Leu et al., 2009)。由於目前尚未發現能商業化的有效治療方式，因此現有的治療 方式皆無法成功推廣。雖然利用注射雙股 RNA 抑制病毒的 VP28 或是 VP26 基因 能有效降低白點症病毒的死亡率與再感染率，但成本卻過於高昂 (Mejía-Ruíz et al., 2011)。另外，利用篩選出體內 C-type lectin 表現量較高的蝦種，其對於病毒有 較高的抵抗力，但死亡率也接近 50% (Zhang et al., 2011)。前人也發現白點症病毒 是藉由其外套膜蛋白質 VP24 結合蝦宿主食道、胃、與後腸表面的甲殼素 (Chi-

tin)，進入宿主體內，利用口服 VP24 或是 VP24 的 CBP (chitin-binding domain) 片 段都能有效降低病毒的複製數 (Li et al., 2016)。

2.

白點症病毒生活史的相關研究，都是參考已知的 DNA 病毒，如人類單純皰 疹病毒第一型 (Herpes simplex virus I) 作為切入點去進行探討。通常 DNA 病毒在 感染宿主後，病毒會潛伏於宿主細胞中，在接收到適當的環境刺激後，病毒會由 潛伏期 (latency) 進入溶裂期 (lytic cycle) (Everett, 2014)。

目前世界上蝦養殖業主要在隔離病源的環境下養殖無特殊病原蝦苗，但報導 指出可在無特殊病原蝦苗體內偵測出白點症病毒基因 (Khadijah et al., 2003)，因 此白點症病毒可能如其他 DNA 病毒一樣，以潛伏期的方式存在於帶源病蝦體內 (Miyashita et al., 1995)，目前有三個白點症病毒潛伏期相關基因，分別是 wssv207、

wssv403 與 wssv427。WSSV207 蛋白質的 678 到 683 個胺基酸具有進核功能，且

在昆蟲細胞 Sf9 中被證實能抑制 thymidine–thymidylate kinase (TK-TMK) 與兩種 蛋白質激酶 (protein kinase) WSSV482 和 WSSV394 的轉錄活性 (Hossain et al., 2004)。WSSV427 會與蝦宿主體內的蛋白質磷酸酶 (protein phosphatase, PPs) 結 合，被認為會與蛋白質磷酸酶共同影響白點症病毒的潛伏期 (Lu et al., 2004)。

WSSV403 具有 RING domain，因此具有 ubiquitin E3 ligase 的功能。先前研究利 用 yeast-two hybrid 系統發現 WSSV403 會與蛋白質磷酸酶結合，顯示 WSSV403 可能與 WSSV427 蛋白質磷酸酶共同調節白點症病毒的生活週期 (He et al., 2008)。但目前對於白點症病毒潛伏期仍需要更多的研究。

當宿主或病毒受到外界刺激時，會影響病毒走向溶裂期 (Everett, 2014)，並 依序表現極早期基因 (immediate-early gene)、早期基因 (early gene) 與晚期基因 (late gene)，大量複製 DNA 及製造病毒顆粒所需的蛋白質，劇烈消耗宿主細胞的 資源，破壞細胞且釋出病毒顆粒，最終導致蝦宿主死亡。極早期蛋白質通常為轉

錄因子，能進一步活化下游的早期及晚期基因，早期蛋白質大部分與 DNA 複製 相關，在早期會產生大量的病毒基因組，另一部分的早期蛋白質會引導病毒走到 溶裂期晚期 (late phase)，晚期基因的表現會產生大量病毒顆粒的零件，經過組裝 就 會 形 成 有 致 病 力 的 病 毒 顆 粒 (Friesen et al., 1986; Honess et al., 1974;

Sánchez-Paz, 2010)。感染白點症病毒的病蝦大部分在感染後二至七天會全數死 亡，因此白點症病毒的極早期基因便是一個研究白點症病毒致病機制的切入方向。

3.

極早期基因的表現是病毒進入溶裂期的關鍵，部分病毒極早期基因具有轉錄 因子活性，如 Epstein-Barr virus (EBV) 的極早期蛋白質 Rta 及 Zta，能互相活化並 活化其他溶裂期基因的表現 (Liu et al., 2003)，調控下游病毒基因表達。極早期基 因會受到宿主蛋白質的調控，如極早期基因 ie1 會利用宿主體內的 PmSTAT 活化 自身表現，同時破壞草蝦的抗病毒機制 (Liu et al., 2007)。至今已被鑑定出白點症 病毒具有 21 個極早期基因 (Li et al., 2009; Lin et al., 2011; Liu et al., 2005)。其中除 了 ie1 之外，目前對於其他白點症病毒極早期基因的研究較少，大部分的極早期 基因功能特性尚未研究。目前已知 wssv113 與 ie1 能與 retinoblastoma (Rb) 作用，

控制宿主細胞週期 (Lin et al., 2013)。WSSV150 及 WSSV159 蛋白質具有穿膜區 塊 (transmembrane domain)。WSSV140 被發現具有 protein kinase domain，具有磷 酸化蛋白質的能力。另外，其中四種極早期基因利用 yeast-two hybrid 系統被證實 具有轉錄活性，分別為 wssv108、wssv126 (ie1)、wssv136、wssv156 (Li et al., 2009)，

但其對下游基因的詳細調控機制仍然未知。

極早期基因 ie1 為 21 種極早期基因當中研究最早且最多的基因，其蛋白質產 物 IE1 目前已被發現其具有結合 DNA 的能力，其蛋白質 N 端的胺基酸片段為轉 錄活性調節區，而 C 端的胺基酸片段為鋅指 DNA 結合結構 (Zinc finger motif)。

許多文獻證實其具有轉錄因子活性，如利用 GAL4 系統在昆蟲細胞 Sf9 中證實其

具有轉錄活化能力 (Liu et al., 2008)；IE1 也被證實會與蝦宿主體內的 TATA box binding protein (PmTBP) 直接結合並強化其轉錄活化能力。實驗室先前的研究發 現白蝦體內的 LvYY1 能促進 ie1 啟動子的轉錄活性 (黃庭儀, 2014)；除此之外，

IE1 也被發現會形成雙聚體 (Liu et al., 2011; Liu et al., 2008)。

極早期基因 wssv304 經由序列比對發現具有 RING-H2 domain，並被證實能與 宿主體內 ubiquitin-conjugating enzyme (PvUbc) 直接結合，發揮 E3 ligase 的能力，

且在感染病毒後 PvUbc 與 WSSV304 表現量會逐漸提高 (Wang et al., 2005)。而

wssv304 的基因表現也被發現會受到宿主的轉錄因子 LvKLF 的活化 (Huang et al.,

2014)。由目前結果可以推測 WSSV304 或許與白點症病毒的致病機轉或許有相當 的關連性。

4.

極 早 期 基 因 wssv108 為 本 篇 研 究 的 目 標 基 因 ， 核 苷 酸 序 列 為 591 bp (AF440570.1:57299~57889) ， 能 轉 譯 出 WSSV108 蛋 白 質 (GenBank:

AAL88976.1)，PI 值為 4.95，預估大小為 22.5 kDa，利用線上資料庫 NucPred 進 行蛋白質進核序列預測，顯示 WSSV108 在第 73 到 82 個胺基酸間可能存在一個 蛋白質進核序列 (附錄 3) (Brameier et al., 2007)。2009 年，Li 等人利用 yeast-two hybrid 系統證實 wssv108 具有轉錄因子活性，前人文獻指出 wssv108 的基因表現 會受到宿主的轉錄因子 LvKLF 的活化，進而影響病毒基因的複製 (Liu et al., 2015)。而 WSSV108 也被發現會被宿主體內的 SUMO ubiquitin-conjugating enzyme 9 (UBC9) 接上 SUMO 蛋白質，而 UBC9 能導致病毒複製能力上升 (Chen et al., 2013)。實驗室先前的研究也發現白蝦體內的 LvYY1 經由非典型的 YY1 的 DNA 結合序列促進白點症病毒極早期基因 wssv108 的轉錄活性 (蔡沛賜, 2015)，可以 推測 LvYY1 與 WSSV108 蛋白質對於白點症病毒的致病機轉可能有緊密的關聯 性。但對於其詳細作用機制仍須進一步釐清。

5. YY1 家族轉錄因子

轉錄因子能藉由其相似的序列或是功能區分成幾個家族，其中，Yin-yang 1 (YY1) 家族轉錄因子是具有相似度很高的鋅指結構區，能藉由此結構結合並活化 下游基因啟動子，而此結構區具有結合保守序列 CCAT 的特性。前人研究較多的 人類 YY1 蛋白質具有 414 個胺基酸，N 端具有數個轉錄活化區域及蛋白質結合區 域，而 C 端具有數個保守性高的鋅指結構區 (Bushmeyer et al., 1995; Do Kim et al., 2009)。人類 YY1 會藉由其高保守性的結合區自我活化 (autoregulated) 並維持表 現量 (Kim et al., 2009)。前人研究也發現 YY1 蛋白質與多種蛋白質調節生物體內 的平衡，如細胞生長週期、細胞分化與細胞凋亡等 (Gordon et al., 2006)；除此之 外，前人也發現許多人類 YY1 蛋白質能調控病毒極早期基因，如 Epstein-Barr 病 毒的極早期基因 BRLF1 的表現，會受到人類 YY1 蛋白質抑制而維持在潛伏期 (Zalani et al., 1997)；卡波西斯肉瘤皰疹病毒 (Kaposi's sarcoma-associated herpes- virus) 極早期基因 ORF50 會被 YY1 蛋白質活化促使病毒走向溶裂期 (Chang et al., 2011)。本實驗室日前成功自白蝦 (Litopenaeus vanammei) 利用 RT-PCR (reverse transcription-PCR) 成功找出一個與 YY1 家族具有高度相似性的基因，大小為 354 個胺基酸，其 C 端的四個鋅指結構區與人類的 YY1 蛋白質具有 96% 的相似度，

將其命名為 LvYY1（Litopenaeus vannamei Ying-yang 1）。實驗室先前的研究也 發現白蝦體內的 LvYY1 能促進白點症病毒極早期基因 wssv108 及 ie1 的轉錄活性 (黃庭儀, 2014; 蔡沛賜, 2015)，可以推測 LvYY1 與 WSSV108 蛋白質對於白點症 病毒的致病機轉可能有緊密的關聯性。

研究目的

白點症病毒使全世界養殖蝦產業遭受嚴重損失，目前尚未發現能商業化的有 效治療方式，而白點症病毒大部份的 ORF 無法利用其他物種的序列進行功能分 析，因此早期白點症病毒的相關研究，都是參考已知的 DNA 病毒，如人類單純 皰疹病毒第一型 (Herpes simplex virus Type I) 作為切入點去進行探討。當白點症 病毒感染蝦宿主後，會開始大量複製並破壞蝦宿主細胞，導致宿主死亡，與 DNA 病毒進入溶裂期的現象相似。極早期基因的表現是病毒進入溶裂期的關鍵，極早 期蛋白質通常為轉錄因子，能進一步活化下游的早期及晚期基因，但白點症病毒 目前未發現具有調控下游基因轉錄活化能力的極早期蛋白質。 本研究發現 WSSV108 可能是白點症病毒當中第一個具有序列專一性的轉錄因子，是白點症 病毒進入溶裂期的關鍵調控因子之一。

第二章 材料與方法

1.

實驗所使用的大腸桿菌 (Escherichia coli) 菌株為 EPI-300 與 BL21(DE3)，培 養於 Luria-Bertani (LB) 培養基 (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.2)之中 (Scott, 1968)，並於 37^oC 培養。細胞實驗則使用秋夜盜蛾 (Spodoptera

frugiperda) Sf21、Sf9 細胞株，並以含有 10% 胎牛血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen)

2.

本實驗室日前以白點症病毒的極早期基因 wssv108 的 ORF (Open reading frame) 的 3’端與 wssv108 的 5’UTR 設計 PCR 引子 (Primer) (表 1)，以感染病毒後 白蝦之 cDNA 作為模板，PCR 放大出 DNA 片段，再將 PCR 產物以 BamHI/NotI 與 HindIII/KpnI 限制酵素切位轉殖於 pIB-V5/His (Invitrogen) 及熱誘導表現載體 pDHSP-V5 載體 (Liu et al., 2007) 中，命名為 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His。此外，利用 BamHI/NotI 限制酵素切位將不含有

wssv108 的 5’UTR 序列的 wssv108 轉殖入載體 pGEX-4T1 與 pET-32a(+) (Novagen)

中，命名為 pET32a-wssv108 與 pGEX-4T1-wss108。pGL3-wssv304-(-412~+82) 利 用 WSSV-304-500-F 與 WSSV-304-500-R (表 1)，PCR 放大出極早期基因 wssv304 的轉譯起始點上游序列 500 個核苷酸 (nt)，以 SmaI/HindIII 限制酵素切位轉殖於 pGL3-basic (Invitrogen) 載 體 中 ； 而 不 同 長 度 片 段 的 啟 動 子 刪 除 株 報 導 質 體 pGL3-wssv304-(-93~+82)、pGL3-wssv304-(-54~+82) 與 pGL3-wssv304-(-36~+82)，

是利用不同的 PCR 引子 F 端與同一個 R 端放大出不同長度片段的 wssv304 啟動子 (表 1)，再以限制酵素切位分別轉殖於 pGL3-basic 載體中。除此之外，wssv108 結合位突變株是利用 p304(-59~-50)mut-F、p304(-59~-50)mut-R (表 1)，對 wild type pGL3-wssv304-(-412~+82) 進行點突變，將原始序列突變後，利用 PCR 放大出 DNA

片段 (表 1)，以 SmaI/HondIII 限制酵素切位轉殖於 pGL3-basic (Invitrogen) 載體 中 ， 並 命 名 為 pGL3-wssv304-(-412~+82)-(-59~-50)mut 。 載 體 pGL3-wssv113 、 pGL3-wssv124、pGL3-wssv164、pGL3-wssv228、pGL3-wssv234、pGL3-wssv243、

pGL3-wssv462、pGL3-wssv484、pGL3-wssv524、pGL3-ie3 使用基因轉譯起始點上 游序列 500 個核苷酸 (nt)，PCR 放大出 DNA 片段，以 SmaI/HindIII 限制酵素切 位轉殖於 pGL3-basic (Invitrogen) 載體中。G5p35BAS、GAL4-DBD 及 GAL-IE1 利用前人研究所做出的質體 (Liu et al., 2008)。將 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 以 KpnI 限制酵素進行截切，同時將 GAL4-DBD 以 SacII 限制酵素進行截切，之後將 兩者以 DNA Polymerase I，Large (Klenow) Fragment 作用 30 分鐘，純化並以 AgeI 限制酵素進行截切，將兩者連接反應後，轉型至大腸桿菌內以 Zeocin 抗生素篩選 出質體 GAL4-WSSV108。

3.

接種大腸桿菌於 5 ml 的 LB 培養液中，在 37^oC 搖晃培養 14 至 16 小時後，

將 500 µl 菌液加入 50 ml 的 LB 培養液當中，並在 37^oC 搖晃培養至細菌濃度 OD600

值達到 0.3 至 0.5 後，將菌液放入冰中作用 10 分鐘使細菌停止生長，再於 4^oC 以 3000 rpm 離心 10 分鐘沉澱菌體並去除上清液。加入 10 ml 的 transformation buffer (10 mM MOPS, 85 mM CaCl2, 27 mM D-glucose, 15% glycerol, 2 mM NaOH, pH 6.3) 並均勻回溶菌體，再於 4^oC 以 3000 rpm 離心 10 分鐘。除去上清液後以 2 ml 的 transformation buffer 回溶菌體，將 100 µl 菌液分裝於 1.5 ml 微量離心管中，並保 存於 -80^oC 冰箱 (Dagert et al., 1979)。

4.

將勝任細胞置於冰上緩慢解凍，加入適量質體 DNA 混和後，在冰上靜置反 應 20 分鐘，以 42^oC heat shock 作用 90 秒後置於冰上冷卻一分鐘，再加入 500 µl LB

培養液於 37^oC 靜置培養 30 分鐘，取 200 µl 菌液塗盤後於 37^oC 培養箱培養 14 至 16 小時 (Froger et al., 2007)。

5.

根據 Presto^TM Mini Plasmid Kit (Geneaid) 的說明書操作。

6.

將抽出的質體 DNA 加入 0.2X 體積的 TXS Buffer [6% (w/v) TritonX-114, 3.0%

(w/v) SDS]，搖晃混勻後靜置作用 10 分鐘後，接著加入 0.4X 體積的 5N NaCl 溶 液，使最終 NaCl 濃度為 1N，搖晃混勻後靜置作用 10 分鐘，以 12000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液加入 800 µl 的 Isopropenol 與 10 µg glycogen，於 -80^oC 靜置 一小時，之後將質體 DNA 於 4^oC 以 12000 rpm 離心 10 分鐘，倒去上清後以 1 ml 75％ 酒精沖洗一次，於 4^oC 以 12000 rpm 離心 10 分鐘後，開蓋風乾 10 分鐘，

之後以 Elution Buffer (15 mM Tris-HCl, pH 7.5) 回溶 DNA (Ma et al., 2012)。

7.

實驗以 Sf9 細胞表現重組蛋白質，首先取 9x10⁵個 Sf9 細胞加入 6 孔細胞培 養盤中靜置一小時。均勻混合適量的 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen)、質體 DNA 以及不含血清、不含抗生素的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 後於 27^oC 靜置反應 30 分鐘，之後將混合液加入已附著在培養盤上的細胞之中並均勻搖晃混合，再置於 27^oC 培養 72 小時，其中每 24 小時以 42^oC Heat shock 作用 30 分鐘，最後收集細 胞進行蛋白質萃取。

於冷光報導分析試驗中，首先取 2x10⁵個 Sf21 昆蟲細胞加入至 24 孔的細胞 培養盤中並等待細胞附著一小時。均勻混合適量的 Cellfectin® II Reagent (Invi- trogen)、質體 DNA 以及不含血清、不含抗生素的 Schneider’s Drosophila Medium

(Invitrogen) 後於 27^oC 靜置反應 30 分鐘，之後將混合液加入已附著在培養盤上 的細胞之中並均勻搖晃混合，再置於 27^oC 培養 2 天，最後進行冷光分析。

8.

以 1300 rpm 離心五分鐘收集 Sf9 細胞，並以 1 X phosphate-buffered saline (PBS) 沖洗 2 次，接著以 200 µl 含有 1:500 protease inhibitor [4-(2-Aminoethyl) benzene- sulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF)、Leupeptin]、1:1000 Dithiothreitol (DTT) 與 1:10000 IGEPAL (SIGMA IGEPAL^® CA-630) 的 20mM HEPES buffer 懸浮細胞，置 於冰上反應 15 分鐘後，以超音波震盪 30 秒使細胞完全破碎，於 4^oC 以 12000 rpm 離心 10 分鐘後，取出之上清液即為細胞蛋白萃取物。

9.

收集轉染目標表現載體之 Sf9 昆蟲細胞，以 400 µl 含有 1:200 protease inhibitor 的 Buffer A (10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) 懸浮 細胞，並放置於冰上作用 10 分鐘，接著加入 25 µl 10% NP-40 震盪作用 15 秒後 再放置於冰上作用 1 分鐘，接著以 2000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘，離心完畢後迅 速取出上清液，此部分即為細胞質分劃，再加入 50 µl 含有 1:200 protease inhibitor 的 Buffer B (20 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 並強 力震盪，再放置於冰上作用 15 分鐘，重複三次後，以 12000 rpm 於 4°C 離心後 10 分鐘，將上清液取出，此部分即為細胞核蛋白質，並貯存於 -80°C 冰箱。

10. 冷光報導活性分析 (Luciferase reporter assay)

將 Sf21 細胞培養於 24 孔培養盤，轉染 36 小時後，除去上清液並加入 200 µl lysis buffer (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100) 搖晃反應 10 分鐘以打破細胞，最後取 50 µl 上清液至冷光分析

盤中並加入 100 µl 的冷光受質液 [20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO3)4Mg(OH)2‧ 5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 270 mM coenzyme A, 470 mM luciferin, 530 mM ATP]，再立即放入冷光儀 (Orion II, Berthod, Bad Wildbad, Germany) 測量冷光數值 (De Wet et al., 1987)。

11. 電泳流動性轉移分析 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

EMSA 實驗根據 LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo) 的操作流 程進行，並以5’端標定 biotin 的 wssv304 啟動子序列為探針 (Probe) 進行實驗。

實驗預先混合 EMSA 反應溶液 (10X Binding Buffer : 100 Mm Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT, pH 7.5、1 mM EDTA, pH 7.5)、0.5 µl 10% NP-40 (SIGMA)、0.5 µl 5ng/µl Poly (dI-dC) 與 5 µl 20 fmol/µl Probe，之後加入細胞核蛋白質萃取物並補 ddH2O 至 20 µl，於室溫反應 30 分鐘，再加入 3 µl Ficoll loading dye [5% (w/v) ficoll, 0.01% bromophenol blue] 並使用 4% 原態聚丙烯醯胺凝膠以 94 V 電壓進行電 泳。待電泳完成後將膠體取下，於轉印溶液 (25 mM Tris-base, 183 mM glycine, 20% methanol) 以 100 V 電壓在 4^oC 下轉印一小時，將樣品轉印至 Nylon 膜 (Amersham Hybond^TM-N⁺, GE Healthcare)，待轉印完成後將 Nylon 膜陰乾並以 UV-linker (BLX-E254, VILBER LOURMAT) 照射 120 J 進行樣品固定 (UV cross-linking)。接著利用 Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate 偵測，並以 HRP 冷光受質呈色，最後以底片顯影進行結果分析。在競爭實驗中，

需先在蛋白質與 DNA 反應過程中加入未標記 biotin 的雙股 DNA 競爭者核苷酸序 列 (Competitors)，使用量為 biotin 探針的 5 倍。同時也使用抗 V5 與抗 His 抗體 進行 supershift assay，以確定 DNA-蛋白質複合體為目標蛋白質。

12. Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay

將以 IPTG 誘導表現之 GST-wssv108、His-LvYY1 與 His-wssv108 的 E. coli

BL21(DE3) 收集下來，並以含有 1:200 protease inhibitor、1:1000 DTT 與 1:10000 IGEPAL 的 NETN buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40) 懸浮，將細菌以超音波震盪打破 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750)，以 12000 rpm 於 4°C 離心後取出上清液備用。首先將誘導表現 GST-wssv108 之 蛋 白 質 樣 品 與 30 µl Glutathione Sepharose 4B 膠 體 (GE Healthcare)，於 4°C 作用一小時，並以 NETN buffer 清洗三次。接著分別加入 His-wssv108、His-LvYY1 蛋白質樣品以及控制組樣品 pET32a(+)，於 4°C 下共同 作用一小時，以 NETN 清洗膠體三次後移除上清，加入 30 µl 2X sample buffer (20%

α-mercaptoethanol ethanol,100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 4 mM EDTA, 0.01% bromophenol blue, 2% SDS) 將結合於膠體上的蛋白質樣品流洗下來，接著 以 SDS 膠體分離樣品，並以西方點墨法分析成果 (Sambrook et al., 2006)。

13. 西方點墨法 (Western blotting)

將蛋白質樣品加入 4X sample buffer (40% glycerol, 240 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% SDS, 0.04% bromophenol blue, 8% β-mercaptoethanol)，於 95°C 加熱 5 分鐘後 進行 SDS-PAGE 電泳分離蛋白質樣品，並於轉印溶液 (25 mM Tris-base, 183 mM glycine, 20% methanol) 以 94 V 電壓在 4^oC 下轉印一小時，將樣品轉印至 Hybond C membrane (Amersham Biosciences) 上，將轉印膜以 5% 脫脂牛奶 (安佳脫脂奶 粉) 於室溫 blocking 20 分鐘後。將一級抗體稀釋於含有 5% 脫脂奶粉的 TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) 中，並與轉印膜於室溫作用 一小時，接著以 TBST 清洗 3 分鐘，共 3 次後，加入二級抗體於室溫作用 30 分鐘，

以 TBST 清洗 3 分鐘，共 3 次，最後加入 chemiluminescent substrate (BD OptEIA™) 500 µl 作用 3 分鐘呈色，最後以底片顯影進行結果分析。本研究所使用的一級抗 體為抗 His 抗體 (Sigma) 偵測大腸桿菌所表現的 His-LvYY1 與 His-wssv108，以 及利用抗 V5 抗體 (Santa Cruz Biotech.) 偵測 Sf9 細胞所表現的 WSSV108。

第三章 結果

1. WSSV108 蛋白質的表現

為了表達 WSSV108 蛋白質，首先建構 WSSV108 表現載體，將感染白點症 病毒 24 小時的白蝦 (Litopenaeus vanammei) 總 RNA 進行反轉錄酶-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)，並以所製備出之 cDNA 為模板，擴增 wssv108 基因譯讀區全長，並選 殖到表現載體 pDHSP-V5/His 中，接著轉染至昆蟲細胞 Sf9 誘導表現後以抗 V5 抗 體進行偵測，結果發現表現量極差 (圖 1, lane 3)。為了提高 WSSV108 表現量，

實驗嘗試將 wssv108 基因的 5’UTR 序列連同 wssv108 譯讀區一併選殖到表現載體 中，製備新的 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His 表現載體，接著檢查表現量，結果 發現 WSSV108 在加入 5’UTR 序列後能穩定表現，其重組蛋白質大小約為 40 kDa (圖 1, lane 2)，以同樣方式製備 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His。

同時也將 wssv108 譯讀區選殖到 E. coli 表現載體中，製備 pET32a-wssv108 與 pGEX-4T1-wss108 表現載體，並轉型至 E. coli BL21(DE3)中以 IPTG 誘導表 現，同時以帶有控制組質體 pET32a(+) (圖 2A, lane 1) 或 pGEX-4T1 (圖 2B, lane 1) 的 E. coli BL21(DE3) 作為對照組。結果發現，GST-WSSV108 與 His-WSSV108 重組蛋白質大小分別約為 65 kDa (圖 2A, lane 2) 及 55 kDa (圖 2B, lane 2)，綜合以 上結果，WSSV108 能穩定表現在昆蟲細胞與大腸桿菌中。

2. WSSV108 蛋白質在 Sf9 昆蟲細胞中的分布

為了瞭解 WSSV108 蛋白質在細胞內的分布狀況，實驗分別將綠色螢光蛋白 質 (Green fluorescent protein, GFP) 表 現 載 體 pDHSP-GFP-V5/His 以 及 pIB-GFP-wssv108-V5/His 轉染至 Sf9 昆蟲細胞中，於 48 小時後將細胞固定並偵測 細胞中，GFP-WSSV108 融合蛋白質的分布狀態 (圖 3)，細胞核則以 DAPI 染色。

細胞核受到 DAPI 染色後呈現藍色，GFP-WSSV108 融合蛋白質則呈現綠色，結 果發現，GFP-WSSV108 融合蛋白質會分布在細胞核當中，且在細胞質中也有少

量的存在，與 GFP 在細胞中的分布相同，因此推測 WSSV108 蛋白質存在於細胞 核中，但是否具有特別的進核序列影響其在細胞內的分布尚未證實。

3. WSSV108 蛋白質在 Sf21 昆蟲細胞中具有調控轉錄活性的能力

前人研究報導指出，將白點症病毒極早期蛋白 IE1 與 DNA binding domain 製 作融合蛋白，稱為 GAL4-IE1，送入 Sf9 昆蟲細胞中後，能成功活化將具有 5 個重 複 GAL4 結合區域的報導載體 G5p35BAS-Luc，證實 IE1 在具有轉錄活化能力 (Liu et al., 2008)。為了驗證 WSSV108 在 Sf21 昆蟲細胞中是否能成功調控基因轉錄活 性，將報導載體 G5p35BAS-Luc 與表現載體 GAL4-DBD、GAL4-IE1 及

GAL4-WSSV108 分別共轉染至昆蟲細胞 Sf21 中，48 小時後偵測冷光活性數值。

由結果可以發現，正控制組表現載體 GAL4-IE1 能活化報導載體達 1.76 倍 (圖 4)，

而實驗組表現載體 GAL4-WSSV108 則會抑制報導載體至原本的 0.38 倍 (圖 4)，

與控制組相比，GAL4-IE1 及 GAL4-WSSV108 皆具有顯著差異 (p value<0.05)，

WSSV108 在 Sf21 昆蟲細胞中明顯抑制下游基因轉錄活性，顯示 WSSV108 具有 影響下游基因轉錄活性的能力。

4. WSSV108 蛋白質調控白點症病毒基因表現

為了測試白點症病毒極早期蛋白質 WSSV108 是否能影響病毒基因基因啟動 子，利用表現載體 pIB-V5/His、pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與含有白點症病毒基 因啟動子的報導質體共轉染到 Sf21 細胞中做初步測試，結果發現 WSSV108 可活 化極早期基因 wssv304、wssv113、wssv462、wssv524、wssv418 (ie3) 以及早期基 因 wssv124、wssv228 的基因啟動子 (圖 5)。而其中 WSSV108 可活化極早期基因

wssv304 達 6.5 倍 (圖 5)，利用 Student's t-test 分析數據之後，確認與負控制組相

wssv304 之機制作為後續研究的主要目標。

5. WSSV108 蛋白質調控白點症病毒極早期基因 wssv304 的表現

接著進一步探討 WSSV108 蛋白質在極早期基因 wssv304 啟動子上可能的調 控位置，利用帶有不同啟動子長度的刪除株縮小 WSSV108 在極早期基因 wssv304 的基因啟動子的可能調控區域，並將不同的啟動子報導質體分別與表現質體 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 或控制組表現質體 pIB-V5/His 共轉染到 Sf21 細胞中，

進 行 冷 光 活 性 分 析 ， 發 現 WSSV108 會 活 化 pGL3-wssv304-(-412~+82) 與 pGL3-wssv304-(-93~+82) 達 5.46 及 5.90 倍 (圖 6)，而對於 pGL3-wssv304-(-36~+82) 的活化倍率只有 1.43 倍 (圖 6)，因此推斷 WSSV108 蛋白質對於極早期基因

wssv304 的調控區域應位於 -93 nt 至 -36 nt 之間。

6. WSSV108 蛋白質結合於白點症病毒極早期基因 wssv304 啟動子

許多轉錄因子可藉由結合特定的 DNA 序列進而調控其轉錄活性，為了驗證 WSSV108 蛋白質是否會結合上極早期基因 wssv304 啟動子的 -93 nt 至 -36 nt 區 域，本研究以電泳流動性移轉分析實驗 (EMSA) 進行分析。首先由將表現質體 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His 轉染進入 Sf9 昆蟲細胞，48 小時後進行細胞核蛋白 質萃取，並以 wssv304 啟動子的 -104 nt 至 -36 nt DNA 片段製備 Biotin 標定探針，

將進行電泳流動性移轉分析，探討 WSSV108 蛋白質與 DNA 之間的結合，結果發 現 WSSV108 蛋白質與 DNA 探針能形成蛋白質-DNA 複合體 (圖 7, lane 3)，並以 不同的 wssv304 啟動子競爭者序列 (圖 7A) 競爭蛋白質結合，結果顯示未標定 Biotin 的 wssv304 -63 nt 至 -36 nt 序列 (圖 7, lane 7) 能有效競爭蛋白質-DNA 複合 體，導致複合體條帶訊號消失，而前段與中段競爭者序列無法有效競爭蛋白質 -DNA 複合體，非專一性的 STAT site 和 AP1 site 也無法有效競爭。進一步利用此 重組蛋白質上所帶有的 V5 與 His 標定以抗 V5 或是抗 His 抗體進行 Supershift 分 析，可以發現抗 His 與抗 V5 抗體能有效競爭蛋白質-DNA 複合體 (圖 7, lanes 4、

5)，綜合以上結果，推測此蛋白質-DNA 複合體由 WSSSV108 參與組成，而結合

區域位於 wssv304 啟動子的 -63 nt 至 -36 nt 區域。

前述結果成功地將 WSSV108 結合區域縮小至 wssv304 啟動子的 -63 nt 至 -36 nt 區域，而冷光活性分析結果顯示，WSSV108 對於 pGL3-wssv304-(-54~+82) 的 活化倍率下降到 2.41 倍 (圖 6)，推測 WSSV108 的調控可能位於 wssv304 啟動子 的 -54 nt 周遭區域。因此以 (-65/-46) 序列製備新的 biotin 標定探針，並同時設 計多點核酸突變的競爭者序列，分別製備三條六點核酸突變之序列 (-64/-59) mut、(-58/-53) mut 以及 (-52/-47) mut (圖 8A)，以上述探針和競爭者序列進行電 泳流動性移轉分析分析，結果顯示未標定之 -65 nt 至 -46 nt 片段能完全競爭蛋白 質-DNA 複合體 (wild type;圖 8, Lane 5) ，但三段突變序列也能成功競爭蛋白質 -DNA 複合體 (圖 8, lanes 6、7、8) 。同時，以 (-55/-36) 製備之競爭者序列 (-55 nt/-36 nt) ，也能成功競爭蛋白質-DNA 複合體 (圖 8, Lane 9) ，但非專一性的 STAT binding site 仍然無法有效競爭 (圖 8, lane 10)。由上述結果推測，WSSV108 會結 合於 wssv304 啟動子的 -65 nt 至 -46 nt 區域，並且在此片段上可能有複數個結合 區域，但確切的位置需要進一步的實驗證明。

7. WSSV108 蛋白質藉由其 DNA 結合位調控 wssv304 的轉錄活性

上 述 結 果 確 認 wssv304 啟 動 子 序 列 上 WSSSV108 的 結 合 範 圍 為 (5’-^-65GATTTCTGGGAAGAGGGTGT^-46-3’)。為了進一步探討此 WSSSV108 的結 合範圍在 WSSSV108 活化 wssv304 啟動子的調控機制中所扮演的角色，因此建構

wssv304 啟 動 子 突 變 株 之 報 導 質 體 進 行 冷 光 活 性 分 析 。 首 先 將 報 導 質 體

pGL3-wssv304-(-412~+82) 與突變株 pGL3-wssv304-(-412~+82)-(-59~-50)mut 分別 與表現質體 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 或控制組表現質體 pIB-V5/His 共轉染到

Sf21 細胞中，進行冷光活性分析。結果顯 示 WSSV108 活化 pGL3-wssv304-

動子的活化能力大幅下降，因此證實 wssv304 啟動子的 -59 nt 至 -50 nt 區域對於 WSSSV108 調控 wssv304 啟動子之轉錄活性是不可或缺的。

8. WSSV108 蛋白質形成多聚體及與 LvYY1 直接結合

以上實驗結果指出，極早期蛋白質 WSSSV108 為具有調節其他基因轉錄活性 的功能，推論 WSSV108 應為轉錄因子或是共激活因子。為了瞭解 WSSV108 是 否能形成同源二聚體，本實驗以細菌表現的蛋白質進行 GST pull-down assay 分 析。將含有 GST-WSSV108 的 E. coli BL21(DE3) (圖 10, lane 1) 之細菌溶裂液中與 能表現 His-WSSV108 與含有 His-LvYY1 的 E. coli BL21(DE3) 細菌溶裂液 (圖 10, lanes 3、4) 進行結合分析，並以 pET32a(+) 作為負控制組，樣品利用抗 His 抗體 進行西方點墨法分析。實驗結果發現，GST-WSSV108 能與 His-WSSV108 結合 (圖 10, lane 7)，同時也能與 His-LvYY1 結合 (圖 10, lane 6)，而 GST-WSSV108 無法 和 pET32a(+) 細菌溶裂液中的蛋白質有相互作用 (圖 10, lane 5)，顯示 WSSV108 能形成多聚體並與 LvYY1 直接結合，且不需要透過其它蛋白質的參與。

第四章 討論

截至 2010 年為止，白點症病毒被鑑定出具有 21 個極早期基因，其中四種極 早期基因具有轉錄活性，分別為 wssv108、wssv126、wssv136、wssv156。雖然前 人研究已證實此四種極早期蛋白質可能具有轉錄因子的活性。本研究發現極早期 蛋白質 wssv108 具有序列專一性的轉錄活性，並且可能是白點症病毒當中第一個 被發現具有序列專一性的轉錄因子。

本實驗室自感染白點症病毒 24 小時後的白蝦 cDNA 中，以 PCR 技術選殖出 白點症病毒的極早期基因 wssv108，利用 DNA 序列進行預測，PI 值為 4.95，預估 大小為 22.5 kDa。本實驗利用 Sf9 昆蟲細胞表現 WSSV108 蛋白質，但表現量極低，

推測表現量不佳的原因可能為 wssv108 基因的 mRNA 不穩定，為了提高蛋白質產 量，利用 wssv108 基因的 5’UTR 序列來穩定 wssv108 基因的 mRNA，有效提高了 表現量，其重組蛋白質大小約為 40 kDa (圖 1, lane 2)。除此之外，將 wssv108 譯 讀區選殖到 E. coli 表現載體中，利用 E. coli BL21(DE3)以 IPTG 誘導表現，

GST-WSSV108 與 His-WSSV108 重組蛋白質大小分別約為 65 kDa (圖 2A, lane 2) 及 55 kDa (圖 2B, lane 2) ，但蛋白質預估大小分別為 55 kDa 與及 45 kDa，相較於 預估大小增加了 10 kDa 的分子量，前人研究發現，WSSV108 會被宿主體內的 SUMO ubiquitin-conjugating enzyme 9 (UBC9) 接上 SUMO 蛋白質 (Chen et al., 2013)，推測 WSSV108 在 Sf9 昆蟲細胞及 E. coli 中會進行蛋白質修飾，但詳細的 修飾機制需要更進一步的研究驗證。接著利用成功表現出的蛋白質一步步探討 WSSV108 所具有的功能。

將 WSSV108 蛋白質利用線上資料庫 CFSSP 進行 WSSV108 蛋白質的二級結 構預測 (附錄 2)，可以發現在蛋白質中有類似 helix-turn-helix (HTH) 的結構，HTH 為一種蛋白質的結構序列，可以與 DNA 進行結合，因此猜測 WSSV108 會進入細 胞核中與 DNA 結合。接著使用以線上資料庫 NucPred 進行 WSSV108 蛋白質的進 核序列預測，顯示 WSSV108 在第 73 到 82 個胺基酸間可能存在一個蛋白質進核

序列 (附錄 3)。而以蛋白質預測建模網站 SCRATCH 與 Pymol 軟體進行 WSSV108

蛋白質的三級結構模型建構，以紅色標示出α 螺旋體結構，而以黑色字體標示出

預測所得之進核序列，得到 WSSV108 蛋白質完整結構與進核序列的示意圖 (附 錄 4)。

為了瞭解 WSSV108 蛋白質在細胞內的分布狀況，實驗分別將綠色螢光蛋白 質 (Green fluorescent protein, GFP) 表 現 載 體 pDHSP-GFP-V5/His 以 及 pIB-GFP-wssv108-V5/His 轉染至 Sf9 昆蟲細胞中，並偵測細胞中蛋白質的分布狀 態 (圖 3)，結果發現，GFP-WSSV108 融合蛋白質會分布在細胞核當中，且在細 胞質中也有少量的存在，與 GFP 在細胞中的分布相同，因此推測 WSSV108 蛋白 質存在於細胞核中，但是否具有特別的進核序列影響其在細胞內的分布尚未證 實。前人報導指出，60 kDa 以下的蛋白質可以利用擴散的方式進核 (Wang et al., 2007)，推測 WSSV108 可能是利用擴散的方式進核，但無法排除 WSSV108 利用 進核序列進核的可能性，詳細的進核機制仍需要更進一步的探討，同時，WSSV108 在細胞質中是否具有其他功能也需要更多的研究。

WSSV108 被前人報導具有轉錄活性 (Li et al., 2009)，為了驗證 WSSV108 在

Sf21 昆蟲細胞中是否能成功調控基因轉錄活性，將報導載體 G5p35

結果發現，GAL4-IE1 能活化報導載體達 1.76 倍 (圖 4)，而 GAL4-WSSV108 則會 抑 制 報 導 載 體 至 原 本 的 0.38 倍 ( 圖 4) ， 與 控 制 組 相 比 ， GAL4-IE1 及 GAL4-WSSV108 皆具有顯著差異 (p value<0.05)，WSSV108 在 Sf21 昆蟲細胞中 明顯抑制下游基因轉錄活性，顯示 WSSV108 具有影響下游基因轉錄活性的能力。

由上述結果推測 WSSV108 具有影響其他的病毒基因轉錄活化的能力，將表 現載體 pIB-V5/His、pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與含有白點症病毒基因啟動子的 報導質體或是負控制組 pGL3-basic 共轉染到 Sf21 細胞中做冷光報導分析的初步測 試，能發現 WSSV108 蛋白質對於部分極早期與早期基因的啟動子都能發現具有

轉錄活化的現象，顯示 WSSV108 會調控部分病毒極早期基因的轉錄活性。原先 預期 WSSV108 能活化大部分的病毒基因啟動子，但 WSS108 只對於部分病毒基 因具有調控能力，推測 WSSV108 應具有序列專一性，能辨認並活化含有特殊序 列的啟動子轉錄活性。在會被 WSSV108 活化的病毒基因啟動子中，極早期基因

wssv304 可被 WSSV108 活化達 6.5 倍，利用 Student's t-test 分析數據之後，確認

與負控制組相比具有顯著的差異，因此選擇極早期基因 wssv304 作為接下來的研 究目標。

為了進一步分析 WSSV108 對於 wssv304 基因啟動子的可能調控區域，接著 利用啟動子截切分析 (Promoter deletion assay) 進行一系列的啟動子片段冷光活 性分析，發現 WSSV108 會活化 pGL3-wssv304-(-93~+82) 達 5.90 倍，而對於 pGL3-wssv304-(-36~+82) 的活化倍率只有 1.43 倍 (圖 6)，將極早期基因 wssv304 可能的調控區域縮小至 -93 nt 至 -36 nt 之間。除此之外，WSSV108 對於 pGL3-wssv304-(-54~+82) 的活化倍率能達到 2.41 倍，但經過 Student's t-test 統計 分析之後，pGL3-wssv304-(-54~+82) 的活化倍率分別與 pGL3-wssv304-(-93~+82) 及負控制組 pGL3-basic 相比皆具有顯著差異，因此推論 WSSV108 的調控可能位 於 wssv304 啟動子的 -54 nt 周遭區域。

許多轉錄因子可藉由結合特定的 DNA 序列進而調控調控其轉錄活性，為了 探討 WSSV108 蛋白質是否會結合上極早期基因 wssv304 啟動子的 -93 nt 至 -36 nt 區域，本研究以電泳流動性移轉分析實驗 (EMSA) 進行分析，以 wssv304 啟動 子的 -104 nt 至 -36 nt DNA 片段製備 Biotin 標定探針，將探針進行電泳流動性移 轉分析分析 WSSV108 蛋白質與 DNA 之間的結合 (圖 7)，結果發現 WSSV108 蛋 白質與 DNA 探針能形成蛋白質-DNA 複合體 (圖 7, lane 3)，結合區域位於 wssv304 啟動子的 -63 nt 至 -36 nt 區域。為了進一步縮小 WSSV108 結合的 DNA 序列，

與冷光活性分析結果 (圖 6) 共同分析，推測 WSSV108 轉錄活化區域應位於

wssv304 基因啟動子的 -54 nt 區域周圍。因此以 (-65/-46) 序列製備新的 biotin 標

定探針，並同時設計多點核酸突變的競爭者序列，分別製備三條六點核酸突變之 序列 (-64/-59) mut、(-58/-53) mut 以及(-52/-47) mut (圖 7A)，以上述探針和競爭者 序列進行電泳流動性移轉分析分析，結果顯示未標定之 -65 nt 至 -46 nt 片段能完 全競爭蛋白質-DNA 複合體 (wild type;圖 8, lane 4)，但三段突變序列皆能成功競 爭蛋白質-DNA 複合體 (圖 8, lanes 6、7、8)。同時，以 (-55/-36) 製備之競爭者 序列 (-55 nt/-36 nt)，也能成功競爭蛋白質-DNA 複合體 (圖 8, lane 9)，但非專一 性的 STAT bindung site 和 AP1 site 仍然無法有效競爭。由上述結果推測，WSSV108 會結合於 wssv304 啟動子的 -65 nt 至 -46 nt 區域，並且在此片段上可能有數個結 合區域，但確切的位置需要進一步的實驗證明。

將 wssv304 啟動子序列與上述結果進行分析，發現在 wssv304 啟動子上的 -59 nt 至 -55 nt 區域為 TGGGA，-52 nt 至 -48 nt 區域為 AGGGT，具有一定的相似性，

推測為 wssv108 的結合序列，將序列重複區域與三段突變序列 (-64/-59) mut、

(-58/-53) mut、(-52/-47) mut 及競爭者序列 (-55 nt/-36 nt) 進行比對，可以發現四 種序列皆無法完全刪去此推測片段，TGGGA 或 AGGGT，未來需要利用此兩段序 列突變株或是刪除株進行實驗來驗證此推測。此外，由於 EMSA 實驗是利用昆蟲 細胞核萃取物進行實驗，並不是單一的純化 WSSV108 蛋白質，因此無法確認 WSSV108 是直接結合上 DNA，利用 E. coli BL21(DE3) 表現的 wssv108 蛋白質進 行實驗，不論 GST-WSSV108 或 His-WSSV108 皆無法看到蛋白質-DNA 複合體，

因此無法確認 WSSV108 是否直接結合 DNA，未來可能需要更多實驗證明 WSSV108 是否具有轉錄因子必須的 DNA 結合區域，或是 WSSV108 是藉由結合 其他轉錄因子達到活化特定基因的功能。

利用 wssv304 啟動子突變株之報導質體進行冷光活性分析，結果顯示 -59 nt 至 -50 nt 區域突變導致 WSSSV108 對 wssv304 啟動子的活化能力大幅下降，-59 nt 至 -50 nt 區域包含了由上述結果推測出的兩個 WSSV108 的結合序列，-59 nt 至 -55 nt 區域 (TGGGA) 與 -52 nt 至 -48 nt 區域 (AGGGT)，未來可以利用只突變

便其中之一的突變株進行冷光活性分析，驗證 WSSSV108 是否藉由兩個相似的序 列活化 wssv304 啟動子，同時，兩者是否都能發揮讓 WSSV108 結合與調節轉錄 地能力需要更進一步的實驗證明。

二聚體為兩個蛋白質以非共價鍵 (non-covalently bound) 鍵結形成。一些轉錄 因子會藉由二聚體形式結合在特定的 DNA 序列上，像是會受到細菌和病毒感染 刺激的 Activator protein 1 (AP-1) 轉錄因子 (Hess et al., 2004)，即是以二聚體的形 式結合在 DNA 上 (Vinson et al., 2002)，以 AP-1 為例，AP-1 的活化會促進或是抑 制細胞凋亡 (apoptosis)，而此差異決定於 AP-1 的二聚體組成 (Ameyar et al., 2003)。除此之外，前人的研究發現，許多病毒的極早期蛋白質便是以二聚體的形 式結合於 DNA 上，如 baculovirus 的 IE1 蛋白質，便利用 homologous region (hr) 形 成二聚體，發揮進核與活化轉錄的功能 (Olson et al., 2002)；人類單純皰疹病毒第 一型 (herpes simplex virus type 1) 的極早期基因 ICP4，具有活化病毒早期及晚期 基因的能力，同時也具有抑制極早期基因轉錄活性的能力，但其亦需要形成二聚 體才具有結合 DNA 與活化轉錄的功能 (Gallinari et al., 1994)。極早期基因 ie1 的 蛋白質產物同樣具有轉錄活性，能形成同源二聚體並結合在 DNA 上，為了測試 WSSV108 蛋白質是否具有同樣形成同源二聚體的能力，利用 GST pull-down assay 分析，實驗結果發現，GST-WSSV108 能與 His-WSSV108 結合 (圖 10, lane 7)，

而 GST-WSSV108 無法和 pET32a(+) 細菌溶裂液中的蛋白質有相互作用，顯示 WSSSV108 能形成多聚體，且不需要透過其它蛋白質的參與。WSSV108 的多聚 體特性與 DNA 結合能力、活化轉錄的功能之間的關聯需要更多的研究才能證明。

由本實驗室之前的研究發現，WSSV108 的啟動子活性會受到宿主體內轉錄 因子 LvYY1 的調控活化，由上述結果可以推測出 WSSV108 為一個具有調控轉錄 能力的蛋白質。為了探討其是否會與其他轉錄因子進行相互作用，本實驗同樣利 用 GST pull-down assay 分析，發現 WSSSV108 能與 LvYY1 直接結合，目前已發 現 LvYY1 於白點症病毒的極早期扮演重要角色，實驗室先前的研究也證實 LvYY1

能活化極早期基因 ie1 與 wssv108 啟動子的轉錄活性 (黃庭儀, 2014; 蔡沛賜, 2015)，WSSV108 極早期蛋白質是否能與 LvYY1 進行協同作用或是相互抑制來使 病毒極早期的調控變得更加彈性，WSSV108 的多聚體特性與 LvYY1 結合的關聯 性，WSSV108 是否會在同源、異源多聚體之間切換，都是未來值得進一步探討 的地方。

由以上結果可以總結出，WSSV108 是白點症病毒當中第一個發現具有序列 專一性的轉錄因子，在極早期基因當中可能扮演著非常重要的角色，甚至有可能 是白點症病毒進入溶裂循環的關鍵調控因子，同時，與 LvYY1 的相互作用使 WSSV108 在極早期的調控方面具有更多的探討空間，如 WSSV108 是否透過利用 宿主體內的轉錄因子 LvYY1 促使白點症病毒進入溶裂循環，揭露出病毒體內的 轉錄因子 WSSV108 與病毒基因與宿主體內轉錄因子具有彈性且多元化的調控機 制，但目前仍需要再做更多次的表現觀察與實驗才能得知，因此整體而言，在未 來對於極早期基因 wssv108 的研究是非常值得探討與發展的。

第五章 圖表

表 1、本研究所用之引子序列

Name/Categories Sequence (5’to3’) Usage

Construction

wssv108-BamHI-F CGGGATCCATGGACGTTTCTTCCTAT

pDHSP-wssv108-V5/His pIB-wssv108-V5/His pET32a- wssv108 pGEX-4T1-wssv108

wssv108-EcoRI-R

CGGAATTCCGGTAGCTAAAGTTGTT- GCG

pDHSP-wssv108-V5/His pIB-wssv108-V5/His pET32a- wssv108 pGEX-4T1-wssv108

108-5’UTR-H3-F CCAAGCTTGTCAGTTCCAGAAGAAGAG

pDHSP-5’UTR-wssv108-V5 /His

pIB--5’UTR-wssv108-V5/Hi s

108-5’UTR-K1-R

CGGGTACCTTTCTCCCAACTTT- GTTTTTG

pDHSP-5’UTR-wssv108-V5 /His

pIB--5’UTR-wssv108-V5/Hi s

WSSV-304-500-F

TCCCCCGG-

GAAAAACTTTTAAAAAATTTTTCTGG

pGL3-wssv304-(-412~+82)

WSSV-304-500-R

CCCAAGCTTGGCTGCGAGAATGGTTT- GCG

pGL3-wssv304-(-412~+82) pGL3-wssv304-(-93~+82) pGL3-wssv304-(-54~+82)

pGL3-wssv304-(-36~+82)

WSSV304-de-175-F

TCCCCCGGGCAGAAACAGGATATGA- TATC

pGL3-wssv304-(-93~+82)

wssv304-KpnI (-54)-F

CGGGGTACCAGAGGGTGTTTTTT- GTGCC

pGL3-wssv304-(-54~+82)

wssv304-del-118-F

TCCCCCGGGTGGGTGTATAAAA- GAGCGC

pGL3-wssv304-(-36~+82)

p304(-59~-50)mut-F

CATAGAT-

TTCAAAATTTTAAGTGTTTTTT- GTGCCGATCTGGGTGTATAAAAGAG

pGL3-wssv304-(-412~+82)-(

-59~-50)mut

p304(-59~-50)mut-R

CAAAAAACACTTAAAATTTT- GAAATCTATGATATCATA-

TCCTGTTTCTGTGTGGC

pGL3-wssv304-(-412~+82)-(

-59~-50)mut

EMSA

Bio-

tin-WSSV304-SP1(2) -F

GGGCATCTCGCCCACACAGAAA Probe, (-104 nt/-36 nt)

wssv304-93~64F

CCACACAGAAACAGGATATGA- TATCATAG

Cold probe, (-93 nt/-64 nt)

wssv304-93~64R CTATGATATCATATCCTGTTTCTGTGTGG Cold probe, (-93 nt/-64 nt)

wssv304-63~36F

ATTTCTGGGAAGAGGGTGTTTTTT- GTGCC

Cold probe, (-63 nt/-36 nt)

wssv304-63~36R

GGCACAAAAAACACCCTCTTCCCAGAA AT

Probe, (-104 nt/-36 nt) Cold probe, (-63 nt/-36 nt)

wssv304-78~50F ATATGATATCATAGATTTCTGGGAAGAG Cold probe, (-78 nt/-50 nt) wssv304-78~50R CTCTTCCCAGAAATCTATGATATCATAT Cold probe, (-78 nt/-50 nt) AP1 binding site-1 CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA Cold probe, AP1 site AP1 binding site-2 TTC CGG CTG ACT CAT CAA GCG Cold probe, AP1 site STAT binding site-1 TTA TTC CTA GAA ATG Cold probe, STAT site STAT binding site-2 CAT TTC TAG GAA TAA Cold probe, STAT site

bio-

tin-wssv304-(-65~-46 )-F

Biotin-GATTTCTGGGAAGAGGGTGT Probe, (-65 nt/-46 nt)

wssv304-(-65~-46)-R ACACCCTCTTCCCAGAAATC

Probe, (-65 nt/-46 nt) Cold probe, (-65 nt/-46 nt) wssv304-(-65~-46)-F GATTTCTGGGAAGAGGGTGT Cold probe, (-65 nt/-46 nt)

wssv304-(-65~-46)(- 64~-59mut)-F

GGC CCT CGG GAA GAG GGT GT

Cold probe, (-65 nt/-46 nt)- (-64/-59)mut

wssv304-(-65~-46)(- 64~-59mut)-R

ACA CCC TCT TCC CGA GGG CC

Cold probe, (-65 nt/-46 nt)- (-64/-59)mut

wssv304-(-65~-46)(- 58~-53mut)-F

GAT TTC TAA AGG AAG GGT GT

Cold probe, (-65 nt/-46 nt)- (-58/-53)mut

wssv304-(-65~-46)(- 58~-53mut)-R

ACA CCC TTC CTT TAG AAA TC

Cold probe, (-65 nt/-46 nt)- (-58/-53)mut

wssv304-(-65~-46)(- 52~-47mut)-F

GAT TTC TGG GAA GGA AAC AT

Cold probe, (-65 nt/-46 nt)- (-52/-47)mut

wssv304-(-65~-46)(- 52~-47mut)-R

ATG TTT CCT TCC CAG AAA TC

Cold probe, (-65 nt/-46 nt)- (-52/-47)mut

wssv304-(-55~-36)-F AAGAGGGTGTTTTTTGTGCC Cold probe, (-55 nt/-36 nt) wssv304-(-55~-36)-R GGCACAAAAAACACCCTCTT Cold probe, (-55 nt/-36 nt)

圖 1、WSSV108 蛋白質在秋夜盜蛾細胞 （Sf9） 中的表現

將 wssv108 蛋白質表現質體 pDHSP-wssv108-V5/His 轉染進 Sf9 細胞中，培養 72 小時後收取細胞，利用 SDS-PAGE 分離樣品，並以抗 His 抗體進行偵測，lane 1 為轉入 pDHSP-V5/His 的細胞萃取物；Lanes 2、3 分別為轉入帶有 5’UTR 之 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His，以及 pDHSP-wssv108-V5/His 表現質體。

圖 2、WSSV108 蛋白質在 E. coli BL21(DE3) 中的表現

(A) 以送入質體 pGEX-4T1 的 E. coli BL21(DE3) 所表現蛋白質作為對照 (lane 1)，送入質體 pGEX-4T1-wssv108，並以 IPTG 誘導 5 小時表現蛋白質 (lane 2)。樣品經 SDS-PAGE 分離後，以抗 GST 抗體進行偵測。(B) 以送入質體 pET32a(+) 的 E. coli BL21(DE3) 所 表 現 蛋 白 質 作 為 對 照 組 (lane 1) ， 送 入 質 體 pET32a-wssv108，並以 IPTG 誘導 5 小時表現蛋白質 (lane 2)。樣品經 SDS-PAGE 分離後，以抗 His 抗體進行偵測。

圖 3、WSSV108 蛋白質在 Sf9 細胞中的分布

將控制組載體 pDHSP-GFP-V5/His 與 GFP-WSSV108 融合蛋白質的質體 pIB-GFP-wssv108-V5/His 分別轉染至昆蟲細胞 Sf9 中。細胞核使用 DAPI 染色，並 以螢光顯微鏡觀察蛋白質分布狀況。

圖 4、WSSV108 蛋白質在 Sf21 細胞中具有調控轉錄活化的能力

(A) 實驗所使用之質體，轉錄起始點以+1 表示。DBD 為結合 GAL4 site 之 DNA binding domain。(B) 將報導載體 G5p35BAS-Luc 與表現載體 GAL4-DBD、

GAL4-IE1 及 GAL4-WSSV108 分別共轉染至昆蟲細胞 Sf21 中，48 小時後偵測冷 光活性數值。倍率為各組所測得之冷光數值除以轉染 GAL4-DBD 之冷光數值。數 據以 Student's t-test 分析，星號 (*) 表示與負控制組相比具有顯著的差異 (p value<0.05)。實驗每次進行二重複。數值為三次的平均值，誤差線為標準差 (standard deviation, SD)。

圖 5、極早期蛋白質 WSSV108 對極早期與早期基因啟動子轉錄活性的影響 將表現載體 pIB-V5/His、pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與白點症病毒基因啟動 子報導質體共轉染到 Sf21 細胞中，48 小時後偵測冷光活性數值。倍率為各組轉 染 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 所測得之冷光數值除以轉染 pIB-V5/His 之冷光數 值。數據以 Student's t-test 分析，星號 (*) 表示與負控制組相比具有顯著的差異 (p value<0.05)。實驗每次進行二重複。數值為三次的平均值，誤差線為標準差 (standard deviation, SD)。

圖 6、極早期蛋白質 WSSV108 對 wssv304 啟動子片段轉錄活性的影響

將表現載體 pIB-V5/His、pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與帶有不同長度的啟動 子報導質體共轉染到 Sf21 細胞中，48 小時後偵測冷光活性數值。倍率為各組轉 染 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 所測得之冷光數值除以轉染 pIB-V5/His 之冷光數 值。數據以 Student's t-test 分析，星號 (*) 表示與負控制組相比具有顯著的差異 (p value<0.05)。實驗每次進行二重複。數值為三次的平均值，誤差線為標準差 (standard deviation, SD)。

圖 7、WSSV108 結合在 wssv304 基因啟動子上 -63 nt 至 -36 nt 區域

以電泳流動性移轉分析實驗 (EMSA) 進行分析，(A) 使用在 EMSA 中的核 苷酸序列。(B) Lane 1 為只含有 Biotin 標記的探針 (-104 nt/-36 nt)。Lane 2 為 Sf9 細 胞 原 生 核 萃 取 物 與 Biotin 標 記 的 探 針 。 Lane 3 為 轉 染 質 體 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His 至 Sf9 細胞 72 小時後的核蛋白質萃取物與 Biotin 標記的探針，並形成蛋白質-DNA 複合體 (rWSSV108-DNA)。Lanes 6~10 為 Biotin

標記的探針與無 Biotin 標記的競爭者序列，共同競爭重組蛋白質 WSSV108，分 別為 wild type wssv304 promoter、wild type wssv304 promoter 前段 (-93 nt/-64 nt)、

中段 (-78 nt/-50 nt)、後段 (-63 nt/-36 nt)、非專一性的 STAT binding site 和 AP1 site 序列。競爭者的濃度為探針的 5 倍。Lane 4 使用抗 His 抗體，Lane 5 使用抗 V5 進行 supershift 分析。

圖 8、WSSV108 結合在 wssv304 基因啟動子上 -65 nt 至 -46 nt 區域

以電泳流動性移轉分析實驗 (EMSA) 進行分析，(A) 使用在 EMSA 中的核

苷酸序列。(B) Lane 1 為只含有 Biotin 標記的探針 (-65 nt/-46 nt)。Lane 2 為 Sf9 細 胞 原 生 核 萃 取 物 與 Biotin 標 記 的 探 針 。 Lane 3 為 轉 染 質 體 pDHSP-5’UTR-wssv108-V5/His 至 Sf9 細胞 72 小時後的核蛋白質萃取物與 Biotin 標記的探針，並形成蛋白質-DNA 複合體 (rWSSV108-DNA)。Lanes 5~10 為 Biotin 標記的探針與無 Biotin 標記的競爭者序列，共同競爭重組蛋白質 WSSV108，分 別 為 wild type wssv304 promoter 、 六 點 核 酸 突 變 之 序 列 (-64/-59)mut 、 (-58/-53)mut、(-52/-47)mut、wild type wssv304 promoter (-55 nt/-36 nt)片段、非專 一性的 STAT site 序列。競爭者的濃度為探針的 5 倍。Lane 4 使用抗 His 抗體，Lane 5 使用抗 V5 進行 supershift 分析。

圖 9、WSSV108 結合位突變影響 WSSV108 對 wssv304 啟動子的調控

(A) wssv304 promoter 啟動子片段報導質體示意圖，轉錄起始點以+1 表示。(B) 將表現載體 pIB-V5/His、pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 與 WSSSV108 的結合範圍突 變的啟動子報導質體共轉染到 Sf21 細胞中，48 小時後偵測冷光活性數值。倍率 為各組轉染 pIB-5’UTR-wssv108-V5/His 所測得之冷光數值除以轉染 pIB-V5/His 之冷光數值。數據以 Student's t-test 分析，星號 (*) 表示與負控制組相比具有顯 著的差異 (p value<0.05)。實驗每次進行二重複。數值為三次的平均值，誤差線為 標準差 (standard deviation, SD)。

圖 10、WSSV108 蛋白質形成多聚體及與 LvYY1 直接結合

將 glutathione-Sepharose agarose 加入含有 GST-WSSV108 的 E. coli BL21(DE3) 之細菌溶裂液中。共同作用一小時後加入能表現 His-WSSV108 (lane 3)與含有 His-LvYY1 (lane 4) 的 E. coli BL21(DE3) 細菌溶裂液，並以 pET32a(+) 作為負控 制組 (lane 2)，在 4°C 共同作用一小時並清洗後，以抗 His 抗體進行西方點墨法 分析，偵測結合於 GST-WSSV108-glutathione Sepharose 膠體的蛋白質 (lanes 5、

6、7)，以抗 GST 抗體偵測結合於膠體的 GST 融合蛋白質 (lane 1)。

參考文獻

Ameyar, M., M. Wisniewska, and J. Weitzman. 2003. A role for AP-1 in apoptosis: the case for and against. Biochimie 85 (8):747-752.

Brameier, M., A. Krings, and R. M. MacCallum. 2007. NucPred—predicting nuclear localization of proteins. Bioinformatics 23 (9):1159-1160.

Bushmeyer, S., K. Park, and M. L. Atchison. 1995. Characterization of functional domains within the multifunctional transcription factor, YY1. J Biol Chem 270 (50):30213-30220.

Chai, C. Y., J. Yoon, Y. S. Lee, Y. B. Kim, and T.-J. Choi. 2013. Analysis of the complete nucleotide sequence of a white spot syndrome virus isolated from pacific white shrimp. J Microbiol 51 (5):695-699.

Chang, P.-J., L.-W. Chen, Y.-C. Shih, P.-H. Tsai, A.-C. Liu, C.-H. Hung, J.-Y. Liou, and S.-S. Wang. 2011. Role of the cellular transcription factor YY1 in the latent-lytic switch of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Virology 413 (2):194-204.

Chen, A.-J., L. Gao, X.-W. Wang, X.-F. Zhao, and J.-X. Wang. 2013.

SUMO-conjugating enzyme E2 UBC9 mediates viral immediate-early protein SUMOylation in crayfish to facilitate reproduction of white spot syndrome virus. J

Virol 87 (1):636-647.

Chiang, H.-C., and C.-F. Lo. 1995. Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Dis Aquat Organ 23:165-173.