第三章 試驗部分
第一節 材料與方法
一、 甘草之基原鑑定 (一) 材料
於 2001 年 9 月，由林郁進學長採自中國東北 吉林省 白城栽培 基地（Fig. 3-4）。
(二) 方法
1. 外部形質鑑別
利用五官檢查法配合立體顯微鏡觀察。
2. 內部組織鑑別
將材料進行徒手切片，以橫切（Transverse section，X.S.）、放射 性縱切（Radial longitudinal section，R.L.S.）、與切線性縱切（Tangential longitudinal section，T.L.S.）等，切取近 10μm 之薄片檢體置於載玻 片上，先以 chloral hydrate solution 清除細胞內含物後，再滴加 各種不同化學試劑，如 phloroglucinol solution 與 hydrochloric acid 進 行木化反應；或滴加 sudan Ⅲ solution 進行木栓化反應，或利用 Schultz，s 與 KOH maceration method 將材料予以解離，最後以 glycerin-water（1：1）混合溶液將檢體封鎖，蓋上蓋玻片，置於顯微 鏡下，先用低倍鏡檢查其輪廓，再以高倍鏡觀察各個組織之特徵，並 以顯微測微計測量各組織或細胞之大小。
(三) 結果分析
利用顯微攝影技術紀錄觀察結果，並製作生藥組織顯微照相圖，
作為本試驗甘草之基原依據（Fig. 5）。
二、 甘草之組織培養 (一) 材料
本研究使用之藥材，係 2001 年 9 月由林郁進學長採自中國東北 吉林省 白城栽培基地，經顯微鑑定確認為甘草之基原植物烏拉爾甘 草 （Glycyrrhiza uralensisFISCH.），切取其葉片（Fig. 6）經誘導形成 癒合組織作為本試驗之材料。
(二) 方法
1. 培養基之製備
培養基主要以 MS (Murashige and Skoog, 1962)(90) 無機鹽類為 主，分別添加各類植物生長調節劑及各種添加物。培養基在加入凝膠 物質前，先用 0.5 N NaOH 或 HCl，將 pH 值調至 5.7 ± 0.1，以 121
℃、15 lb/in2 ( 1.05 kg/cm2 ) 之條件，高溫高壓滅菌 15 分鐘後，擺成 斜面放冷凝固備用。
2. 培殖體之消毒
甘草葉片以清水洗淨（Fig. 6），於 70 % 乙醇中浸泡 1 分鐘，再 以 0.5% 次氯酸鈉 (每 50 ml 滴加 Tween 20 一滴) 溶液於超音波振 盪器消毒 10 分鐘 ，移至無菌接種台後，以無菌水清洗五次，置於 無菌濾紙上吸乾表面水分，去除邊緣部分後切成約 0.7 ㎝ 2大小，以 備進行癒合組織誘導。
取甘草種子為培植體（Fig. 6），經清水洗淨後，先以 70 %乙醇中 浸泡 1 分鐘，再以 0.5 % 次氯酸鈉 (每 50 ml 滴加 Tween 20 一滴) 溶液於超音波振盪器消毒 10 分鐘 ，移至無菌接種台後，以無菌水 清洗五次，置於無菌濾紙上吸乾表面水分備用。
3. 培養環境
接種後之材料置於 25 ± 1℃之恆溫，於黑暗或照光 (光量 100 µE/m2s，光波長 350-800 nm)環境下培養。
4. 接種方式
癒合組織生長和繼代培養試驗皆以 25≅120 mm 之試管為培養容 器，內含 10 ml 培養基。皆秤取癒合組織 100 mg 為一團，每支試管 接種兩團癒合組織。接種後於 25 ± 1℃、黑暗或照光（每日照光 14 小時）且相對濕度為 70 %之培養室靜置培養。
5. 癒合組織之誘導
將表面消毒過之葉片接種於含有 0.5 mg/L BA 及 1 mg/L 2,4-D 之 MS 固體培養基中，在黑暗下培養，經 30 天後將誘導出之黃綠色 癒合組織以原培養基繼代培養，以形成出更多的癒合組織供本試驗探 討各種不同因素影響之用（Fig. 6A, B）。
將消毒過之甘草種子，接種於 MS 基礎鹽類培養基中，經 3 天後 即長出根，待 30 天後切取甘草無菌苗之根為培殖體，培養於含有 0.5 mg/L BA 及 0.5 mg/L 2,4-D 之 MS 固體培養基中誘導癒合組織，以 供本試驗探討不同培植體誘導出的癒合組織對誘導其 glycyrrhizin 成 分上的差異（Fig. 6A, C, D）。
6. 統計分析方法
各 處 理 間 之 比 較 ， 係 以 最 小 顯 著 差 異 測 驗 法 LSD (least significant difference test) 判定其差異性。
三、 甘草之化學成分含量測定
(一) 材料
1. 組織培養法所得之甘草癒合組織。
2. 甘草之栽培品
2001 年 9 月，由林郁進博士採自中國東北吉林省 白城栽培基 地，經基原鑑定確認為 2-3 年生之烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis FISCH.)，取其根莖經乾燥後稱取備用(以下稱為 GUF)（Fig. 7A）。 3. 市售甘草之飲片：
2002 年 2 月購自台中市 健行路 聯合中西藥局(以下稱為 GUM)
（Fig. 7B）。
4. 市售甘草之科學濃縮品：
2002 年 2 月購自台中市 健行路 聯合中西藥局(以下稱為 GUS)。
5. 甘草之野生品
2002 年 7 月由中國醫藥學院中國西北藥用植物考察團於甘肅省 天水取得之 5 年生以上之甘草(以下稱為 GUW)。
6. 甘草之台灣栽培品
2003 年 3 月取自雲林縣 古坑栽培場之約 2 年生之甘草(以下稱為 GUT)。
7. 台灣進口之原藥材
2003 年 4 月由某製藥廠提供(以下稱為 GUX)。
8. 成分標準品
Glycyrrhizin 購自建吾公司 (代理日本 米山藥品工業株式會社)。
(二) 儀器
1. 高效液相層析儀 (High Performance Liquid Chromatography)：
(1) 幫浦： Waters 2695 Separations Module (2) 自動注入器：Autosampler 717+
(3) 檢測器：Waters 996 Photodiode Array Detector (4) 分析軟體：Waters Empower software
(5) 層 析 柱 ： MERCK 公 司 LiChroCART®250-4 HPLC-Cartridge Lichrospher 100 RP-18 (5μm)。前端加上管柱(MERCK 公司 LiChroCART®4-4 Lichrospher 100 RP-18 (5μm)，以濾除雜質。
2. 烘箱
採用德國 Memmert 製造 Class M 型 OVEN (三) 試驗方法
1. 標準品之製備
分別稱取 glycyrrhizin 之標準品 10 mg，分別溶於 10 ml 甲醇 中，以 0.45 µm (Nalgene®，New York，USA)濾膜過濾，為含量 1 mg/ml 之母液，供 HPLC 偵測 glycyrrhizin 含量之用。
2. 檢品之製備
材料經烘箱乾燥後，各稱取 2 g 研碎，以 50 ml 甲醇經超音波 震盪萃取 60 分鐘，收集濾液，重複萃取且浸泡隔夜，合併濾液，再 以減壓濃縮方式將濾液濃縮至乾，再以 10 ml 甲醇溶出，並以 0.45 mm 濾膜過濾，供 HPLC 偵測 glycyrrhizin 含量之用。
3. 高效液相層析法 (1) 分析條件
依 2001 年經繐之『甘草之生物藥學研究』所使用之方法，在室 溫下以 acetonitrile：水（含 1﹪acetic acid）= 36：64 為流動相，流速 為 1 ml/min，檢測波長為 254 nm。
(2) 標準曲線之繪製
取 glycyrrhizin 之標準品，以濃度 10 mg/ml 作為稀釋母液，再 分別稀釋成母液的 1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 及 1/64 倍等 7 個濃 度之標準品溶液，各以 0.45 µm 之微孔膜過濾，濾液用 Autosampler 每次自動定量注射 20 µl 注入 HPLC 分析，每個濃度處理重複 3 注 射，將 3 次總和平均。以濃度及積分面積各為橫座標和縱座標，利用 線性迴歸分析獲得方程式，製成標準檢量線（Fig. 8-9）。其迴歸方程 式如下：
Y=（1.407745e+007）X +（-3.781059e+006）；R^2 = 0.997661 利用此迴歸方程式，以波峰面積求出檢品 glycyrrhizin 之含量。
(3) 檢品之測定：
將上述各種不同甘草的檢品，以前述檢品的製備方法與分析條 件，每次自動定量注射 20 µl 注入 HPLC 分析，並用內標準法計算 glycyrrhizin 之含量。