一、實驗動物
雄性之 Wistar 系大鼠，約 250-350 g，飼養於 12 小時黑暗，12 小時白晝之飼養室中，溫度控制於 21-23℃，飼料及水供動物自由取 食。實驗動物購自臺灣大學實驗動物中心。
二、髓鞘內插管之手術方法
本手術方法依本研究室所用之髓鞘內插管手術法，將重 250-350 g 之 Wistar 鼠先以 pentobarbital 50 mg/kg 腹腔注射麻醉。從枕骨與 第一頸椎處，剪開肌肉層,並輕挑硬脊膜，將 PE-5 細管置入脊髓腔 內 8 cm，使尖端大約位在脊椎腰椎膨大處 1umbar enlargement。細 管尾端套上 silicon tube 經皮下在白鼠耳間部位拉出並固定。等待 3-4 天的恢復期，我們從 silicon tube 以 30 μl 2% xylocaine 測試細管 功能，注射後大鼠兩後腳麻痺，但於 8-10 分鐘左右恢復正常者視為 插管成功；實驗約在一星期左右進行，並在死後解剖以確定位置。只 有細管功能正常及位置正確的老鼠才列入實驗。手術後大鼠的飼養，
必須各飼養籠只飼養一隻大鼠，否則大鼠會因互相搔抓，或互相舔咬 大鼠身體上異物，使大鼠後頸部皮膚露出之 PE-5 管，因而破壞；個 別飼養時，大鼠之前肢並不會抓到後頸部，故毋須擔心露出之 PE-5 管被破壞。
三、L-NAME 的製備
L-Nω-nitro-arginine methyl ester（L-NAME）（Merk ＃N5751）
為 NMDA 受體之拮抗劑，分子量 268，將一瓶（250 mg）溶於 3c.c. 0.9%
生理食鹽水中，則 1 c.c.含 300 nmole 之 L-NAME，所以 10μl 含 3000 nmole；再將此溶液 3.3μl 加 6.7μl 生理食鹽水稀釋則每 10μl 含 1000
nmole 之 L-NAME；若將 1μl 此溶液加 9μl 生理食鹽水稀釋則每 10 μl 含 300 nmole 之 L-NAME。先將上述不同濃度 L-NAME 製備後冷 凍備用。
四、電針刺激
1. 大白鼠先置入流通有 1% Halothane 的方形透明容器，待其昏迷 後置入特製之大白鼠固定器，兩後肢及尾部自然露出容器外，固 定器接上麻醉機，繼續以 1% Halothane 進行麻醉。
2. 大白鼠後肢小腿外側剃毛。
3. 將一支不繡鋼 36 號針（直徑約 0.2 mm）插入後小腿脛骨粗隆及 腓骨頭中間之脛骨前肌處相當於足三里穴位（膝關節下 5 mm，
脛骨旁開 2 mm）， 針入 5 mm，另一支針插入穴位正下方 5 mm 處。
4. 連接鋼針及 CCU 導線於電針機（611 STIMULATER），打開電 源，調整電波為單向波(monophasic)波寬為 5 msec.，刺激頻率為 4 Hz，電流強度漸增至出現局部肌肉顫動(大約 0.5 mV)，定義此 電流強度為基本強度(baseline intensity)。在不影響大白鼠麻醉深 度的情形下，逐漸調高刺激強度至實驗之要求 (10 倍及 20 倍的 基本強度，本研究分別為 5 mV 及 10 mV)，電針時間為 20 分鐘。
五、固定液之灌流程序
Pentobarbital 以 100 mg/kg 之量腹腔注射麻醉，陷入昏迷狀態 後，仰臥姿態下使用大剪從腹部剪開，露出胸骨下端之劍突軟骨，
用大止血鉗來固定，沿著胸骨兩側向腋窩方向剪開至看得到心臟為 止。再用小剪將覆蓋於心臟上的胸腺從中間剪開，便可看到主上升 動脈。先起動 pump 確定輸液有進入後，保持輸液流動狀態，將 18
＃鈍面注射針從左心室插入至主動脈內 0.5 cm，而後用中止血鉗夾 住左心室心肌和針，以便固定針頭在 aorta 內，再將右心房剪個洞
以便構成一個循環。開胸後鼠心很快產生心室震顫，血循停止，灌 流必須在二、三分鐘內完成，否則易形成小血管的血栓及微血管滯 留。先以 0.9% 的生理食鹽水 500 ml 完成血液沖洗，再將 pump 管 路轉換至 3.8% paraformaldehyde（溶劑配製法如表三）以 500 ml/
半小時的速度灌流完成固定。期間血液沖洗完全的鼠肝呈淺土黃 色，開始以 paraformaldehyde 灌流時可以看到四肢抽搐，手舞足蹈 (fasciculation)的現象，灌流完全的鼠肝質地堅硬，四肢及鼠尾僵硬 完全沒有彈性，右心房流出的液體清澈不帶血色。
六、取出大白鼠脊髓之手術
將大鼠腹部朝下，用圓頭解剖刀沿著背部脊柱中間將皮膚劃 開，再將脊柱兩旁肌肉劃開，而後用中骨剪將脊柱邊的肉處理乾 淨，而露出 T10-L6 的橫突（transverse process）。先從 L6 起，將兩 側脊突（spinousprocess），橫突和椎間關節（ pars interarticularis）
部份剪斷，再用小骨剪小心剪開 lamina，將覆蓋在 spinal cord 上 方的 lamina 及兩旁的 pedicle 剪斷，並保留脊髓硬膜（dura matter）
之完整。待全部的脊椎完全打開後再剪開硬膜，取出馬尾（spinal cord cauda equina）部份用平頭小剪夾住上翻，脊神經 （spinal nerves）及 T10 之脊柱處（T10 spinal cord）用小尖剪剪斷，用小尖 刀在其腹部（實驗側的對側）劃一道淺溝做記號以便辨認左右。所 取出之脊柱置於 3.8% paraformaldehyde 中約 4 小時，而後置於 30%
sucrose（溶劑配製法如表四）中脫水一夜。
準備器械：1.中小骨剪各一支
2.圓頭解剖刀及尖頭小解剖刀各一支 3.小尖剪一支
4.平頭小鑷一支 5.30% sucrose 50 ml
6. 3.8% paraformaldehyde 50 ml
表三：3.8% Paraformaldehyde in PBS 溶劑配製法
ID-H2O 2000 ml 1000 ml
NaH 2OPO4．H2O 6.35 g 3.18 g
Na2HPO4 22.72 g 11.36 g
Paraformaldehyde 80.00 g 40.00 g
NaCl 18.00 g 9.00 g
※ 注意事項：1.pH 需調整為 7.3-7.4 之間
2.泡好之溶液以深棕色廣口玻璃瓶裝，以貼紙做好 標示日期冷藏之
表四：30% Surcose in PBS 溶劑配製法
ID-H2O 100 ml
NaH 2OPO4．H2O 0.318 g
Na2HPO4 1.136 g
NaCl 0.9 g
Surcose 30 g
七、免疫組織染色操作法
（一）冷凍切片：-20℃， 4 μm
（二）洗淨
（三）消除內源性過氧化氫酵素
（四）洗淨
（五）前阻斷反應
（六）初級抗體反應－1：600 rabbit anti-c-fos polyclonal antibody
（七）洗淨
（八）次級抗體反應－1：200 biotinylated goat anti-rabbit IgG
（九）洗淨
（十）聚合反應－1：50 ABC polymerization
（十一）洗淨
（十二）呈色反應－0.1% DAB＋0.01﹪H2O2＋0.2﹪nickel reaction
（十三）洗淨
（十四）展片－0.4﹪gelatin＋alcohol
9. 冷媒(Frozen specimen embedding medium, CryomatrixT M, Shandon)
步驟：(使用前)
2. shaking
1. rabbit anti-c-fos polyclonal antibody（1：600）
1. goat anti-rabbit IgG（1：200）
2. NGS
1. elite ABC complex (1:50，Vectastain) 2. W.B.
2. 0.01% H2O2 2. alcohol 50%、75%、95%、100%
3. xylene I mounting medium 之溶劑流失
表六：0.1M PBS 溶劑配製法
※注意事項：l.pH 需調整為 7.3-7.4 之間
2.泡好之溶液以透明玻璃瓶裝，以貼紙做好標示不必冷 藏
表七：Wash Buffer 溶劑配製法
Triton-100 10 ml 20 ml
PBS 490 ml 980 ml
Total 500 ml 1000 ml
表八：Nickel（50 mg/ml）溶劑配製法
Nickel 1250 mg 2500 mg 3750 mg 5000 mg
Tris 25 ml 50 ml 75 ml 100 ml
25 ml 50 ml 75 ml 100 ml
※注意事項：1.pH 需調整為 7.3-7.4 之間
2.泡好之溶液以透明玻璃瓶裝，以貼紙做好標示日期冷 藏之
表九：Tris Buffer 溶劑配製法
Tris Buffer 80 ml 160 ml 240 ml 360 ml 400 ml
Tris 0.04 g 0.08 g 0.12 g 0.16 g 0.2 g
80 ml 160 ml 240 ml 360 ml 400 ml
※注意事項：1.pH 需調整為 7.3-7.4 之間
2.泡好之溶液以透明玻璃瓶裝，以貼紙做好標示日期冷 藏之
八、型態分析 （一）選定皮節
在低倍之 dark field 背景下審視脊髓切片，根據其白質及灰質之
比例，及前角之形狀，可以將各皮節區之特定形態篩檢出來，挑選出 L1、L2、L3、L4、L5 之片子，其中 L3 有如尖頭鞋，L4 有如鈍頭馬 靴（如圖五）148。然後記錄該切片在顯微鏡載物台上之座標，供日後 篩選。
圖五：大白鼠脊髓皮節的區分圖
（二）劃分層區
在 10×10×1.25 倍之 dark field 下，選定該皮節之背角區，在 Camera Lucida 下將背角之輪廓劃出，其中可以明顯劃出 Reticular part 之外 型。取其上緣及下緣各做出一條平行線，便可訂出 Deep layer（D）
之邊界；Superficial layer（S）和 Nucleus propius (NP) 的界限，由瀰 漫於 NP 中的微細縱向神經束來區分；一般而言，S 約佔 1/3 而 NP 約佔 2/3 的比例（如圖六）148。
圖六：大白鼠脊髓背角的分層圖
九、研究設計與實驗流程
（一）不同劑量的一氧化氮合成酵素抑制劑（L-NAME）對福馬林測 試誘發之 c-fos 表現以及疼痛行為反應
實驗共分四組，動物依隨機方式在福馬林測試前 30 分鐘經細管 給予 1. 0.9% 生理食鹽水 10 μl (n=6)。2. 300 nM L-NAME /0.9% 生 理食鹽水 10 μl (n=6)。3. 1000 nM L-NAME/0.9% 生理食鹽水 10 μl (n=6)。4. 3000 nM L-NAME/ 0.9% 生理食鹽水 10 μl (n=6) 。 給藥之後，再經由細管內以 10 μ1 生理食鹽水灌沖。
福馬林疼痛測試以 26 號針頭在老鼠左後腳掌皮下注射 50 μ1 5% 福馬林開始，隨即將老鼠置入 30x30x30 cm 的鐵籠內，並在外下 方 45 度角置一鏡面，以方便從所有的角度觀察動物行為。我們利用 自己設計之程式記錄並觀察老鼠的疼痛加權分數 (weighted pain score)。疼痛加權分數的評估 117為所有動物表現在不同疼痛行為的時 間乘上加權計分之總和的平均。疼痛行為的加權計分分別為：0，注 射腳沒有表現任何疼痛行為。1， 注射腳輕輕著地，幾乎沒有負荷體 重。2，注射腳抬高，沒有任何面與地面接觸。 3，老鼠舔、咬注射
腳或注射腳顫動。在注射後的 1 小時期間，用電腦程式計算老鼠表現 之各種疼痛行為的時間乘上加權計分，並以每 5 分鐘為單位平均。
觀察者並不知道動物的給藥以及分組。
福馬林疼痛測試結束之後，老鼠立即給予大量 pentobabital (100 mg/kg) 腹腔注射麻醉，剪開胸骨，經心臟灌流食鹽水沖血，並以 3.8%
paraformaldehyde 固化。取出脊髓腰椎膨大部位後固定，並以 30%
surcose 隔夜脫水並冷藏保護。4 μm 冷凍切片以 phosphate buffer 收 集。在洗淨及阻斷反應後給予稀釋成 1：600 之兔多株 anti-c-fos 抗 血清 20 分鐘，接著是對抗兔血清之 biotin 化羊 IgG 1 小時，然後 是標準的 avidin-biotin-complex 之聚合反應 (ABC polymerization ) 1 小時。呈色後切片置放在 gelatin 塗抹之載玻片上脫水，風乾，蓋上 蓋玻片供顯微鏡觀察。我們檢查第四腰椎脊髓背角各層區 laminae 有 Fos 標記的神經細胞分佈。在暗視野下，我們進一步將脊髓背角 分為三個區域 ：1.表淺層 Superficial laminae (laminae I/II)；2.中間層 Nucleus propius (laminae III/IV)；3.深層 Deep laminae (laminae V)。 我 們計算各分層內顏色較深之 Fos 標記的神經細胞數量。每個數據至 少計算十片切片，取其中前三最高值作為平均。
（二）不同強度電針對福馬林測試誘發之 c-fos 表現以及疼痛行為反 應
實驗共分五組，動物依隨機方式在福馬林測試前 30 分鐘 1.經細 管給予 0.9% 生理食鹽水 20 μl (n=6)。2.十倍強度電針刺激於左側 足三里 20 分鐘。3.十倍強度電針刺激於右側足三里 20 分鐘。4.二十 倍強度電針刺激於左側足三里 20 分鐘。5. 二十倍強度電針刺激於右 側足三里 20 分鐘。其餘福馬林疼痛測試與 Fos 蛋白的計算方法同
（一）。
（三）不同強度電針刺激與 L-NAME 結合的鎮痛研究
實驗共分五組，動物依隨機方式在福馬林測試前 30 分鐘經細管 給予 1. 0.9% 生理食鹽水 10 μl (n=6)。2. 1000 nM L-NAME /0.9%
生理食鹽水 10 μl 加十倍強度電針刺激於左側足三里 20 分鐘 (n=6)。3. 300 nM L-NAME/0.9% 生理食鹽水 10 μl 加十倍強度電針 刺激於左側足三里 20 分鐘 (n=6)。4. 1000 nM L-NAME/ 0.9% 生理食 鹽水 10 μl 加二十倍強度電針刺激於左側足三里 20 分鐘 (n=6)。5.
300 nM L-NAME/0.9% 生理食鹽水 10 μl 加二十倍強度電針刺激於 左側足三里 20 分鐘。其餘步驟同（一）。
（四）10 L 電針與 L-NAME 結合的鎮痛研究
將生理食鹽水對照組、十倍強度電針刺激於左側足三里組、300 nM L-NAME 加十倍電針組、1000 nM L-NAME 加十倍電針組等四組 一起比較福馬林疼痛測試與 Fos 蛋白的表現。
（五）20 L 電針與 L-NAME 結合的鎮痛研究
（五）20 L 電針與 L-NAME 結合的鎮痛研究