電針刺激與一氧化氮合成酵素抑制劑結合的鎮痛研究-以福馬林疼痛測試與Fos蛋白測量之大白鼠模式; THE STUDY OF ELECTROACUPUNCTURE AND NOS INHIBITOR ON ANALGESIA -BY THE MODE OF FORMALIN STIMULATION AND MEASUREMENT OF FOS PROTEIN IN WISTAR RATS

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(1)中國醫藥學院中國醫學研究所. 指導教授：林昭庚. 博士論文. 教授（Jaung-Geng Lin）. 共同指導教授：孫維仁副教授（Wei-Zen Sun）. 論. 文. 題. 目. 電針刺激與一氧化氮合成酵素抑制劑結合的鎮痛研究－以福馬林疼痛測試與 Fos 蛋白測量之大白鼠模式 THE STUDY OF ELECTROACUPUNCTURE AND NOS INHIBITOR ON ANALGESIA -BY THE MODE OF FORMALIN STIMULATION AND MEASUREMENT OF FOS PROTEIN IN WISTAR RATS. 研究生：曹永昌（ Yun-Tson Tsao）. 中華民國九十二年七月三日.

(2) 目. 錄. 第一章前言… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 第二章文獻探討… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 一、痛覺… … ..… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 二、痛覺之傳導及神經調制… … … ..… … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 A. 損傷性刺激引起傷害性感受器興奮… … … … … … … … … … .… … … … … 3 B. Aδ和 C 傷害性感受器分別傳導剌痛和灼痛… … .… … … … … .… … … … 4 C. 激活傷害性感受器的致痛物質… … … … … … … … … … … … … … … .… … 5 D. 脊髓背角是痛覺的初級中樞..… … … … … … … … … … … … … .… … … … ..7 E. P 物質和興奮性氨基酸介導傷害性初級傳入向背角的傳遞… … … … ..9 三、針刺鎮痛… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 10 A. 針刺鎮痛有關之神經傳導… … … … … … … … … … … … … … … … … … 10 B. 針剌鎮痛與鴉片樣物質之關係… … … … … … … … … … … … … … … … 10 C. 針剌耐受與抗鴉片樣物質之關係… … … … … … … … … … … … … … … 11 D. 針剌鎮痛與單胺類物質之關係… … … … … … … … … … … … … … … … 11 E. 不同頻率電針鎮痛之研究… … … … … … … … … … … … … … … … … … 12 四、疼痛的分子生物學研究… … … … … … … … ..… … … … … ..… … … … … … 14 A. 初級訊息傳遞者一疼痛訊號的產生和製造… … … … … … … … … … … 15 B. 次級訊息傳遞者一疼痛訊號的放大… … … … … … … … … … … … … ..… 17 C. 三級訊息傳遞者一訊號的維持與執行… … … … … … … … … … … … … ..21 五、過敏性疼痛的評估與實驗方法… … … … … ..… … … … … … … … … … … … 26 A. Fos 蛋白質在疼痛訊號傳遞過程中扮演的角色… … … … … … … … … … 26 B. Fos 作為疼痛指標的限制… … … … … ..… … … … … … … … … .… … … … .27 C. 從 Fos 到過敏性疼痛的發生… … … … … ..… … … … … … .… … … … … … 29 六、以福馬林皮下注射作為過敏性疼痛的研究模式… … … … ..… … … … … … 30 七、足三里穴的解剖位置及功用… … … … … … … … … … … ..… … … … … … … 32 八、動物實驗之髓鞘內給藥法… … … … … … … … … … … … ..… … … … … … … 33. i.

(3) 第三章材料與方法… … … … … … … … … … … … … … … ..… … … … … … .… … … 36 一、實驗動物… … … … … … … … … … … … … … … .… … … … … … … … .… … … 36 二、髓鞘內插管之手術方法… … … … … … … … ..… … … … .… ..… … … .… … 36 三、L-NAME 的製備… … … … … … … … … … … … … … … .… … … … … .… … … 36 四、電針刺激… … … … … … … … … … … … … … … … .… … … … … … .… … … … 37 五、固定液之灌流程序… … … … … … … … … … … … … … … … … .… … … … 38 六、取出大白鼠脊髓之手術… … … … … … … … … … … … … … … .… … … … 38 七、免疫組織染色操作法… … … … … … … … … … … … … … … … .… … … … 39 八、型態分析… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .… … … … 43 九、研究設計與實驗流程… … … … … … … … … … … … … … … … .… … … … 45 十、統計分析… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .… … … … 47 第四章結果… … … … … … … … … … … … … … … … … ..… … … … … .… … … … 49 一、對照組在第一至第五腰椎左、右兩側背角的 Fos 神經細胞數… .… ..49 二、不同劑量的 L-NAME 之 c- fos 表現以及疼痛行為反應… .… .… … … … 49 三、不同強度電針之 c- fos 表現以及疼痛行為反應… … .… .… … … … ..… … 50 四、不同強度電針刺激與 L-NAME 結合的鎮痛研究… … .… … … ..… … … … 51 五、10 L 電針與 L-NAME 結合的鎮痛研究… … .… … ..… … … … … … … 52 六、20 L 電針與 L-NAME 結合的鎮痛研究… … … … .… .… … .… … … … 53 七、不同劑量的 L-NAME 及不同強度電針之 c-fos 表現以及疼痛反應… ..54 八、左側電針組在第一至第五腰椎左側背角的 Fos 神經細胞數… .… … ..54 第五章討論… … … … … … … … … … … … … … … … … ..… … … … … … … … … 75 第六章結論… … … … … … … … … … … … … … … … … … .… … … … .… … … … 85 參考文獻… … … … … … … … … … … … … … … … … ..… … … … ..… … .… … … … 87 英文摘要… … … … … … … … … … … … … … … … … .. … … . .… … … … .… … 100 誌謝… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...… … … … … … … .102. ii.

(4) 圖. 目. 錄. 圖一、脊髓腰段背角 Rexed 分層及傳入示意圖… … … … … … … … … … 9 圖二、NMDA Receptor 圖… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .17 圖三、細胞核內 c- fos 相關疼痛訊號傳遞過程圖… … … … … … … … … … … ..22 圖四、插管平台及作業情形圖… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 35 圖五、大白鼠脊髓皮節的區分圖… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .44 圖六、大白鼠脊髓背角的分層圖… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .45 圖七、生理食鹽水對照組 L1-L5 左側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … … … 56 圖八、生理食鹽水對照組 L1-L5 右側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … … … 57 圖九、L-NAME 各組相對於對照組背角各區 Fos 神經細胞數百分比… … … … 58 圖十、 L-NAME 各組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … … … … … … … … … 59 圖十一、L- NAME 各組福馬林注射後之注射腳顫動次數… … … … … … … … 60 圖十二、 L-NAME 各組福馬林注射後大鼠之舔腳秒數… … … … … … … … … … 60 圖十三、電針各組相對於對照組背角各區 Fos 神經細胞數百分比… … … … … 61 圖十四、電針各組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … … … … … … … … … … 62 圖十五、電針各組福馬林注射後之注射腳顫動次數… … … … … … … … … … … 63 圖十六、電針各組福馬林注射後大鼠之舔腳秒數… … … … … … … … … … … … 63 圖十七、電針與 L-NAME 結合相對於對照組背角各區 Fos 神經細胞百分比.64 圖十八、電針與 L-NAME 結合各組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … … 65 圖十九、電針與 L-NAME 結合各組福馬林注射後之注射腳顫動次數… … … 66 圖二十、電針與 L-NAME 結合各組福馬林注射後大鼠之舔腳秒數… … … … 66 圖二十一、10 L 電針加 L-NAME 相對於對照組背角各區 Fos 神經細胞百分比 67 圖二十二、10 L 電針與 L-NAME 結合各組福馬林注射後之疼痛加權分數… … 68 圖二十三、20 L 電針與 L-NAME 相對於對照組背角各區 Fos 神經細胞百分比 69 圖二十四、20 L 電針與 L-NAME 結合各組福馬林注射後之疼痛加權分數… … 70 圖二十五、各實驗組相對於對照組背角各區 Fos 神經細胞數百分比… … … … 71 圖二十六、各實驗組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … … … … … … … … … 72 圖二十七、左側十倍電針組 L1-L5 左側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … … 73 圖二十八、左側二十倍電針組 L1-L5 左側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … 74. iii.

(5) 表. 目. 錄. 表一、傷害性感受器的分類及特性表… … … … … … … … … … … … … … … … … .4 表二、外周損傷部位釋放的致痛物質及作用表… … … … … … … … … … … … … … .7 表三、3.8% Paraformaldehyde in PBS 溶劑配製法… … … … … … … … … … … ...39 表四、30﹪Surcose 溶劑配製法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 39 表五、免疫組織染色操作詳細步驟表… … … … … … … … … … … … … … … … … 40 表六、0.1 M PBS 溶劑配製法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 42 表七、Wash Buffer 溶劑配製法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 43 表八、Nickel（50 mg/ml）溶劑配製法… … … … … … … … … … … … … … … … … .43 表九、Tris Buffer 溶劑配製法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .43 表十、生理食鹽水對照組 L1- L5 左側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … … 56 表十一、生理食鹽水對照組 L1-L5 右側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … … 57 表十二、L-NAME 各組及對照組背角各區 Fos 神經細胞數及百分比… … … … 58 表十三、L-NAME 各組及對照組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … … … … 59 表十四、電針各組及對照組背角各區 Fos 神經細胞數及百分比… … … … … … 61 表十五、電針各組及對照組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … … … … … … 62 表十六、電針與 L-NAME 結合及對照組背角各區 Fos 神經細胞數及百分比 64 表十七、電針與 L-NAME 結合及對照組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … 65 表十八、10 L 電針與 L-NAME 及對照組背角各區 Fos 神經細胞數及百分比… 67 表十九、10 L 電針與 L-NAME 及對照組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … 68 表二十、20 L 電針與 L-NAME 及對照組背角各區 Fos 神經細胞數及百分比… 69 表二十一、20 L 電針與 L-NAME 及對照組福馬林注射後之疼痛加權分數… … 70 表二十二、各實驗組及對照組 L4 背角各區 Fos 神經細胞數百分比… … … … … 71 表二十三、各實驗組及對照組福馬林注射後之疼痛加權分數… … … … … … … 72 表二十四、左側十倍電針組 L1-L5 左側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … … 73 表二十五、左側二十倍電針組 L1-L5 左側背角 Fos 神經細胞數比較… … … … 74. iv.

(6) 電針刺激與一氧化氮合成酵素抑制劑結合的鎮痛研究－以福馬林疼痛測試與 Fos 蛋白測量之大白鼠模式中國醫藥學院中國醫學研究所研究生：曹永昌指導教授：林昭庚. 摘要疼痛是每個人必定都有的經驗，各種疼痛無時不在困擾著人類，雖然多年來許多學者從臨床和基礎等各種不同的角度對痛和鎮痛的問題進行研究，不斷地研究出新的止痛藥物及止痛方法。然而在中國數千年的傳統醫學裡，針灸一直是獨具一格地延用至今，連世界衛生組織也廣泛承認其療效，並不遺餘力地推廣其臨床應用。我們經過了針灸安全性、舒適性及甩尾鎮痛等一系列的研究後，確定電針在良好的參數控制下是一項安全又可靠的治療工具，而其療效評估更是能否在鎮痛領域中獨顯風騷的關鍵；因此我們設計一系列電針刺激與一氧化氮合成酵素抑制劑（L-NAME）脊髓給藥之鎮痛研究。全身性給予 NOS 抑制劑（L-NAME）包括了周邊消炎以及中樞神經的效果，因此必須從脊髓腔給予藥物才能排除 NOS 抑制劑的周邊消炎作用，並進一步了解周邊刺激之後，脊髓內的被活化的 NO 對於神經活動以及相關的疼痛行為的影響。結果顯示：（一）L-NAME 脊髓注射（300、1000、3000 nM）不僅可以降低早期及晚期階段福馬林疼痛反應，亦呈現以劑量依賴的方式降低福馬林刺激後脊髓 Fos 標記神經細胞的總量；而電針足三里穴（10R、10L、20R、20L）亦能有效降低早、晚期福馬林疼痛反應，對於降低福馬林刺激後脊髓 Fos 標記神經細胞總量的表現亦佳。（二）結合電針刺激與脊髓腔注射. v.

(7) NOS 抑制劑（L-NAME 300、1000 nM 加同側電針刺激足三里穴 10L、 20L）均可以降低早期及晚期階段福馬林疼痛反應。對福馬林皮下注射有良好的止痛效果，就分子生物領域 Fos 蛋白質的表現也取得全面的抑制效果。（三）比較（10L、10L300、10L1000）和（20L、20L300、 20L1000）兩種治療模式，L-NAME (300、1000 nM)部分有劑量依賴上之趨勢，而電針部分（10L、20L）則無此傾向；而且增加 L-NAME 脊髓注射的效果優於單純電針。在 Fos 蛋白部分，電針強度增強（10L →20L）並不會增加第四腰椎（L4）的 Fos 量，反而有減少之趨勢，因此若以 Fos 為疼痛之指標，則較強的電針刺激亦能夠較有效的抑制福馬林疼痛刺激所引發的 Fos 量。本研究證實了結合電針刺激與脊髓腔注射 NOS 抑制劑對福馬林刺激所引起的頑固性疼痛上取得了良好的鎮痛成效，不僅可以抑制第二階段的週邊發炎性疼痛反應，對第一階段的中樞反射性疼痛亦可以達到良好的鎮痛效果，就分子生物領域 Fos 蛋白質的表現也取得全面的抑制效果；而（20L、20L300、20L1000）這一部份不論是在疼痛行為反應或是 Fos 蛋白的表現上抑制的趨勢均較（10L、10L300、 10L1000）一致，因此在疼痛控制上（20L、20L300、20L1000）這樣的模式會是較好的選擇，可作為臨床止痛的指引。傷害性刺激誘導的中樞內 c-fos 基因的蛋白表達可被一些鎮痛物質如嗎啡、內源性阿片? 、5-HT、生長抑素、NMDA 受體的拮抗劑及電針針剌等所抑制，提示 c-fos 不僅是一個"標誌物"，而且也參與了疼痛的調制。而這些疼痛分子訊息的傳遞，造成了臨床上包括疼痛過敏、觸物感痛以及疼痛時間延長等慢性疼痛的主要症狀（如手術後疼痛及幻肢痛等），也可以藉由本研究為其臨床止痛開啟一道曙光。. 關鍵詞：電針，L-NAME，Fos，鎮痛. vi.

(8) 第一章. 前言. 疼痛是每一個人必定都有的經驗，不論是外傷、手術後等外科問題，或是內科各種器官的疼痛，甚至是癌症末期的 cancer pain 等，無時不在困擾著人類，雖然"疼痛"不是一種愉快的經驗，但卻是保護我們健康的一種警訊，它包含了許多複雜的生理、心理反應，因此多年來許多學者從臨床和基礎等各種不同的角度對痛和鎮痛的問題進行研究，不斷地研究出新的止痛藥物及止痛方法。然而在中國數千年的傳統醫學裡，針灸一直是獨具一格地延用至今，連世界衛生組織也不得不承認針灸的療效，其適應症更從早先（1980）的四十三種擴增至現今（1996）六十三種之多，其中不乏許多痛症的問題；因此，近二十年來，大量的針刺鎮痛及針刺麻醉研究持續的進行著，而隨著疼痛機轉的不斷瞭解，針刺鎮痛的模式更亟需建立，裨能推廣針灸在臨床上的應用，造福更多的病人。動物疼痛刺激從初級傳入神經去極化開始，透過介質的釋出在突觸間傳送，並藉助擴散性介質採自由擴散的方式，將訊號送達中樞神經系統之神經元。若進一步欲進入細胞核內，必須經過細胞之三級制訊號傳遞系統。持續而強烈的疼痛刺激(特別是 C 型纖維興奮)，釋放多種興奮性介質（如 P 物質，降鈣素基因相關? ，谷氨酸）--初級疼痛訊號傳遞者，開啟脊髓背角 NMDA 受器，湧入大量鈣離子並誘導 PKC 活化，它不僅啟動許多本來沈息中的細胞質內酵素，製造一氧化氮和前列腺素等擴散性介質--次級訊息傳遞，去影響鄰近的神經元，提供興奮性修飾造成疼痛受區擴大；這些疼痛訊息更可經由一連串的調節因子，進入細胞核內誘導 c-fos 細胞致癌基因，轉錄為所屬的 Fos 蛋白。Fos 蛋白和另一種早已存在的 Jun 蛋白結合，形成 AP-l-like 的物質。AP-1 在功能上是屬於誘發型轉錄因子，作用在 DNA 的特定區域(AP-1site)， AP-1 site 是啟動一些常用基因的必備基因 (promoter gene)，平常處於靜止狀態，一旦和 AP-1 結合後，可以很輕 1.

(9) 易地啟動轉錄後繼基因(如 pro-enkephalin,pro-dynophin gene)。因此在疼痛訊號傳遞過程中，Fos 蛋白和其他同類型的早發性迅速基因，一起被稱為--三級訊息傳遞者。這三級制訊號傳遞系統各有不同的角色，其中初級訊息傳遞者負責訊號的產生，次級訊息傳遞者誘導訊號放大，三級訊息傳遞者完成訊號的維持與執行，進而造成神經細胞群屬性長時間的改變。這些疼痛分子訊息傳遞，造成了臨床上包括疼痛過敏、觸物感痛以及疼痛時間延長等臨床上慢性疼痛的主要症狀。臨床上，包括手術後疼痛(post operative pain)、幻肢痛(phantom pain)等。本研究使用化學性的福馬林疼痛試驗，再透過不同形式的電針及脊髓腔給予一氧化氮合成酵素抑制劑（L-NAME）等的鎮痛方式與以抑制，並以 Fos 蛋白和疼痛行為反應作為評估工具，希望藉由早期福馬林疼痛反應了解電針及 L-NAME 對中樞神經的影響，及晚期福馬林疼痛反應了解電針及 L-NAME 對周邊鎮痛的影響外，並評估不同強度電針刺激及左右兩側之電針對腰椎各脊髓 Fos 蛋白和疼痛行為反應的影響，除了證實針刺的鎮痛作用及了解針刺鎮痛的機轉外，並試圖尋找最好的臨床鎮痛模式，作為治療頑固敏感性疼痛的參考。. 2.

(10) 第二章文獻探討一、. 痛覺. 疼痛是人類共有而個體差異很大的一種不愉快的主觀感覺。它提供軀體受到威脅的警報信號，是生命不可缺少的一種特殊保護功能。另一方面，嚴重的慢性疼痛困擾著數以百萬計的人們，是臨床一大難題。傷害性刺激誘發的痛覺，是包括性質，強度和對程度各不相同的令人討厭的多種感覺的複合，並往往與自主神經活動、運動反應，心理和情緒反應交織在一起，它不是簡單地與軀體某一部分的變化有關，也不是由神經系統某個單一的傳導束、神經核和神經遞質進行傳遞，疼痛很易受過去經驗的影響，有極大的變異性，所以它比其他感覺更難研究。傷害性感受(nociception)和痛覺(pain)是兩個有密切關係但又不相同的概念。前者是指中樞神經系統對傷害性感受器激活而引起的傳入信息的加工和反應，以提供組織損傷的信息，它可以發生在中樞神經系統的各個水平，從低等動物到人均共有。痛覺是指發生在軀體某一部分的厭惡和不愉快的感覺，發生在腦的高級部位尤其是大腦皮層，是人所特有的。1 所以，疼痛是一種主觀的、複雜的感覺傳導，國際疼痛協會對人類疼痛的定義為：「不愉快的感覺及情緒的變化伴隨著實際上或潛在的組織傷害」。然而，動物並不能主觀地描述其痛覺之感受，因此必須藉觀察生理上或行為上的變化來表示。二、痛覺之傳導及神經調制 A.損傷性刺激引起傷害性感受器興奮背根神經節和三叉神經節中感受和傳遞傷害性衝動的初級感覺神經元的外周末梢部分，稱為傷害性感受器。形態學上是無特化的游離神經末梢，廣泛分佈於皮膚、肌肉、關節和內臟器官。不同組織中 3.

(11) 的傷害性感受器在結構上沒有明顯不同，但反應特性迥異，如皮膚機械傷害性感受器僅對強烈的機械刺激發生反應，而多覺傷害性感受器則對多種不同性質的傷害性刺激均產生反應。傷害性感受器興奮產生的衝動傳入到中樞神經系統引起傷害性感受和痛覺。但是，由神經系統損傷引起的疼痛(如中樞性痛和去傳入痛過敏)，不依賴傷害性感受器的活動，而是神經系統可塑性變化的結果。 B. Aδ和 C 傷害性感受器分別傳導剌痛和灼痛傷害性信息由不同的初級傳入纖維傳導。根據傳入纖維的直徑，一般可將傷害性感受器分為兩大類：由細的有髓鞘 Aδ傳入纖維傳導的 "Aδ傷害性感受器"，和由無髓鞘傳入纖維傳導的 "C 傷害性感受器"(如表一)。根據對傷害性刺激反應的性質，兩類感受器又可分為不同的亞型，對高閾值機械刺激產生反應的 "Aδ機械傷害性感受器 "和對傷害性機械和熱刺激均產生反應的 "Aδ多覺傷害性感受器 "。動物的大多數 C 傷害性感受器屬於多覺性的，也有只對強機械刺激起反應的 "C 機械傷害性感受器"，而在人類皮膚只有 "C 多覺傷害性感受器"。這些感受器的共同特點是，重複性刺激使感受器敏感性增加，並引起 C 傷害性感受器產生持久的發放。. 表一：傷害性感受器的分類及特性表分佈. 傷害性感受器類型. 有效刺激. 皮膚. Aδ機械性. 機械損傷. Aδ多覺性. 機械性損傷和傷害性灼熱. C 機械性. 機械損傷. C 多覺性. 傷害性機械、熱．冷和化學刺激. III(Aδ)機械性. 傷害性擠壓. IV(C)機械性. 傷害性擠壓. 肌肉. 4.

(12) 表一：續. 關節內臟. IV(C)化學性. 有害化學物質. III 和 IV 多覺性. 重壓和傷害性熱. Aδ機械性. 極度扭轉. C 機械性. 極度扭轉. Aδ內臟傷害性. 依器官不同，對強烈的機械膨脹，. C 內臟傷害性. 牽拉、灼熱、有害化學剌激. 疼痛分為兩大類：定位明確的淺表痛是由強刺激皮膚引起的，定位模糊的深部痛源於肌肉、肌腱，骨膜和關節。來自內臟的疼痛具有深部痛的特徵。淺表痛又分為刺痛和灼痛，根據它們出現的先後，又叫做第 1 痛(快痛)和第 2 痛(慢痛)，分別由 Aδ和 C 傷害性感受器激活引起。在人體的 Aδ或 C 單纖維記錄的電生理實驗表明，一個感受器的單一衝動甚至低頻發放並不引起痛覺，只有同時激活許多 Aδ或 C 傷害性感受器才產生疼痛。比較心理物理方法測定的人體刺激感覺曲線和單個 C 多覺傷害性感受器的刺激-反應曲線的關係表明，感受器衝動低於 0.3 次/秒，沒有疼痛感覺，在 0.4 次/秒的衝動發放水平時到達痛閾，當感受器衝動達到 1.5 次/秒時，產生持久的疼痛。 C.激活傷害性感受器的致痛物質傷害性刺激引起初級傳入末梢去極化使感受器興奮，這是一個換能的過程。目前尚無可能在感受器水平直接研究感受器如何將刺激轉換成電能。Aδ傷害性感受器外周末梢被許旺氏細胞包圍，並無特化的細胞和結構，因此，傷害性感受器的末梢本身很可能具有機械敏感性。此外，傷害性刺激也可能通過作用於其他中繼細胞繼發性地激活傷害性感受器。從已有的資料看，換能機制不止一種，如 C 多覺傷害性感受器的機械刺激和熱刺激的反應閾之間並無關聯性。Aδ機械傷害性感受器對熱和化學刺激相對不敏感，但是當熱刺激引起感受器活動時，它們對機械刺激的敏感性並不變化。這些觀察說明在同一感受器上兩種刺激的換能機制是不同的。 5.

(13) 換能機制中最有吸引力的假說是傷害性感受器具有化學敏感性，大量的臨床觀察和實驗研究提供了有力的證據。傷害性刺激使受損傷的細胞釋放致痛的化學物質(如表二)，刺激傷害性感受器產生去極化。這些化學物質有三個來源：1.直接從損傷細胞中溢出的，如 K+、組織胺、ACh、5-HT 和 ATP 等。外源性施加這些物質可使傷害性感受器發放增加，注射到人體皮膚中可產生疼痛。2.由損傷細胞釋放物中的? 的作用下在局部合成的物質，或是通過血漿蛋白及白細胞遊走帶入到損傷區的物質。緩激? 是由損傷部位的? 降解血漿蛋白而形成的九? ，是一種最強的致痛物質。在損傷區特別是發炎的部分其濃度高達 8μmol/L 以上，事實上外源性施加 10μmol/L 就可引起疼痛。緩激? 不僅引起多覺傷害性感受器的激活，而且使其過敏，因此它在痛的產生和痛覺過敏中均起作用。在損傷區合成的另一類致痛物質是花生四烯酸的代謝產物，如前列腺素和白細胞三烯 (leukotrienes)，其濃度隨炎症發展而增加。前列腺素 E2 在這類化合物中致痛作用最強，使傷害性感受器敏感產生痛覺過敏。阿司匹林 (aspirin)和其他的非甾體抗炎藥物的鎮痛作用，就是由於抑制了環氧 ? (cyclooxy genase)使前列腺素合成減少所致。3.另一類致痛物質是由傷害性感受器本身釋放，如 P 物質。傷害性感受器的激活引起 P 物質從 C 纖維末梢釋放到組織液中，直接刺激肥大細胞釋放組織胺，後者作用於傷害性感受器進一步增強其活動。同時，P 物質和組織胺刺激血管舒張，產生局部水腫，在血管壁上含 P 物質的神經叢的激活也可產生同樣的效應。因此，一般認為皮膚損傷引起的神經性血管舒張和痛過敏是由於 P 物質和肥大細胞釋放組織胺激活傷害性感受器的結果。. 6.

(14) 表二：外周損傷部位釋放的致痛物質及作用表致痛物質. 釋放來源/合成. 對初級傳入未梢作用. K+. 損傷細胞. 激活. Ach. 損傷細胞. 激活. ATP. 損傷細胞. 激活. 5-HT. 血小板/色氨酸氫化. 激活. BK. 血漿激? 原/激? 釋放. 激活. histamine. 肥大細胞. 激活. PG. 花生四烯酸代謝物/環氧?. 降低閾值. Leukotrienes. 花生四烯酸代謝物/5-脂氧?. 降低閾值. SP. 初級傳入末梢. 降低閾值. 總結外周局部的致痛物質引起傷害性感受器的激活和敏感效應分為：1.直接作用--傷害性刺激使細胞損傷導致 K+的釋放和緩激? 、前列腺素的合成，K+和緩激? 直接興奮傷害性感受器的末梢，前列腺素增加末梢對 K+和緩激? 的敏感性；2.繼發作用--傷害性傳入衝動不僅傳入中樞，而且也在傳入纖維分叉處傳向另一末梢分支，在外周末梢引起 P 物質等化舉物質的釋放。P 物質直接引起血管舒張和組織水腫，進而增加緩激? 的累積。P 物質也刺激肥大細胞釋放組織胺和血小板釋放 5-HT，刺激感受器活動。另一方面，組織胺和 5-HT 在胞外水平的升高，繼發地激活鄰近的傷害性感受器，從而造成在傷害性刺激停止以後的持久疼痛和痛覺過敏的發展。在外周組織中，傷害性感受器的活動是傷害性刺激引起的一系列複雜的生理和病理反應的一部分，它與組織損傷引起的局部血流增加和水腫等效應之間有協同作用。因此，傷害性感受器不僅傳遞組織損傷的信息，而且在局部組織防禦和修復機制中也起一定的作用。 D.脊髓背角是痛覺的初級中樞. 7.

(15) 傷害性感受器傳入未梢與背角淺層細胞發生突觸聯繫，Rexed 將脊髓分為十層（如圖一）。與感受傳入有關的主要是背角的 I~VI 層和 X 層。第 I 層中的邊緣細胞的軸突投射到腦幹和丘腦。第 II 層也叫膠質層，由排列緊密的小細胞和纖維組成，其外層(IIo:中的柄細胞 (stalked cell)，多數是興奮性中間神經元，內層(IIi:中的島細胞(islet) 是抑制性中間神經元。第 III 層由大量的有髓鞘纖維、投射神經元和類似第 II 層的中間神經元組成。第 IV 層是背角中最厚的一層，由多種大和小的神經元組成，大的投射細胞的軸突伸延到第 II 層廣泛分佈。在第 I~IV 層(特別是第 II 層)中，有一種背角特有的突觸球 (glomeruler)結構，它是由居中的初級傳入末梢和包圍在四周的許多樹突和軸突組成，相互構成軸突-軸突、軸突-樹突和樹突-軸突型的突觸。這種突觸球在感覺信息調制中起重要作用。第 V 層在背角是最狹窄的部分，其投射神經元是背角中最大的，樹突與第 IV 層的相似。第 VI 層是背角中的最後一層，只在頸腰膨大部分存在，有大量來自腦的下行纖維終止在這一層。第 VII 層是脊髓灰質中心部分的一個不規則區域。第 VI 層和第 VII 層中有投射神經元和中間神經元存在。脊髓腹角的第 VIII 和 IX 層是運動神經元集中的區域。第 X 層是圍繞中央導水管周圍的灰質。應用切斷背根追索變性纖維、標記氨基酸注射到背根神經節作初級傳入末梢放射自顯影和 HRP 纖維內注射等技術，結合電生理機能鑑定，已明確了感覺初級傳入在脊髓的投射分佈；Aδ和 C 傷害性感受器的傳入纖維由背根經李騷氏束進入背角，皮膚傳入的 Aδ纖維終止在第 I、V、X 層。傷害性感受器的 C 傳入纖維終止在 IIo 層，低閾值機械感受器的 C 纖維終止在第 IIi 層。傳遞非傷害性信息的 Aβ傳入纖維終止在第 III~V 層。內臟傳入纖維主要投射到第 I、IIo、V 和 X 層，肌肉傳入主要在第 I 和第 V 層的外側部。. 8.

(16) 圖一：脊髓腰段背角 Rexed 分層、背根（右側）和腹根（左側）傳入示意圖 E. P 物質和興奮性氨基酸介導傷害性初級傳入向背角的傳遞隨著神經化學解剖學的進展，已發現在初級感覺神經元中有十幾種生物活性物質存在。目前只有谷氨酸和 P 物質較多地符合作為傷害性信息傳遞信使的條件。如前所述，小的背根神經節神經元是傷害性感受器，其中 20%和 70%分別含有 P 物質和谷氨酸。近來發現在一些傳入末梢中兩種物質共存，分佈在背角第 II 層中。谷氨酸在 Aβ、 Aδ、和 C 纖維末梢中均存在，而 P 物質僅在 C 纖維中與谷氨酸共存。超顯微觀察表明，小清亮囊泡含谷氨酸，而大致密囊泡含 P 物質。 P 物質是一種 11 ? ，是速激? 家族中的一員。在哺乳類中樞神經系統中的速激? 只有 P 物質、神經激? A(neurokininA)和神經激 ? B。其相應的受體為 NK-I、NK-2 和 NK-3。P 物質及其受體豐富地分佈在脊髓第 I、II 和 X 層。如果 P 物質作為傳遞物參與脊髓痛覺信息傳遞的話，一個重要條件是傷害性刺激應該可引起它在初級傳入末梢的釋放。放射免疫測定的研究表明，高鉀引起培養的背根節神經元釋放 P 物質，強電流刺激離體脊髓背根也引起 P 物質在灌流液中的濃度明顯增加。這些結果在整體動物實驗得到驗證：只有強電流興奮外周神經 C 纖維和傷害性刺激皮膚才能引起 P 物質的釋放，而興奮 A 9.

(17) 類纖維或非傷害性刺激均無效。嗎啡和去甲腎上腺素可抑制 P 物質的釋放。近來用新發展的一項可測定神經? 釋放的新技術--抗體微電極，精確測定了 P 物質在脊髓釋放的部位，應用傷害性刺激或選擇性興奮 C 纖維的神經毒一辣椒素作用於外周神經，可在 C 纖維終止的背角第 II 層誘發 P 物質的釋放，為傷害性感受器傳入末梢釋放 P 物質提供了直接證據。 2 三、針刺鎮痛 A.針刺鎮痛有關之神經傳導 Melzack 和 Wall 在 1965 年提出閘門學說 (Gate theory)3，認為粗纖維感覺神經傳入脊髓的同時，在脊髓的同一節段可興奮另一中間神經元來阻止細纖維神經衝動之傳入。在此，可假設粗纖維傳導針刺或 TENS 的刺激來抑制細纖維傷害性(nociceptive)訊息的傳入。電針具同節段的脊髓鎮痛作用及針麻時在局部使用高頻率的 TENS，似乎符合上述之閘門學說。然而，傷害性訊息與電針刺激若非在同一節段上，針刺的鎮痛作用則須經由複雜的內源性鎮痛系統來完成，其中包含了鴉片樣系統及非鴉片樣系統兩大類。而與針刺作用最密切的神經傳導有下視丘弓狀核、大腦導水管周圍灰質、中縫大核、藍斑等 4、5。下視丘弓狀核富含 β-內啡? 之神經元，在電針鎮痛時，會增加 PAG 之神經元放電增加，再經由 NRM 及 LC 之下行. serotonergic 及. noradrenergic pathways 下傳到脊髓，與脊髓中之腦啡? 性中間神經元 (enkephalinergic interneuron)相連，進而抑制初級痛覺傳入神經釋放 P 物質。 6-9 B.針剌鎮痛與鴉片樣物質之關係鴉片樣物質(Opiate-like Substance;OLS)自 Hughes 於 1975 年首次從腦組織分離出具有嗎啡活性的多胜? (polypeptides)後，OLS 與針刺鎮痛效應的關係，就受到許多學者的注意。例如在針刺鎮痛時，人內 10.

(18) 腦脊髓液中的β內啡? 樣物質的含量增加 10 。同樣的，在家兔受電針刺激後，視前區內β-內啡? 樣免疫活性物質增加 11，表明電針能促使腦內釋放β-內啡? 來參與鎮痛作用。電針刺激後亦能加速大鼠中樞腦啡? 的合成 12，不論是在導水管周圍灰質 13、nucleus accumbens 14、 15、尾核、下視丘 16 或在脊髓的背角 17，腦啡? 的釋放皆有明顯的增加。另外，強啡? 在家兔脊髓中亦被證實參與電針鎮痛之作用 18。然而，早在 1979 年 Cheng 和 Pomeranz 就認為媒介電針鎮痛作用的類鴉片接受體，在不同頻率的電針下，似乎有不同的機轉 19 。電針鎮痛能被類鴉片接受體拮抗劑 naloxone 所逆轉，尤其是在低頻率(2Hz)的電針，相反的高頻率(100 Hz)電針之鎮痛作用並不受 naloxone 所影響 20、 21。Han 等人則認為，2 Hz 電針鎮痛作用在大鼠脊髓是由μ-及 δ-類鴉片接受體媒介，而 100 Hz 電針由κ-類鴉片接受體媒介。22、 23。另外 2/15 Hz 變頻電針的鎮痛作用在大鼠脊髓則與μ -， δ-，κ- 三種接受體都有關聯. 24. 。. 由上述研究可知，鴉片樣物質及接受體與針刺鎮痛關係密切，當針刺訊息傳入相關的腦區後，可增強 OLS 的活性或興奮 OLS 能神經元釋放β-內啡? 、腦啡? 及強啡? 等物質，分別經由不同的類鴉片接受體來媒介不同頻率電針之鎮痛作用。 C.針剌耐受與抗鴉片樣物質之關係多次注射嗎啡、腦啡? 或β-內啡? 等鴉片樣物質可產生耐受性 (tolerance)作用，而連續長時間反覆電針時，腦內釋放大量 OLS，也可引起耐受性，使針效逐漸減弱，稱為 "針刺耐受性"。鴉片類物質的耐受作用與中樞神經? Cholecystokinin (CCK)有關. 25、 26. 。由腦室或脊髓給予 Cholecystokinin octapeptide (CCK-8)可. 拮抗鴉片類物質及電針之鎮痛作用 27。證實 CCK-8 在腦或脊髓中是 11.

(19) 造成嗎啡耐受和針刺耐受的抗鴉片樣物質(Anti-opioid substance , AOS)。更有學者指出，CCK-8 在大鼠脊髓中可經由 CCK-B 接受體來媒介抗鴉片樣物質之作用 28，並可有效地對抗μ-和κ- 接受體媒介之鎮痛作用. 29、 30. 。而 CCK-8 之拮抗劑則可逆轉鴉片樣物質造成之耐. 受，並有效增強嗎啡之鎮痛效果. 31-35. 。. 因此，針刺耐受性及和嗎啡間之交叉耐受(cross tolerance)作用 36. ，與抗鴉片樣物質(AOS)之產生有關。 D.針剌鎮痛與單胺類物質之關係早在 1979 年 Cheng 和 Pomeranz 就提出電針鎮痛的機轉有. endorphin 和 non-endorphin 兩個主要系統，當時認為低頻率電針鎮痛作用是由 endorphin 來媒介，而高頻率電針可能有 serotonin 的參與 19。後來大量研究顯示，針刺鎮痛後動物腦中 5-HT 的含量上升 37，而外源性的 5-HT 由腦室給予亦可加強電針的鎮痛作用 38。另外，有學者指出，在家兔中央灰質內直接注射或由腹腔注射 PCPA 可降低電針的鎮痛作用. 39. ，而在杏仁核內注入 5-HT 的前驅物 5-HTP 則可加強電. 針鎮痛之作用 40。同樣地，在電生理學實驗中發現電針足三里可以加強中縫大核 (NRM )的放電頻率. 41. ，而用 5，6-DHT 毀損腦中之. Serotonergic fiber 則減低電針之鎮痛效果 42。更進一步，在 1989 年 Tsai 提出，在電針後脊髓中 5-HT 之釋放增加，可能進一步活化 Enkephalin-interneurons，再由突觸前抑制 primary sensory neurons 對痛覺的傳導 8。由上述研究可知 5-HT 必定是調節針刺鎮痛的重要神經傳導物質。至於電針鎮痛後，5-HT 與 NE 或鴉片樣物質間是否有交互作用？由何種 receptor subtype 來媒介，則有待進一步探討。中樞神經系統中的去甲腎上腺素(NE)對針刺鎮痛究竟是增強或對抗作用，學者的看法仍不一致。Han 在 1983 年提出電針刺激使腦和脊髓中 NE 含量下降，並認為腦和脊髓中的 NE 在電針鎮痛中起著 12.

(20) 截然不同的作用，腦內 NE 主要是透過 α接受體對抗電針鎮痛，並兼有較弱的β接受體加強電針之作用；而相反的脊髓內 NE 則是透過α 接受體來加強電針鎮痛作用 43、44。後來，又有學者提出 clonidine （α2 接受體致效劑）會減低針剌的鎮痛作用 45，相反的，亦有學者提出 clonidine 可加強電針鎮痛作用 46。因此，較肯定的是 NE 的確與電針鎮痛有關，但到底是促進或抑制？與 serotonin 或 opioid substance 是否有關？則值得進一步的研究。 E.不同頻率電針鎮痛之研究在電針鎮痛的機轉中，電針時所施予的參數，如電流量、電壓、頻率、電針時間等，都必須清楚的選擇，而其中尤其是頻率更重要。早在 1976 年 Bruce Pomeranz 就提出 0.2 Hz 電針沒有鎮痛作用，4 Hz 低頻率電針具有鎮痛作用，且經由 endorphin 媒介，而 200 Hz 高頻率電針亦具有鎮痛作用，且認為乃 serotonin 所媒介. 19、 47. 。Han 在. 1986 年後，相繼發表許多研究，認為 naloxone 逆轉電針鎮痛的程度決定於電針的頻率，2和 15 Hz 電針鎮痛可被 naloxone 所逆轉，而 100 Hz 電針則不然。更認為電針刺激強度(1、2、3 V)並不影響 naloxone 逆轉電針鎮痛的百分比 48。1989 年，Han 更進一步說明在脊髓中不同頻率的電針鎮痛作用是由不同類型的類鴉片接受體所媒介，認為δ類鴉片接受體參與 2 Hz 電針鎮痛，而 κ類鴉片接受體參與 100 Hz 電針鎮痛，而且 2 Hz 與 100 Hz 間無交叉耐受作用 23。後來在 1992 及 1993 年又補充說明，認為 2 Hz 電針鎮痛作用主要由 μ-及 δ接受體共同媒介，100 Hz 電針鎮痛由κ-接受體媒介，而 2/15 Hz 交替之電針鎮痛時，則μ-、 δ-、κ-三種鴉片類接受體皆參與其中. 22、. 24. 。另外，亦有學者從不同頻率電針下 c-fos 基因在不同腦區神經核. 之表現，來證實低頻與高頻電針的確經由不同的神經路徑 49。除此之外，尚有許多研究認為不同頻率電針有 glutamic acid 及 CCK-8 等神 13.

(21) 經傳導物質的參與 50、 51，但較一致的結論是，不同頻率電針鎮痛機轉不同，其中低頻率電針是可被 naloxone 逆轉。然而，除了頻率外，電針刺激強度與電針時間似乎也不容忽視。 Pomeranz 在 1988 年提出電針 10 分鐘後，休息 90 分鐘，再電針 10 分鐘時，第二次的電針效果更加顯著 52，而在電針前先給予長效類鴉片接受體拮抗劑 naltrexone 可逆轉電針鎮痛作用，但若在電針後才給予，則無法阻斷電針之鎮痛作用 53。可見給藥時間與電針時間都與電針作用相關。Wang 在 1993 年更提出電針刺激強度及頻率與電針後之暫時性陣痛(transient analgesic effect)及後效作用(after-effect) 有關，認為在暫時性鎮痛作用中，低頻率(10 Hz)、高強度(6 V)優於高頻率(200 Hz)、低強度(3 V)，而在後效作用中則恰相反 54，是否暗示電針後之立即鎮痛作用與刺激強度較有關，而之後產生之後效作用與電針頻率較有關，實在值得進一步加以探討。四、疼痛的分子生物學研究愈來愈多的証據顯示，長期的傷害性刺激會導致中樞神經特殊的改變，使得中樞神經敏感化(sensitization)，對於輕微而短暫的刺激產生強烈而持續的反應 55、 56。疼痛刺激從初級傳入神經去極化開始，透過突觸間傳遞及自由擴散的方式將訊號送入中樞神經系統之神經細胞核內，必須經過三級制訊號傳遞系統。這些經由傷害性神經刺激所造成的中樞神經可塑性變化(neuroplasticity)，主要經由興奮性胺基酸受器(excitatory amino acid receptor)以及受器活化後引發的一連串胞內訊息傳遞物質的影響 57。這些物質包括了興奮性胺基酸，神經細胞內鈣離子，一氧化氮(nitric oxide)，前列腺素(prostaglandin)，PKC 以及 Jun，Fos 等蛋白的調節。因此當細胞受到疼痛刺激後，經由興奮性胺基酸、受器，以及一連串胞內的訊息傳遞物質會導致神經細胞特殊變化的分子生物學機轉。. 14.

(22) A.初級訊息傳遞者--疼痛訊號的產生和製造 (一)興奮性胺基酸(EAA)釋出在人體內參與的 EAA 介質，主要是天冬氨酸(L-asparate)，谷氨酸(L-glutamate)。雖然其釋出來源是 C 型纖維神經末稍，但它並非在該處合成，而是由神經末稍附近的神經膠元細胞(astrocyte)的 glutamate synthase 負責製造，再轉送至神經末稍內包裝及儲存。一般而言，它最常和其它介質如 Substance P，calcitonin gene-related peptide(CGRP)包裝在一起。平時這些介質從單一包裝的貯存囊 (vesicle)釋放，造成背角神經元細胞膜快速去極化，一旦刺激停止，去極化就立刻消失。而當強烈刺激來臨時，混合包裝的貯存囊就會從 C 型纖維末稍釋出，稱為合併釋出現象(co-release)。這些介質單獨出現僅能傳遞短暫的訊息，唯有當 substance P 和 EAA 同時存在時，背角神經元細胞膜去極化才會持續較長的時間 58、 59。當中樞神經系統受損時(例如缺氧、外傷、中毒、疾病)，興奮性胺基酸會大量製造並且累積在神經元週圍，造成長時間的神經元興奮，更加深了神經系統受損的程度 60。當今的「神經可塑性」學說便提出：興奮性胺基酸的大量釋出，是造成許多慢性疼痛的原因之一 61。在脊髓背角神經元上的受器可分為 NMDA(N-methyl-D-asparate) 及非 NMDA 型(包括 AMPA/KA 型)。在中樞神經系統中，形成疼痛過敏的過程是由非 NMDA 受器負責誘導，NMDA 受器則扮演著維持者的角色 62。以福馬林疼痛試驗而論，早期興奮波主要就是由非 NMDA 受器誘發而來，並和運動神經元直接串聯，形成強烈的疼痛反射。晚期興奮波則因 NMDA 受器的激活，以及一連串的訊息傳遞，導致神經核內新物質的生成，以及神經元細胞的改變而產生。其中 NMDA 受器的激活是疼痛過敏最重要的一節，直接刺激 NMDA 受器可以誘發疼痛過敏 63。如果在福馬林疼痛實驗前，先在脊柱內投予 NMDA 拮抗劑可以阻斷疼痛過敏，相反地，如果是在福馬林注射後 15.

(23) 再投予，則無阻斷效果 64。 (二)NMDA 受器活化 NMDA 所主導的離子通道可進出鈉、鉀、鈣等離子。平常狀態下，鎂離子持續阻斷其流通（如圖二）65。NMDA 型受器接受雙向調節，它的開啟不但需要 glutamate，還與細胞膜電位有關。結構體分為：1.離子通道，2.介質結合區兩大部份。其中興奮性胺基酸(如 glutamate)和抑制性胺基酸(如 glycine)分別結合在不同的區域，但是都會活化離子通道。鋅離子結合區則屬於抑制性功能，這些區域屬於競爭型結合狀態。傳統的 NMDA 競爭型拮抗劑(如 AP5)，作用在 glutamate 結合區，雖然在藥理學研究上扮演極重要的角色，卻因改變神智的副作用過強，在臨床上無法使用。目前，藥理學家將希望全部放在甘氨酸(glycine)結合區上，因為它具有相似的止痛療效卻不影響精神狀態，是 NMDA 家族中最有臨床潛力的一環。NMDA 離子通道屬於 slow channel，平常受到鎂離子阻斷很難開啟，只有非 NMDA 受器及 NK-1 受器活化後產生的 fast EPSP 將鎂離子推開後，才能打開離子通道。在通道的入口處還有兩個區域可接受調節：PCP-site 和 MK801-site，兩者同屬非競爭阻斷劑型(non-competitive antagonist)，目前惟一可在臨床上使用的藥品 ketamine 和 dextromethorphan 就是屬於此類，使用上所產生的副作用和上述的 NMDA 競爭型拮抗劑很相近。（三）臨床應用由於生理上激活 NMDA 受器的理論決定在：1.突觸前強化一強烈的疼痛刺激使得 C 型纖維神經末稍不斷釋出多種興奮性介質如 substance P，CGRP，glutamate 使突觸後細胞膜一直保持在易興奮狀態 66-70，當細胞膜電位去極化至一程度後（例如非 NMDA 受器活化）或 metabotropic NMDA 受器活化，經一連串訊息激活 PKC 71，可以將 16.

(24) 阻斷 NMDA 離子通道的鎂離子移開，並且引發胞外鈣離子經由 NMDA 通道及其它鈣離子通道進入胞內。2.突觸後神經元調節：痛覺刺激後，細胞內活化的 PKC 與 PKA 可以從細胞膜內將 NMDA 受器磷酸化，也會使它更易激活 72。目前有一種全新的理論一「前瞻性止痛法」就是根據以上的結果所得到的啟示 73。. 圖二：NMDA Receptor 圖 B.次級訊息傳遞者--疼痛訊號的放大 (一)鈣離子鈣離子不僅直接改變了細胞膜其它離子的通透性，更重要的是它身為次級訊息傳遞者，負責啟動一連串的酵素反應將痛覺訊號放大，這些活動包括：1.誘發細胞膜 PLC 酵素的活化，產生 IP3 及 DAG； 2.經由 DAG 誘發細胞質酵素 PKC 的活化，或經由 IP3 選擇性的釋出內質網(ER)內的鈣離子 74。胞內鈣離子主要是貯存在內質網，由於內質網分散在細胞質中，是胞內區域性活化的關鍵 75。鈣離子進出細胞. 17.

(25) 質的管道很多，一是來自胞外的組織間液，一是來自胞內的內質網，分別由兩種膜電位掌控：1.經由 fast EPSP 的開啟，鈉離子大量湧入造成細胞膜快速去極化，使疼痛訊號沿著軸突和樹突傳送達至較高的中樞，或形成區域反射弧；也可以藉 G protein 而啟動 PLC 放出 IP3，再由內質網釋出鈣離子。因為鈣離子很快會被再回收至內質網，以致這個訊號很短暫就消失。2.slow EPSP 緩而久的去極化可以引導細胞膜上鈣離子通道的活化。在神經元的細胞膜上，鈣離子進出的管道和其它興奮性細胞(例如：心肌、血管平滑肌、骨骼肌等)不同，主要是經由(1)NMDA 受體所管制的鈣離子通道，(2)L 型鈣離子通道。兩者的調節機制小同而大異，相同的是都必須反覆使用後才逐漸激活 (use-dependent)，並且由膜電位來調控；相異的是，前者還接受興奮性胺基酸調節(ligand-gated)，管道在開與閉之間有極為懸殊的差異，微調和粗調各有不同的生理意義。而後者在疼痛所引發的鈣離子湧入中的重要性甚低，雖然 L 型鈣離子通道可以接受鉀離子增加而大量開啟(potassium dependent)，一般認為它在疼痛訊號傳遞過程中僅扮演配角，屬於緩慢而持續的鈣離子滲透通道(leakage channel)。因此傳統的 L 型鈣離子通道阻斷劑，例如 nifedipine 或 verapamil，單獨使用根本無法阻止疼痛所引起的鈣離子湧入現象。目前的研究主要是放在協同嗎啡類藥品止痛，動物實驗上有不錯的成績 76。 (二)PKC NMDA 受器一旦開啟，鈣離子長期地灌入後，PKC 就會不斷被活化。PKC 可以刺激一氧化氮產生，接著製造 cGMP 而繼續再活化 PKC。同時 PLC 也製造 DAG 活化前列腺素，可以再由膜上之 PG 受器反向刺激自己或別的細胞。顯然 PKC 的角色就是不斷地放大鈣離子所帶來的訊息，產生疼痛的活化。藥理的證據顯示，以微透析方式將 phobol ester 注入猴子脊髓後角區，可以在視丘記錄到緩慢出現的痛覺過敏現象 77，利用 ganglionside 來中止 PKC 蛋白的 translocation，. 18.

(26) 可以在動物身上達到前瞻性止痛作用 78。由於 PKC 自我放大的迴路如此強大，是不是細胞就不斷被活化永不停止呢？以致於人們不禁開始擔心 PKC 的活化訊息會不會在適當的時機停止？最近的研究指出肯定的答案，除了直接針對 PKC 去磷酸化活性的方式以外，值得注意的是，雖然 PKC，calmodulin 等，一面製造了 cGMP，牽制了 cAMP，但卻一方面慢慢地激活 cGMP phosphodiesterase (PDE)來消耗 cGMP，同時也激活 adenylate cyclase 來活化 cAMP。也就是說，它利用其它因子間接拮抗自己產生的信號，這其中的間隔有多久，目前並沒有研究很透徹。在這方面下功夫研究其控制的變因，也許是將來有用的目標 79。 (三)超越突觸障礙之細胞間傳信者--擴散性介質傳統神經生理學家相信神經細胞間的訊號必須透過突觸來傳遞。然而最近的研究顯示，在疼痛傳遞中一氧化氮( nitric oxide)和前列腺素以獨特自由擴散的方式，透過細胞膜自由進出鄰近的神經細胞，完成興奮性調節作用，完全不必仰賴突觸傳遞。長久以來神經生理學家對於疼痛感受區擴大的現象一直無法提供合理解釋。近年來，雖然 EAA 的角色不斷被強調 80，但是對於局部產生的介質如何穿透空間的障礙仍然一籌莫展。直到擴散性介質的作用在疼痛訊息傳遞中被發現，疑雲才逐漸開朗 81。原來，擴散性介質在突觸後神經元形成後，以它們有利的物理特性向週邊均勻擴散，其濃度隨著距離遞減，愈靠近幅射核心，受到的影響愈大。由於中樞神經系統內神經與神經之間的聯繫十分密切，擴散性介質不僅可以直接作用在鄰近神經的細胞體上產生直接的調節作用外，也可以透過互相接觸的軸突與樹突去影響遠方的神經元。除了空間效應外，影響範圍隨著時間而逐漸擴大的現象，也和擴散的原理不謀而合。 1.一氧化氮. 19.

(27) NMDA 受器活化後很重要的事件就是一氧化氮形成。一氧化氮是一種極不穩定的氣體，它在細胞內其有自由基的功能。由於它的一些特性，最近一直被熱烈討論著，很可能它是神經修飾作用中一個很重要的訊息傳遞因子 82。一氧化氮的半生期很短，僅有數秒鐘的壽命，很快形成並且迅速消逝。僅管壽命如此短暫，它卻以驚人的速度分別進出細胞膜：(1)以自由擴散的方式迅速穿透鄰近神經元細胞膜，構成所謂的「反向訊息傳遞因子」，一般相信反向傳訊可以提高突觸間強度。(2)它還可以繼續深入該神經元之細胞核膜，誘發三級訊息傳遞者(例如 Jun，Fos，Krox轉錄因子) 83。一氧化氮合成酵素(nitric oxide synthase,NOS)平時以不活動狀態存在於細胞質內，當胞內鈣離子濃度增加而活化 calcium dependent camodulin (NOS 的一個 cofactor) 時，兩者互相結合才形成有作用的酵素。所產生的一氧化氮有許多效應，其中被認為與疼痛過敏最有關係的是活化可溶性 guanylyl cyclase 它的結構類似血紅素(hemoglobin)。一氧化氮的受器就是其正中央的二價鐵離子，它的活化產物 cGMP 再活化 protein kinase G，一種具有蛋白磷酸化，具有改變膜通透性，及基因調節能力的磷酸化酵素 84。一氧化氮和 cGMP 有關疼痛過敏在藥理學上的証據顯示：注射一氧化氮的前驅物(L-arginine)，可以引發「溫覺疼痛過敏」(thermal hyperalgesia)，而非「機械性疼痛過敏」(mechanical hyperalgesia) 85；相反的，由脊內注入 NMDA 所引發的「疼痛過敏」可被一氧化氮合成酵素抑制劑(L-NAME/L-NMMA)，可溶性 guanylate-cyclase 的抑制劑，或是血紅素來阻斷 86。有趣的是血紅素必須在細胞外清除一氧化氮，因此一氧化氮被認為可能不是直接作用在原生產細胞，而是四處擴散，它可能在突觸後神經元形成，再反饋突觸前神經元，或是由中間神經元製造再四處影響 87。因此，把一氧化氮比喻成一種以疼痛為起源的廢氣污染，利用氣體擴散而將疼痛的訊息散佈各處，這種見解確有幾分神似。 2.前列腺素 20.

(28) 前列腺素不論在中樞或是週邊神經系統中都對疼痛過敏的形成佔極重要的地位。在發炎區局部注射其拮抗劑 NSAID's，可以抑制疼痛過敏，相反地，用 PGE2，PGI2 則可興奮 C 型纖維。與前列腺素在藥理學上作用相似的介質尚包括腺? (adenosine)及血清擴張素。它們分別經 A，5-HT 受器連結的 Gi 蛋白(inhibitory G protein)減少 cAMP。 2 在中樞神經系統方面，脊內注射 PGE2，PGD2，PGF2，也可以誘發疼痛過敏。而在脊內注射 NSAID 雖然不能抑制福馬林疼痛實驗中的早期階段興奮波，但卻可以有效抑制晚期階段興奮波，並且與施予劑量呈正相關。當 NSAID 和嗎啡類藥品或 A2 興奮劑聯合使用時，這種效應有互相加成的作用 88。脊內前列腺素的來源包括背角神經元上的 NMDA 受器活化 PLA2，並促進甘油二脂(diacylglycerol，DAG) 崩解，使得花生四烯酸(arachdonic acids)增加，以及 substance P 刺激神經膠原細胞釋出。很可能是前列腺素促使背角神經元上的晚期階段興奮性突觸後電位持續如此長的時間 86。 C.三級訊息傳遞者--訊號的維持與執行 c-fos 細胞致癌基因屬於早發性迅速基因(immediate early gene， IEG)，在刺激出現後 5 分鐘就開始轉錄作用，30 分鐘後在細胞核內便可以出現其活化後產物 Fos 蛋白，約兩小時達到最高峰，四小時後逐漸消失。Fos 是正常細胞核內的轉錄因子，在訊號傳遞中扮演著極為重要的角色。藉著 c-fos 的激活，神經細胞核可以啟發一連串之蛋白質合成及細胞膜電位改變的反應。生物體內有許多基因，在正常狀況下只有維持很低的活動度，平時處於休眠狀態，但是當某些外在的刺激下，會很快速的表現出它的調節功能，因此被稱為早發性迅速基因。這些刺激包括：光線、感覺神經的激活、去極化興奮、藥物、及各種神經的傳導物質。這個歸類項目下，包括一百餘種不同類型基因。其活化產物是轉錄因子，形成 21.

(29) 之後在核內調節其它基因的表現。負責製造該蛋白產物的 mRNA 在細胞出現後，立刻送入細胞質內完成轉譯作用，然後迅速將蛋白送回細胞核作用在後續基因(late response gene,LRG)，例如 pro-dynorphin， pro-enakephalin gene 上（如圖三）57。後續基因負責細胞實際上功能與結構的維持，產品包括:各種酵素、結構蛋白、介質、荷爾蒙。. 圖三：細胞核內 c-fos 相關疼痛訊號傳遞過程圖 (一)c-jun 的調節在細胞核內 Jun 原先就存在了，它的活性主要是靠兩個調節區域的磷酸化和去磷酸化來決定，但十分有趣的是這兩個調節區域磷酸化之後，功能正好顛倒。其中靠 C 端的 DNA bind area(DBA)很靠近與 Fos 結合的區域，一旦被磷酸化形成 Jun-DBA-ppp(磷酸化的 DBA)，不但不能和 DNA 結合，反而會把 Fos 分解掉，可見 Jun 必須維持在 Jun-DBA-pp 狀態(去磷酸化的 DBA)，才會和 Fos 結合成最穩定的 AP-l-like 蛋白。在未受到刺激的一般狀態下，Jun 蛋白平常是以不具活性的 Jun-DBA-ppp 存在，疼痛的次級訊息透過 PKC 活化 Jun 22.

(30) pyrophosphotase ，它先進入細胞核把 Jun 的 DBA 去磷酸化 (dephosphorylation)，等待 Fos 來結合 87。換言之，在細胞核內把 Jun 蛋白的 DBA 磷酸化，就可以自我摧毀三級訊息的傳遞。很巧妙的，在 Jun DBA 之靠 N 端的位置，也就是靠近要被 AP-1-dimer 的啟動區 (故稱 transcripition domain)，反而要磷酸化才有活性，有利於其他酵素的工作。 Fos/Jun 活動的範圍只在核內，而且啟動 LRG(late response gene) 後會回頭抑制 c-fos 轉錄，增加 c-jun 轉錄，如果沒有繼續從次級訊息傳遞者將訊息送來(例如 PKC 的後續強化訊號)，Jun 又會回復到自然地磷酸化狀態。此時縱然有大量的 Fos 形成，三級的訊號傳遞還是很快就在核內中止了，這和前述 PKC 的自我調控不同。PKC 可藉 PG 及 NO 來自我加強，而三級訊息傳遞者的調節多半是抑制，任務完成就自我毀滅，至今尚未有類似的自我放大迴路 88。除了 Jun DAB 磷酸化以外，Jun family 中還有一種 Jun-B 在晚期會慢慢出現取代 Jun。此物對 Fos 的親合力和 Jun 一樣強，但卻沒有什麼 AP-l-like activity，一旦取代 Jun 和 Fos 相結合，細胞核的活化便終止了，因此 Jun-B 也是扮演負面調節的角色 89。 (二)c-fos 的產生與調節人類 c-fos 基因位於第 14 對染色體的 14q24.3-q3190，它的基因表現受到兩種細胞外物質的活化：1.促進細胞分裂劑(mitogen)－其中以 TPA 最有名，在細胞核內負責接受 TPA 訊號，誘發細胞分裂的 DNA 片段就命名為 TRE(TPA response element)。2.血清－主要是血清中所含的調節細胞分裂之生長激素，如 epidermal growth factor， nerve growth factor。早期的研究在培養皿中加入血清，發現也可以刺激 c-fos 基因的表現，讓 DNA 片段又命名為 SRE(serum response element)。原先以為兩者是重覆的命名，現在慢慢瞭解這兩者是不同的 DNA 片段，並且經由不同的順序來調節基因，其中 SRE 和 TRE 位在 c-fos 23.

(31) 基因前方調節 c-fos 轉錄，而 TRE 同時還是 AP-1-site 的主要成份。截至目前為止，大家對於影響 c-fos 的酵素不像對 c-jun 活化和抑制的相關酵素那麼清楚，只知道在細胞質內鈣離子大量湧入後，會活化 MAP(mitogen activated protein) kinase 和 RSK(ribosom S6 kinase)直接進人細胞核將 Fos 蛋白的氨基酸磷酸化 91。另外在疼痛的胞內訊號傳遞中，細胞質內主要是由鈣離子所主導。近來的研究顯示，雖然細胞內鈣離子只有一種，但經由不同通道進入胞內的鈣離子(如 NMDA 的鈣離子通道和 L 型鈣離子通道)，對於 c-fos 的調節居然有不同的方式。Bading 等人利用基因工程的技術將人類的 c-fos 基因和它前端的控制基因植入組織培養的大白鼠腦細胞內，發現 NMDA 的鈣離子通道和 L 型鈣離子通道同時都可以激活 c-fos 基因表現，但是卻發生在不同的控制基因段，換言之，兩者雖然都是經由鈣離子來誘導 c-fos 表現，但是其細胞核內調節的機轉和方式，竟然有很大的差異. 92. !為. 什麼有這樣的安排，目前仍然不甚清楚。可以確定的是，疼痛訊號從突觸前誘導細胞內次級訊息傳遞者的鈣離子，再穿越細胞核完成三級訊息傳遞者 Fos 的活化過程，並不是單一的路徑，不同類型的離子通道，雖然引導相同的次級訊息傳遞者活化，但是其後續的傳遞及調節過程仍然是遵循獨立的管道，Fos 可能只是參與其中一項重要的環節，還有許多細胞核內其它的調控因素在主導這個微妙的反應。新產生的 Fos 若是未能遇見 Jun-DBA-pp(去磷酸化的 DBA)，很快就被分解了 93。幸好 PKC 被刺激時，Jun pyrphosphotase 也一起被激活，它先進入細胞核把 Jun 的 DBA 去磷酸化，Fos/Jun dimer 才能順利完成。另外值得一提的是，細胞質內其它 tryosine kinase(例如上述的 MAP kinase 和 RSK)若不斷的刺激，也會直接進入細胞核將 Fos 蛋白的氨基酸磷酸化 94，結果 Fos 反而會下降，這個矛盾的現象與 Jun 的 DBA 去磷酸化的反向調節 AP-1 有異曲同功之妙，可惜目前並不清楚這些巧妙的微控調節罷了。. 24.

(32) (三)轉錄後產物的功能 c-fos，c-jun 其活化產物是 Fos 及 Jun 蛋白，個別轉錄因子並無活性，要形成 AP-1(Activator-Protein)之後才能在核內調節其它基因的表現。AP-1 蛋白質具有一種特殊的結構(zinc finger)，可以辨認一段特殊的 DNA 序列。AP-1 的種類包括多種核蛋白組合方式：homodimer (如 Jun-Jun)，heterodimer（如 Fos-Jun），在疼痛傳導的訊息傳遞中，最穩定的 AP-1 就是 Fos-Jun dimer。和 AP-1 同類的 DNA 結合蛋白中，還有另外一種名為 CREB (cAMP/calcium response element-bind protein)的蛋白，它只能辨認 DNA 上一段特殊的排列密碼 CRE(cAMP/Calcium response element)， CRE 位在 c-fos 前方負責 c-fos 的轉錄(另外一個調節基因是 SRE)，因此 CREB 是控制 c-fos 轉錄的蛋白之一。CREB 主要是由 cAMP 所誘發，少數情形由 NMDA/鈣離子引發，除了可以啟動早發性迅速基因的活動以外，還可直接啟動某些後續基因。Fos 形成後以 AP-1 的型式來活化 LRG 前方的 AP-1 site，因此 AP-1 是控制 LRG 的轉錄因子之一。CREB 和 AP-1 雖然都是轉錄因子，但是作用在不同段的基因，調節對象不同，時間順序上也並非同時發生。脊髓背角區和疼痛關係較為密切的兩種極為重要後續基因是 pre- proenkephalin 及 pre-prodynorphin gene。強啡? 和腦啡? 是其主要產物，分別作用在κ receptor 和 δreceptor 上 95。它們的功能原先以為是用來抑制附近的神經元，從而達成止痛作用 96，然而近年的文獻卻發現，它們的含量在疼痛刺激後顯著增加，竟然可以強化疼痛 56! 原來在脊髓背角區，這兩種介質的直接作用是興奮性，平時含有這些介質的局部神經元長期處於壓制的狀態。而當強烈的興奮性訊息湧入背角區時，原來不活動的局部神經元便可以大量釋出強啡? 和腦啡 ? ，於是就產生了強化疼痛的訊息 68。最近的研究更進一步指出，強啡? 除了作用在κ receptor 外，還可以直接透過 NMDA 受器活化， 25.

(33) 來幫助突觸後神經元之興奮現象 97，顯然這些調節機制仍有極大的研究空間。由於疼痛傳遞訊息因子只出現在很短暫的特定時間，並且彼此互相依賴，息息相關。因此，以阻斷疼痛分子訊息傳遞作為慢性疼痛治療的藥物策略，在理論上是一個可行的方式。本研究為動物實驗，以白鼠 Wistar rats 為研究對象，針對次級疼痛分子訊息傳遞一氧化氮，在疼痛測試前先經脊髓腔投予一氧化氮酵素抑制劑 L-NAME，以抑制一氧化氮的生成，並觀察這個治療對於下游疼痛訊息 c-fos 表現，以及疼痛行為的影響。五、過敏性疼痛的評估與實驗方法在本研究所有的動物實驗中，我們以福馬林剌激作為過敏性疼痛的測試模式，並使用 Fos 蛋白質為疼痛的生化標記作為我們評估過敏性疼痛最主要的依據。這些方法的特色，以及採行的理由，分別敘述如下： A.Fos 蛋白質在疼痛訊號傳遞過程中扮演的角色以 c-fos 細胞致癌基因的活動度來做為疼痛的指標，是近年來疼痛學研究中嶄新的方向。和傳統的測驗最大的不同點：Fos 在神經核的活動度可以用型態學的方法固定，量化和比較。其精確性，可重覆程度及穩定性遠比傳統的行為觀察法更為優異。以解剖組織學中類似其他的方法為例，碳 14-2-去氧葡萄糖(14C-2-deoxyglucose, 2DG)是目前用來探測神經元代謝度的最敏感指標之一，而 Fos 用在代謝分佈的測試上與 2DG 的吸收極為接近 98，但是後者用在痛覺測試時卻無法呈現出刺激(痛覺)→反應(標示區)的解剖對應性 99。以 Fos 做為實驗動物疼痛指標好處包括 l.沒有接受疼痛刺激的情況下，正常活動的清醒大白鼠其背角區幾乎完全沒有 c-fos 的表現。 26.

(34) 給予疼痛刺激後，在刺激同側背角負責痛覺的區域:laminaI/II/V，會出現大量的 Fos，而在未受疼痛刺激的對側背角區則完全沒有出現，顯示 Fos 對痛覺具有高度專一性。2.Fos 蛋白平時含量甚低幾乎無法測得，然而一旦經誘導出現後，含量大增，毋需再經過其它強化程序，用標準的免疫染色法就可以染出，操作簡便，可信度極高 100。3.計算染有 Fos 標記的細胞核數目可以反應出刺激的強弱，具有半定量的效 101. 果. 。 4.可以參考其分佈情形，具有極佳的定位性 (somatotopic. presentation). 102. 。5.不同的疼痛刺激會產生不同的表現 103，如：機械. 性疼痛，炎性疼痛(例如:結核菌素關節內注射，福馬林皮下注射)，神經傷害疼痛模式，內臟疼痛 104-107。6.Fos 是核蛋白，所得到染色反應全部發生在細胞核內。利用雙重染色法可以同時染出細胞質內其它蛋白的活動，提供強烈的神經細胞 Fos 轉譯後訊息. 108. 。7.更重要的是. Fos 的誘導與調節機制已經在分子生物學的研究中得到強烈的佐證，與細胞內訊息傳遞息息相關 109。藉著 Fos 的激活，神經細胞核啟發一連串之蛋白質合成及細胞膜電位改變的反應，這種現象不啻為神經可塑性參與疼痛最直接的證據 110。因此，最近的研究一致推崇 Fos 免疫染色法是用來探索疼痛的神經活動度方法中，極為理想的工具。 B.Fos 作為疼痛指標的限制然而，Fos 在生理上是一種普及型的後續基因轉錄因子，可以同時接受多種刺激的訊息，因此在表現上受到眾多因素所主導。缺乏對疼痛刺激的專一性反應，是 Fos 做為疼痛的指標的先天上缺憾。在活體(in vivo)的動物實驗中，強光、噪音、驚嚇 111-113 等非疼痛刺激都可以誘導腦幹及大腦皮質區 Fos 的形成。在細胞培養皿(in vitro)中，它對於多種藥品都有反應，差別只是反應強弱不同而已. 114. 。. 儘管如此，在神經解剖學家的觀點中，倘若和其它更具侵犯性的一般神經學研究方法相比較，上述的缺陷簡直微不足道。他們認為對刺激的非專一性反應，普遍存在於各種神經科學的研究方法中，克 27.