3國1.樣本的收集與培養浪的也製
樣本的來源為取自中山醫學院5名健康的男學生，平均年齡 20岫
(20)
30歲，每位抽取的m1的全血，作淋巴細胞的培養.方法如下
1.用 10 ml 的注射筒，內加 0.2 ml 的抗凝血熱 (hep但n) ，
抽取周邊血液各 10 ml, 混合均勻之後 p 豎立靜星 3 小時會至注射筒 內的血液上層澄清.
2. 培養液的配製:將 RPMI-1640培揍液加入的申 15% 的牛
血清 (fetal bovine serum)及 1% penicillin, streptomycin和
neomycln.
3. 準備培養瓶 9 內裝的 9.4 ml培養液，將上述的注射筒經
輕的搖動會將針頭轉折成倒 V形會慢慢的將上層液推出 0.6 ml 注入培養
3輛2. 軒昂1A作用於人類正常淋巴細胞的染色體異常試驗
1. 肉上述 3 仕步驟 1-3 ，在步驟 3 ，將之分為試驗組
a丸C，社試管和對照是flk試，管.各試管內分別加入0.15
ml Phyto-hemag
l1utinine
(簡稱PHA)及培養液會血液，培養 24 小時.2. 配製不同濃度的，方法如下:
MMA (Fluka
, Switzerland) 以體積比你/v) 的方式 泡製，取 2 ml 的 MMAi容於 1 ml 的 DMSO( Sigma
,USA
)加入 17ml 的培養液偎PMI-1船0) ，依序泡出下列不同濃度的 MMA:A
=
9.32 x10 2mM
, B=
9.32 x101 扭曲症， c =
9.32 x10
0 扭曲哇， D
=
9.32 x10 幅1~哩， E=
9.32 x10 -2 ~哇， F=
9.32 x10-3 mM.鐘.
a丸
3. 由培養箱中取出培養瓶會在 1500 rpm速度下離心 8 分
4. 除去上層液會 k瓶加入不合藥物的新培養液，試驗#組且
E缸
m芷nM的孔岱f臥A ，再產入培養箱內培養45 小時.
5. 於採收細胞胎紅vest)前 30 分鐘會加入 0.2 ug/ml 的秋水仙
素
(co1cemid)於各個培養瓶內，混合均勻-6. 將培養瓶內容物倒入離心試管會於 1500 rpm速度下離心
8 分鐘，除去上層液.
7.取 0.075 M (56%) 的 potassium chloride (KCl)10 ml
,
加入各個試管內，在 370C度的水浴下作用 10 分鐘.
8. 盡於 1500rpm速度下離心 8 分鐘，除去上層液.
9. 加入的 ml的圈定液 (Fixer~ Methanol Acetic acid = 3: 1 )作用 30分鐘 p 於 1500rpm速度下離心 8 分錢，除去上層液.
10.加入的 10 ml 固定液作用 10 分鐘會離心 8 分鐘，除去上 層液.
1 1.加入的 10 ml 國定液作為 5 分鐘書離心 8 分鐘會除去J:.
層液.
12.加入的 10 ml 自定液作用 5 分鐘會離心 8 分鐘 p 除去上
層液.
13. 準備玻璃片 (Slide) ，作染色體潰片之製作.
定義:裂隙 (gap): 染色體上沒有染色部份的大小，不大於染色 分體之間的寬度，
斷裂 (break): 染色體沒有染色部份的大小，大於染色分 體之闊的寬度.
3岫2. 1\位直A作用在含或不合血清培養的淋巴細胞試驗
方法向上述的步驟，唯一差別是在步驟于 1-2. 培養液的製 備會一組加有含 10%FBS 的血淆，而另一經則不加血清 .MMA 的
試驗濃度 9.32 x 100 mM，觀察其染色體的變化.
3 岫 3. MMA典人類正常淋巴細胞作用的姊妹染色分體交換試驗
(19).
1.採血方法和淋巴細胞的培養，如同上述 3-1 步驟.
2. 於加入 MMA後的 24 小時，加入50uM 的 BrdUra (5咀 bromodeoxy服idine)於各偽培養瓶內會將之暗置於5% CO
2, 98%
溼度， 370C 的自動桂混培養箱內培接 40 小時.
3. 於收集染色體前 30 分鐘曹加入的 0.2 ug/ml秋水仙素
。. 1m!' 於各個培養瓶內.
4. 將培養瓶內容物倒入離心試管 9 於 1500 rpm速度下離心
8 分鐘，除去上層液.
5. 取0.075M (56%) 的 potassium chloride (KCl)10 ml ，加 入各個試管內，在 370C度的水浴下作用 10 分鐘.
6. 置於 1500rpm速度下離心 8
分鐘會除去上層液-7. 加入 10 ml的圈定波 (Fixer， Methanol : Acetic aci社記
3:1 )作用 30分鐘，於 1500rpm速度下離心 8 分鐘 p 除去上層液-8.加入的 10 ml 臨定液作用的分鐘，離心 8 分鐘，除去上層
液.
9. 加入的 10 ml 品定液作用 5 分鐘會離心 8 分鐘書除去上層
液.
10.加入的 10 ml 鹿定液作用 5 分鐘 9 離心 8 分鐘，除去上
層液.
1 l.玄學備玻璃片 (Slid吟，作染色體潰片之製作.
15.將潰有染色體的玻片雪置放於 56-600C 的乾燥箱會乾燥
12 小時以上.
18.取出玻片，放在含有 saline/sodium citrate (2倍 SSC!緩 街液0.03品。肉，650C下， 15 分鐘.
19.取出玻片雪洗淨乾燥 12 小時.
20. 舟的% Giemsa染料，染色 5啊7 分鐘.
2 1.於顯微鏡下觀察照相後根揖 S. Venitt的方法〈20)，計數 的0個分裂細胞的姊妹染色分體交換次數. 以 Paire往 t test統計差
異性.
第四章結果
4-1. 在合或不合血清的培養液試驗中會
1∞個分裂細胞染色體異常的平均數目，當藥物作用 45 時後，以
不合血清紐約.22) 的異常數大於含有血清紐約.10). (表一)
4-2. 不同濃度的 MMA 作為於淋巴細胞會
當藥物作用 45 時後，發現隨著濃度的增高 (9.32
x10久-9.32x 101 mM), 染色體異常的平均值也隨之增高 (0.080一個
0.172) .
在 4"1 ，43 的結果中，染色體出現的異常情形會只發現有問隙
(gap) 和斷裂 (break) 的情況，並未見有其它種情況的出現如:雙中心 節，環形染色體，多套權等.
第五章討論
將細胞培養加入藥物作用的試驗方法?加藥的時機有
二種方法:一、在一閱始即加入築物使之作用.二、在經通 24 小
時的培養後會才加入藥物俠之作用 (20) 本研究採用的方法屬於後
者.在細胞培養中加入化學藥物會可能會造成細胞過期延緩 (cell
cycle delay) 的情形，因此為確信藥物的作為有效果會於加藥作用
後，會將細胞的培養時悶延長 2個成更長的過期之後，才觀察結果
。0) 在組織培養方法中會培養液內舍的血清濃度約在 10%-20% 之
悶，如采血淆的濃度過高時，將會抑制成纖維母細胞 (ïrrboblast)
的生長 (21) 本研究所採用之血清濃度位於上述標準之內，國此確
信試驗結果不會有影響.關於孔位做加入到培養液後，是否會閥血
淆的存在兩影響它與淋巴細胞之作用實由表一發現，染色體異常的平
均數會以不合血清紐約.30) 大於含血清紐約.17) ，孔也且是否會和血
清結合而減小它與細胞之作用，仍須再研究.
PHA為一種 red kidney bean 學名 Phaseolus
vulg扭扭的抽取物，它可以剝激淋巴細胞量的增生 (22) 即 PHA作用
24 小時之後，可以增加淋巴細胞 DNA 的合成位的. 因此利用 PHA
的刺激會可用以研究人類染色體的變化會以作為診斷的工具 (2的.
在染色體結構異常的試驗中，本研究的結果所見到為
染色體間隙與當時裂的情形會並未見其它種變其會此與 Veni吐等指出
細胞經化學藥物作用後，造成細胞染色體異常的結果相同 (20) 染
色體斷裂可發生在細胞分裂過期 Gl.S.G2 時期的任一時期會如果發
生在 G2期時會財會有單染色分體斷裂，如果發生在 S 期時實則會
有雙染色分體斷裂的情形 (23) 推論本研究的結果可能是在G2時期
發生斷裂.本研究1v1l\且作用時問馮小時以上染色體異常的數目隨
著濃度的增高為增加，結果與第一篇 V79 動物細胞的試驗結果相
同 p 亦與 CHO 細胞在 MMA濃度由 750戶g/ml-3000戶g/n吐時，染色 體異常數目革計量相關 (dose related) 的結果相同作3)
DNA ，並增加 SCE 的發生頻率 (25) 本研究在 SCE 的結果顯示會
M1\且作用 64 小時後，隨 MMA 的濃度的增加， SCE 的頻率也隨之
增加，當濃度大於9 .32 x10-1 mM 時，與對照組比較，均呈明顯的 差異 (p<0.05) . Poss 等認為 MMA 在 34mM 時，對於 TM677
Sa1monella typhimurium 細菌是一種致突變劑 (24) • Zeiger等研究 怒為大於 10.0uglplate 的濃度時會M1\且對於 TA100，TA1535，TA抑
或 TA98 細胞為致突變劑。 8) • Chang 的研究指出， MMA濃度在 0.125由 1.000 pg/ml時，對於 L5178YITK+1- 的老鼠淋巴瘤細胞是一
種致突變劑 (29) Bigatti 等研究指出 PMMA 作用於人類淋巴細胞
後會並未有任何差異性變化會但對於細胞的增生指數
(proliferation index)有增加會作者認為是 PMMA對於細胞具有毒
性的結果 (1)
sæ 的數目在正常人的頻率會隨細胞的種類不同而有
不舟，其範為在 2-20 個會平均約有 5-8個互換 (26) 欲直不受性 4~ 差
異的影響，但會受封年齡的影響，發生最大的年齡範園是在 30-40 歲之閱 (27) 本研究的樣本年齡分佛的範區是在 20-30 歲會對照組的
數目也落在上述正常範圈內. ~在A 由於本身不溶於水，自此以
DMSO 作揖溶解的輔助劑，本試驗參與試驗的最高濃度為 9 .32
xl01 mM會此時 DMSO 的濃度在 0.5% 以下會此與 Stenchever 等認 為 MMA濃度高於 1% 以上時，會對細胞的世代之產生有影響的結
果似乎不相街突 (30)
由於樹脂在聚合時會有 2-5% 的單體殘存未發生聚
合會在聚合後殘瘤的會立即釋出 (31) 在牙科義齒沫的使用上會國
製作到配，戴大多已經過一段時間，理論上應不至於造成毒性反應.
有些報告指出，於外科手術使用此材料作為骨釘之後，會在病患的
體內產生毒性 (31) • Rijke 和 Johnson指出瓦拉拉的半生期 p 在試管
中， 200C 下，在全血肉的時間是 3 小時 (3 1) • 1\你趴在血液中的代
謝及在血液中可能發生的動力學機轉 (kinetic mechanism) 至今仍未
有文獻報告，此仍有待再研究.
結語
卸恥1A具有高揮發性由過去的研究報告以及本試驗的結果
均顯示，當 b岱弘濃度在 9.32xl0-1 mM ( 93.4 戶g/ml) 以上時，作用 馮小時後，會對人類林巴細胞具有細胞邊傳毒性及致突變性會國此
建議從事於接觸對這類材科的專業人員，應注意到工作環境以及自
我的保護會以為持健康.
第六章表格
Table 1. The mean value of chromosome aberration of 100
闊的aphase after methyl methacrylic acida treated on normal
h扭扭抽血 IYlDphocytes cultured with or witho祖t serulDb•
Chromosome aberration MeanValue
Serum( +) Serum付
Gap 0.07 0.08
Break 0.10 0.22
a: MMA concentration is 9 .32 扭曲哇，甘ea包nenttime is 48 hours.
b: 10 % feta1 bovine serum.
TabJe 2. The chromosome aberration of methyl methacrylic acid treated 0詛臨ormal human Iymphocytes.
CONCENlRATION τDTAL 1\位主TAPHASEa GAP BRE&.T{. MEANVALUEb
O 5故〉 13 4 0.034
9.32 x10-2mM 致的 18 32 0.080
9.32 xl0-1 n曲直 500 24 41 0.130
*
9.32 xl00 ml\在 500 28 49 0.154
*
9.32 xl01 n品生 500 31 55 0.172
*
a: 100 metaphase of five sample.
b: total aberraton numberl total metaphase.
* :
p<0.05 signi自cant1y difference, compared wi誼1control group.Table 3. The sister chromatid exchange of methyl methacrylic acid treated on 髓。rmal human lymphocytes. a
Concentration Total metaphase
O 5臼〉
9.32 x10 -2 II曲直 500 9.32 xlO -1 mM 500 9.32 xlOo II由怔 500 9.32xl01 mM 500 a: five student's blood b : Paired t test
* :
significant1y difference, compared wi由 con佐01 group.pb
< 0.05
*
< 0.05
*
< 0.05
*
L
圈一-淋巴細胞袋色分體斷裂情形(箭頭所指之處)
喔，當