題目
私立中山醫學院醫學研究所碩士論文
Master Th esis , Institute of Medicine , Chung Shan Medical & Dental College.
MethyI methacry Ii c acid 對哺乳類細胞的毒 性研究
一. MethyI methacry Ii c acid 對 V79 細胞
的毒性研究
二. MethyI methacry Ii c acid 對人類淋巴
細胞的毒性研究
指導教授 周明勇教授班血管YungChou 李宣館教授 Shua盟國YowLi
研究生
高嘉澤Chia.. Tze Kao
本論文為中山醫學院授予醫學(理學)碩士學位之必備條件之
一會經中山醫學院醫學研究所碩士論文考試委員審委合格及口試通過
口試委員
中央研究院動物所教授
私立中山醫學院醫學研究所所長
(論文指導教授)私立中山醫學院牙醫系主任
(論文指導教授)詹崑源博士
丹在我\
李宣仿博士
/C/LN
周明勇博士
物都仙境
中華民國八十五年七月二十日
誌謝
研究所的訓練讓我學封了基本生物醫學的研究方法，感謝所有協
助過我的人，感謝醫研后守所長李宣估教授的指導和江濤割教授的指
正，更感謝教持不倦的指導教授周明勇博士給予學生學習過程的教導
與支持，使得學生能頑力通過研究所的謝!練，謹以此誌 j崇表感激之心.
目錄
摘要 一一一一一一一一一一一一一一一一一一--6
第一章緒論 (Introduction ) 蟬翩翩嘲嘲個圓圓圓翩翩岫岫祖國圓圓圓圓圓圓圓圓圓 7
第二章材科與方法( Material and Methods )-祖國圓圓翩翩一一-圓圓祖國蟬闢9 2- 1.試驗材料
2岫1.1.試藥
9 9
2占 2.i色製方法
2吐.3. Medium
-一呵呵呵呵呵一一一呵呵呵呵呵一一呵呵呵 -10
…-10
2-1.4. MMA ( methyl methacrylic acid ) …一一一圓圓圓圓圓……間的 2仕 .5. Hoechst 33258 …一一一一……一一一… 11
2-1.6. Pixation solution 一一個---一一……一--11
2且1.7.2 X SSC 喃喃一一一一……一一四日
2-1.8. Buffer solution
2-2. 儀器
第三章試驗過程
四-11
呵呵呵呵-扭扭曲呵呵呵呵--扭扭曲 12
3由1.細胞的純化 (cloning of V79 cell )一…一一個一一一一 13
3-2. 多孔培養且試驗( Multiwell Test ) 一…一…一……--15 3-3. 細胞生長抑制試驗( V79 cell growth inhibitory test )一---17 3-4. 細胞聚落形成試驗( V79 cell colony formation test )一---18
子5. 染色體結構異常試驗(
Chroomosoome aberration test
)…峭的 3而姊妹染色分體交換試驗(Sister
chroma位dexchange test ) --21
第四章結果
4- 1.細胞的純化 (cloning
of V79 cell
)……一一個…一一…234間2. 多孔培養且試驗 (Mul註well
Test)
一一個…一……一一…23 4-3. 細胞生長抑制試驗(V79 cell growth inhibitory test) ----23
4-4. 細胞聚落形成試驗(
V79 cell colony formation test )
一-24 4-5. 染色體結構異常試驗(Chroomosoome aberration test
)…24
4-6 姊妹染色分體交換試驗(
Sister chromatid exchange test ) --24
第五章 討論 自由呵呵一一一一一一一一一一…一一一 26
第六章 齒表 一-一一目呵呵呵呵一一一呵呵呵一自由呵呵一一一呵呵一一呵呵血一 32
表一細胞生長抑制 一一一一旦自呵呵呵一一一一一---32
表二細胞聚落形成 一一一一呵呵呵呵---一一一一34
表三細胞染色體異常 自呵呵呵一---36
鸝四細胞聚落形成 一一一一一一呵呵呵---呵呵呵呵呵呵41
闢五細胞染色體異常 一一一…一一扭扭扭曲自由自由呵呵呵呵呵呵42
關六、細胞姊妹染色分體交換 自扭曲呵呵呵呵呵一扭扭扭扭扭扭一一一的
第七章 參考文獻 自由扭扭---由一一自由呵呵扭扭-一自由呵呵呵一 -45
摘要
Methyl methacrylate ( MMA) 為樹脂的一種單體，在自 會的生活用品以及醫療材料如:骨外科，牙科和自民粹的治療中都被
廣泛的使用.本研究使用中國倉鼠的肺臟纖維母細胞林( Chinese
hamster lung 血broblast ceU 篇稱 V79 ceU) 來探討其品生A 對 它的細胞毒性.資料經過 paired 圖t test 分析?結果發現在細胞生
長抑制方面實 V79 細胞在其伯笠A 大於或等於 9.32 xl0-4 mM 時，
作用三天後，有被抑制 (p<O.05)表現;在 V79 聚落形成能力(
plating efficiency )方面，結果用上述，即隨民恆生A濃度與時間的
增加實聚落數目減少.在染色體異常方品，染色體當時裂數目，當作
為啥8 小時後會隨其位直A 的濃度的增加尚有明顯的增加( P<O.05
);姊妹染色分體交換頻率則於民品質A 作用帶小時後會濃度在
第一章緒論
前言
Methyl methacrylate ( MMA) 為樹脂單體( monomer )
的成分，澄清無色透明的波體﹒ j容點 -480 C 沸點 100.80 C ~在 20 0 C 下的密度為 0.943 mg/ml，聚合反應的熱能為 12.9 kcall血。1，本身
具有高揮發性，是一種很好的溶劑.雖然目前牙科材料進步，樹脂的聚
合反應可用紫外線或可見光來催化， 但是在臨床牙科的使用上，仍然
利用加入一些起始辦( initiator )~於室混下， 讓 polymer 粉和 monomer 液發生自然的聚合反應 (1) 在日常的生活中 MMA 亦使用於許
多物品上，例如包裝食物的材科( food packing material )，物品的表面處理 劑，油漆和漆器等，使用範間非常普遍 (2) 因 MMA 本身有很高的揮發
性，對於接觸此類材特製作的從業人員 應該注意是否會對健康造成
傷害.
一種生物材料是否可以安全的使用於生物體，必須經 i通邊一
些試驗
上評估〈仰3仍)包括:細胞毒性 (cytotoxicity ) ，溶血作用 (hemolysis ),
安氏試驗( Ame's test )，細胞的轉形變化( cell 甜甜sformation )或 口腔內黏膜細胞的 LD50 測試，粘膜的科激性和皮膚的毒性.過去的
研究指出，安氏試驗對於加有大鼠( rat )肝細胞代謝酵素(簡稱 S9 )
的試驗，有些結果呈陽性反應( Ame's positive )，但有些為陰性反應
( Ame's negative ) (4) 細萬學的研究發現， MMA 對 Salmonella typhmurium 是一種突變劑 ( mutagen) (幻.中國倉鼠卵巢細胞(
Chinese hanster ovary celll CHO )的培養研究指出，合或是不含 S9 的條件下與 MMA 作用發現隨著 MMA 濃度的增加 染色體異常和
姊妹染色分體交換( sister chromatid exchange I SCE )的頻率都隨
之增加的.
在細胞遺傳學( cytogenetic )研究中， CHO 細胞和 V79 細 胞為廣被使用的細胞株 (6) 由於 V79 和 CHO 細胞分，glj 具有不同的外
第二章材料與方法
2-1 試驗材科
各 1.1 試藥
名稱 廠將 庄地
1. BrdU
(弘 Bromo-2"“deoxyuridine) Sigma USA
2. Colcemid Gibco USA
3. DMSO(DimethyIsulphoxide) Sigma USA
4. FBS ( fetaI bovine serum ) Gibco USA
5. Fixation soIution
( Methanol : Acetic acid
=3:1 ) E.Merck USA
6. Giemsa Dye E.Merck USA
7. Hoechst 33258 , C25H24N60
.3HCI Sigma USA 8. Hypotonic soIution , 0.54% KCI E.Merck USA 9. MEM (minimaI
essential 臨ediu冊)Gibco USA 10. Methyl methacrylic acid
(品如1A)FIuka Switzerland
11. PHA ( phytahemaaglutinin ) Gibco USA
12. PSN
( peniciIUn , streptomycin , neomycin ) Gibco USA
2國1.2
為製方法
2輛 1.2.1 Medium preparation
1X Þ.位站直
90ml
+ FBS 10 % + l%PSN
1 口11
+ 9ml +
2圖 1.2.2 $i包製不同濃度民部位
取由 Fluka發司製邊的民品質A [CH"，:C(CH，..)COOCHJ，分子量2" -" ---3
100.12，密度為 0.943，濃度為 99% 的 Stock solution.
1. 2 ml MMA + 1 ml DMSO + 17 ml MEM
--一……一--9.32
x 102 mM MMA 2. 1 ml of9.32 x 10" 2 rr曲直 MMA+9mlMEM 一一訕訕-一-9 .3 2 x 10 ~ rr由1MMA3. 1 ml of 9.32 x 10 lrr曲直恥1MA + 9 ml MEM ---一
4. 1 ml of 9.32 x 10 O vrr也1MMA+9mlMEM ……一---9 .32 x 10 -.L rr曲直 MMA
5. 1 ml of 9.3 2 x 10 -1自由直 MMA+ 9 ml MEM ---9.32 x 10 -2 rr涵在 MMA
2個 1.2.3 Hoechst 33258 :588 祖gII of dist
,
Water588g/1 H
2 。
一一一一-- 1 mole 1M0.588 gl1 H
2
0 扭曲也… 10-3 M0.0588 g/100ml H
2
0…一一--100 ml 10-4M2闡 1.2.4 Fixation solution
Me出那101 3 part + Acetic acid 1 part
2-1.2.5. 2XSSC
1. Sodium chloride NaCl 8.75 g
2. Trisodium citrate 4.4 g ( C 6日SNa
3
07
.2H2
0)3. add Dist. Water to 500 ml.
2國1.2.6 Buffer solutio詛
0.88 % K
2HP0
4 + 1.01% KH
2P0
4
2闢1.3 儀器
1. Lamina flow: Bellco Glass Inc I(USA) 2. Incubator :
Fonna Scientific Steri申cult incubator
Temperature 37 oC7 RH con缸。167四99% (humidity)7 5% C02con缸。lled7 water胸jacketed incubator.
3. Incubator TC且 1 heat wanner
振盪回數 50HZll∞I/min (Shaking) 60 H Zl120/min.
4. Cen世fuge Hitachi (J apan)
Timean往 speed (x 1000 rpm) 5. UV light : Model UVLδ6
black且RayLamp, long wave UV咀366nm 115vol缸，60HZ，0.16 AM
Sau Gabriel CA 91778 USA.
第三章試驗過程
一﹒細胞的純化
V79 細胞株由中山醫學院細胞遺傳室所提供﹒首先將 V79 細胞
株作純種培養 (cloning )~方法如下 (7) •
1.取 1x10 5 個細胞 9 接種於培養瓶內， 細胞的培養液為 b位部直
(minimal essential medium, GffiCO; USA )，pH安定劑 BES [N.N咀
Bis( 2呻hydroxyethyl)-2申剖ninoeth組 sulfonic acid, Sigma; USA ]
及 Na
2
HC03
，加上的% FBS (fetal bovine serum )和 1% PSN ( penicillin , s甘eptomycin~ neomycin )，調整培養液的 pHiJ直為 7.2，將培養瓶放入 37 0 C 的自動恆溫， 5%CO 的培養箱 (Forma， USA
2
)培養 48 小時.
2. 取 0.1 ml之含 1x10 3 個細胞懸浮液種到含有 5 ml培養液的
直徑 60mm培養且內實前後左右搖動使細胞均勻分佈於培養且會培
養 7 天.
3. 於解剖顯微鏡下觀察有形成聚落的族群會在 dish 的底部作記
號，於無萬操作合中，再將進徑 1 cm 大的滅菌銅環( ring )底部沾已 滅商之甘油，蓋於所要的聚落上.
4. 以 1 血1之 PBS (寸( phosphate buffer saline) 中不合鈣和銀離 子，洗 2次後，加入 0.1 mlO.25% 蹺蛋白路(甘yps妞， GIBCO; USA
)，作用 3 分鐘書使 V79 細胞對離懸浮.
5. 以吸管吸取懸浮液，滴入含有上述1.的培養液的培養瓶內，
放入培養箱中培養3 天.
6. 依染色體製備方法實製作染色體，還取具有較多正常染色體數
目之群落中之細胞，作為本試驗的細胞.
二.1\品質A 濃度的決定
1. 多孔培養血的試驗 (6)
( 1) . MMA ( Fluka, Switzerland )以體積比如Iv) 的方式泡製 9 取 2 ml 的 MMA ( stock solution )溶於 1 ml 的
DMSO ( Sigma, USA )加入 17 ml 的培養液品位惑。會依序晶己製出下 列不同濃度的孔1MA:
A = 9.32 x10 2 mM, B = 9.32 x 10 1 mM, C = 9.32 x 100
n由哇，
D =9.32 x 10 -1 mM, E =9.32 x 10-2 mM, F =9.32 x 10-3 mM, G
=9.32 x 10 -4 mM, H = 9.32 x 10 -5 mM, 1 =9.32 x 1。而 H品生
( 2) .在兩組 24 孔培養血的每一小孔內 9 分別種入 0.1
ml 之 1 x105 cell/ml 細胞懸浮液，培養 1 小時後，再加入培養液
。.9 ml後繼續培養.
( 3) . 24 小時後，抽拌培養液依下面方式會將 MMA 加入
到各個培養孔內會 h位怯濃度(mM)如下:
A 組: 0, 9.32 x 10 舟， 9.32 x 10 -1, 9.32 x 10 0, 9.32 x 10 1, 9.32 x 10 2•
B 組: 0, 9.32 x 10 “6, 9.32 x 10 斗， 9.32 x 10 -2~
9.32 x 10 O~ 9.32 x 10 2
( 4) . 加藥 2 小時後，於位相差顯微鏡下觀察細胞的變
化.然後抽掉含有不同濃度之h品位培養液，以 PBS(-) 洗二次後，加
入新培養液置入島動二氧化碳培養箱中培養.
( 5). 48 小時後，將血肉的培養液吸出費用 PBS(寸洗二
次，以 Giemsa 染料加入 0.01 M 的 phosphate buffer 緩街液， pH
6.8，稀釋成的%染色液染色 5嘲7 分鐘書水洗後於室溫中乾燥.
( 6) .由培養JI1Z..內會細胞染色的濃淡程度，決定 MMA 的
使用濃度.
2. 細胞生長抑制試驗收eU growth i且hibitory test ) (6)
( 1) .準備 54 個 35 m臨的培養血，將之分為控制組 9
餌，試驗組 5 級各 9 個.
( 2) .同前述方法配製製孔1MA的各種濃度.
( 3) .將 1x10 4 celllml 之細胞懸浮液 0.1ml 稜入到各個
培養血肉會在 37 0 C, 5% CO
2, 98% 溼度的自動恆溫培養箱內培養
( 4) .24 小時後將培養且內舊的培養液吸出.控制組的
培養且加入不含 MMA 的培養液會試驗組分別加入不同濃度 9.32 x
1 阱，
9.32 x10弋 9.32
x10弋 9.32
x10弋 9.32
X10-
6等不同濃度之 h伯伯，再放入培養箱內培養.( 5) .於加入 MMA 後的第一天會第二天和第三天會每天
由控制組和試驗紅的培養旦中各取出 3 餌，利用 0.25% 月是蛋白勝處
理，使細胞懸浮，利用細胞計數器，在不染色的情況下會直接於位相
差顯微鏡下計數並計錄各種濃度的細胞數目.
3. 如脆悶著生存試驗 (ceH plating ef缸ciency test) (7)(8) :
( 1) .準備 90 個直徑 60m血的培養且會將之分為控制組
的餌，試驗組5 組各 15 個.
( 2)
.肉上述方法泡製各個不同濃度的M1\生A( 3) .每個培養且分 41] 種入的0個細胞.於 37 0C ， 5%
CO
2
， 98% 濤、度的自動怯混培養箱內培養 24 小時.( 4) . 吸拌培養液，分別加入下列不同濃度的 MMA,
9.32 x
1妒，
9.32 X 10-1, 9.32 X10弋 9 .32
x10弋 9.32
X 10-6m1\哇，於
作用 1 小時， 3 小時， 6 小時會 12 小時，和 24 小時後，將培養液吸拌，
以 PBS (-)洗 2 次會再加入新的培養液會放置於自動恆溫 J二氧化碳培
養箱中培養培養.
( 5) . 7 天後 9 吸拌培養液 9 以 PBS(-)洗 2 次會用 lω0%
的 Gi蛤ems錦a 染色液染色水洗之後
(6ω) . 利用解剖顯微鏡觀察每餌培養且中之細胞聚落數
4. 細胞染色體試驗:
( 1) .染色體異常( chromosome aberration ) (6,9,10) :
A.取 5個培養瓶(自ask) ，分成 a，b ， c ，d，k組，分別種入
1x10
5 celllml，於 37 0 C,5%
CO", 98% 濕度的自動恆混箱內培養2
24 小時.
B. 肉上述方法配製製不同濃度的孔岱1A.
C. 除去培養液，用 PBS 洗二次會控制組加入不合 卸臨仇的培養液會試驗組 a丸c ，d 分別加入含 9 .3 2
x
1 阱，9.32 x
10弋9
.32
X10
-4,9
.32
X10-
6 mM MMA濃度的培養液培養 24 小時.D. 在收集細胞胎紅vest)前 2 小時會加入 0.2 ml, 10uglml 的秋水仙素 (colcemid)於每個培養瓶內會使其最終濃度為 0.2
uglml.
E. 利用 0.25% trypsin(波蛋白梅)使細胞懸浮會放到離
心管內，於 150。中m 速度下離心 8 分鐘.
F. 除去上層液，加入 0.075M KCl
5
ml，作用的分鐘.
G. 離心會除去上層液，加入呂定液 (methanol
acetic acid
=
3: 1) 6 ml 作用 30分鐘曹再離心，去上層液.H. 依上述 G 的步驟，分$~讓自定液再作用的， 5, 5
分鐘後，離心，噴片-
1 將片子放於 45 0 C 的烘盤下會烘乾一夜，用 10%
Giemsa染色 5-7 分鐘 9 乾燥會於顯微鏡( Photo 111, Zei郎， We泣 Genn組y)觀察染色體.
J. 選擇分散清糙的染色體，予以照相-
K根據 S. Veni股份的染色體異常分類:
定義:裂隙 (gap): 染色體上沒有染色部份的大小，不大於染色
分體之闊的寬度.
斷裂(break:):染色體沒有染色部份的大小費大於染色分體
之間的寬度.
以每個分裂期細胞 (me阻phase) 具有相同染色體數爵的細胞
為標準，經顯微照相後，計數 1∞個分裂期細胞的染色體異常數
( 2) .姊妹染色分體交換試驗 (6.9.10)
A取 5個培養瓶 (flask) ，分成 a ， b 品， d和 k紹，分別種
入 1x10 5 celllmt 於 37 0C， 5% CO,." 98% 濕度的自動恆混培養箱內
2
培接 24 小時.
B. 闊前述方法也製不同濃度的孔品生A.
C. 除去培養液，為 PBS(寸洗 2 次， 控制組加入不含
h必佳A 約新培養液，試驗組 a丸
9.32 x 1昀0-
弋，牙和口
4 9 .32 x 1ωO也必6 mM MMA 濃度的培養液，培養 24 吐小、時.D.加入0.2
ml BrdU (5且bromodeoxyuridine )於每
個培養瓶肉，放入暗袋暗置於培養箱內，培養 25 個小時.
仙素.
E. 於收集細胞染色體看守 2 小時，加入 0.1 ml 的秋水
F. 肉上述染色體製備方法作品染色體.
G
(σ2.94 臨g/5臼n剖1) 的 j溶容液內 1昀O 分鐘.
H.取出片子，放在 265 mm UV 光的箱內，照射 2 小時，
此時片子須於緩街溶液 (0.88% K~HPOA 2--- - 4 + - 1.01% - - - - KH...POJ 下保釋、- - - 2 照光.
1.將片子置於2 倍 SSC
(NaCl
+ Na3
C6
日s07. 2H20
)的溶液肉 ，於 65 Oc 的加熱箱內，加熱 50 分鐘，取出，烘乾， 以 10%的
Giemsa 染色7 分鐘.
J. 依 S.Venitt(6) 的方法選取每飽分裂期細胞的染色
體數目相同的細胞，計算的0 個分裂期細胞的染色分體交換次數，利用
paired t test 方法統計分析差異.
第四章 結果
一.細胞的純化
篩取由細胞純化後的 V79 細胞其染色體數目為 22 的聚落，作為本研 究的細胞樣本.
二.多孔培養JI1Z.試驗
在控制組和低於 9.32 mM MMA濃度的組 (well)，均有紫色的染 色出現，代表在這濃度下的細胞有存活〈園一).由此決定本試驗加入
b俱佳A的最高濃度為 9 .32 mM.加入 h品生A後， V79 細胞外彤的變化(國
-=-
)，聽二A為控制組未加~位的細胞.鹿二B為加入 9.32 X 10-2 mMb也做後的情形細胞的外形較控制組細胞外形變得較短，即紡垂形轉變
為較精圓形.國二C為加入 9.32 X 102 mM 的 b品位A 此狀況下的細胞 大多已死亡懸浮.
三三. V79 ‘細胞生長抑制試驗
試驗組與控制組相比較，當 MMA濃度大於或等於 9.32 X 10-4
nM時，細胞的生長有明顯的被抑制 (p<0.05); 從加藥後到第二天(即
Day 2 到 Day 3) ，細胞生長增加的量，濃度高的 (9.32x100 mM)由
(12xl04個細胞增加對 35xl04個〉為比正常組(由33xl04個 增加封
的xl04個)或是低濃度(9.3
2x 1 0-
6 mM)組由 (27xl04個增加封 62xl04 個〉似乎增加較多;而 Day 3 封 Day 4，細胞生長增加的量，所有的組則相近 (Table 1 ，國三).
四. V79 細胞附著生存試驗
V79
細胞對不同濃度和時間的作用，主隨著時間的增加和濃度 的增加，聚落的形成漸減少.濃度高的 (9.32xl0
0 mM)短，於加藥作用 1 小時後，相對的附著生存率為控制趣的 63.6% 而作用 24 小時後，只為
17.4%; 9.32 xl0-
1 mM 組於加入111\位後 1 小時後開始減少為 8 1.7%，而作用 24 小時後，只為 2 1.7%; 9.32 xl0-
2 mM組於加入h位也A 後 3 小時後時始減少為 75% ，禹作用 24 小時後，只為 47.8%;9.32
xl0融 4mM組於加入卸血仇後 3 小時後開始減少為 9 1. 7% ，為作用 24 小時後，只為 39.1
%; 9.32 xl0-
6m
M組於加入l\1r\在A後 12 小時後時始減少為有裂隙和染色分體斷裂的狀況 未見其他類彤的異常.控制組的染色
體異常只見到裂隙試驗是且除9.32 X 10-6 mM組除外兵餘均有裂隙和 斷裂的出現.當濃度高於9.32 x 10-4mM時，作用 48 小時後，染色體異 常結構的數目有明顯的增加趟勢 (p<0.05) (圈五，Table 3.).
六.染色分體交換試驗
濃度為 9 .32 X 10-4 和 9.32 X 10-6 mM 組與控制組對於姊妹染色 分體交換的頻率不具有統計學上的差異.當濃度高於9.32 X 10-2 mM
以上時，作用 49 小時後，姊妹染色分體交換的頻率才具有統計學上的意
義(國六， Table 4).
第五章討論
品位生A 單體本身不溶於水困比利用 DMSO 作為輔助溶辯.
Stenchever (11) 等人指出，如果 DMSO 的濃度大於 1% 時會對細胞的
生長產生延邊的現像. 本研究中在 MMA 濃度為 9 .32 x 100 mM 時
DMSO 的最終濃度為 0.05% 己小於 1%. 在 24孔血的試驗結果，
Giemsa 的染色程度發現 9.32 X 101 mM以上民也使A濃度，細胞均已 死亡.昆此採用 9.32 x 100 mM MMA 為試驗的最高濃度.對於瓦那在A 製作的從業人員而言，接觸 MMA 屬於長期的接觸，因此在藥物的作
用時問長短考慮上 採取至少讓細跑生長都經過1.5 個以上的細胞生
長週期 (6)
Zeiger (1 2) 等在試管外的研究指出，在合或是不合 S9 的 TA100，
Borzelleca (15) 等使用 MMA濃度高達 2000 ppm 的水給大鼠。at)連 續喝 2年， 結果並沒有困藥物引起的病變出現 (compound related
lesion). 在動物皮膚的塗抹研究， Oppenheimer (1的等發現，每週塗抹 MMA3 次，連續 4個月，在這些動物的皮膚上並沒有局部腫瘤的產生.
但是在老鼠和大鼠的皮下植入經過聚合後的 MMA， Lavorgna 仰等和
Laskin (18)等則發琨會有局部的纖維肉瘤 (fibrosarcoma) 產生.
Chang (1 3) 在中國倉鼠的卵巢細胞 (CHO cell) 與孔1MA的濃度研 究指出，在含有 S9 的情況下， MMA(500咀 1250 pg/ml)會對 CHO 細胞
產生一種異常的反應，此反應與辯:量有相關性悅。se related). 當 S9 不
存在下， MMA (750個3000 pg/ml)也會增加細胞染色體異常蹺，象.
Anderson (1 4) 等研究 Rat bone marrow 的細胞染色種變異，怒為 b品位不具有劑量相關的蹋靜、.本研究在孔岱蝕的濃度 9 .3 2 x 100 mM ( 9.34 X 102 pg/ml) 時，作用 3 天後，發現對 V79 細胞的生長產生抑制作 用;作用 48 小時後，染色體異常和姊妹染色分體交換頻率均有增加， 結
果與 Chang 的結果相近.
Carolyn (19) 等指出 MMA造成細胞染色體斷裂位還是在染色分 體上，對於細胞染色體數目是沒有改變的.一般而言，染色嫂的異常分
類可分為結構上和數自上的異常〈的.結構上的異常會出現裂隙 (gap),
斷裂 (break)，雙中心結 (dicentric) 和國形染色體 (ring)等.數目上的 異常以出現多套體 (hyperdiploid) 時較為有意義. 染色體的斷裂可以來
自自發性或是致突變劑的誘導;斷裂的時機可能在有絲分裂或無絲分
裂中的 Gl ， S ， G2 細胞過期;斷裂的機制乃由於DNA上有某些傷害的
產生，而這些傷害的來源可能是鹿為化學藥物， UV光或是輻射線的作
用，形成密吃雙體 (pydimidine dimer), Base al勾rlation等 .DNA在進
行合成作用中，傷害的為位置可能會進行修補或是錯誤修補，如果修
補失敗，在染色體結構上即出現異常.染色體斷裂的情形，如果是發生
在 DNA合成後之時期 撕裂的頻率會減少.染色嫂的斷裂可能只有 1
個染色分體斷裂或是2個染色分體的斷裂，前者稱之為 chromatid
有多套體.由於本研究未作染色體的層帶染色 (banding)，因此無法判
斷是否同一隻染色體發生異常此有待再研究.
在 100餌分裂細胞的研究中，當濃度為 9.32 x100 mM (9.34 x 102
戶
g/ml) 時會作用 48 小時後， V79 細胞染色體斷裂數目有 16個Morre (20) 等的研究結果指出，當l\1f\，仇濃度為 2800 ug/ml 時，作用 24 小時後，在 200個 CHO 分裂細胞的分析中，出現 45 個染色體異常，
二者結果相似.
姊妹染色分體的交換，乃是由於5巾的modoxyacridine進入封細
胞內，因其化學結構類似細胞的胸腺密可支付lymidine，簡稱 T)，所以在 細胞進行複製時 BU 就混入到 DNA 的結構中此時染色體以 BU取
代 T，進行一次的 DNA稜製 之後每一條染色分體的雙成 DNA 中會
有一般含有 BU，即形成 BT. 如果細胞繼續以 BU取代 T，進行第二次
的被製，則用一條染色體中的染色分體 DNA會形成 BT和 BB. 以核酸
的發光染料 H33258 作用會在瑩光顯微鏡下發現含 BT 的染色分體呈 現亮的反應，而含有 BB 的染色分體呈現暗的反應 (20 ， 2 月.利用染色分
體交換的頻率可以研究高等生物細胞內遺傳物質受傷的一稜指標.
h部位與 CHO 細胞作用隨著 MMA 濃度的增高姊妹染色分體
交換的頻率增加 (22) Morre (22) 等發現，尤其當 MMA 的濃度為 5
mg/ml 時，染色體異常數目增加最多. Bigatti (2月以人類的淋巴瘤細 胞株和 polymethyl methacrylate bone cement (PMMA)作用，結果顯
示二者之問並沒有統計學上的差異. Carolyn (19) 等的報告，怒為NIr\位 和 CHO 細胞作用會增加 SCE 的頻率﹒為對於染色體數目則沒有改變
Marez (2) 等對於h位也A和臼去。細胞的作用，不論是否含有 S9 的條件下，
孔俱佳A作用 24 小時後，在加 Brdu 25 小時 SCE 交換的頻率都呈明顯
的增加.本研究 MMA 與 V79 細胞作用，不含 S9 的情況下，當~且
濃度達 9.32 X 10-2 mM 以上時扎位在A作用 24 小時後會在加 Brdu 25
小時，姊妹染色分體交換的頻率在統計學上，亦有明顯的增加.
宗主吉吾
本研究結果顯示 MMA對於 V79 細胞的生長，聚落的形成 都隨時間的增加產生與濃度相關的抑制作用 對於染色體異常的結果
發現， MMA對 V79 細胞作用後，會使得染色體斷裂數目增加，姊妹染色 分體交換的頻率增加此結果與 MMA作用於 CHO 細胞的結果相似.
國此，我們認為 MMA 對於 V79 細胞具有細胞遺傳毒性與致突變性.
至於瓦拉生A作用在人類正常細胞的變化 以及從業人員長期接觸後的反
應和受傷的細胞在分子基因學上的變化將會是要再研究的問題.
第六章麗與表
Table 1. The growth of V79 cell treated with 品質MAa
Concentration Day 1. Day2. Day3. Day4.
(mJ\1 )
。
10 + 0.85 33 + 2.08 67+2.05 124 + 8.18 9.32 X 10-6 27 + 2.49 62 + 2.83 112+5.31 9.32 X 10-4 23 士 2.86 53 + 3.68 98 :t 9.39*
9.32 x 10且2 21 + 2.05 54 + 2.87 104 + 4.54
*
9.32 x10 -1 18 + 1.69 48 + 0.94 80 + 2.62
*
9.32 x10 0 12 + 3.26 35 + 3.09 67 + 2.49
*
a: Me胡士 SD x 10.... cells for three plate in each different 4
concentration
*: signi缸C卸lt at p<0.05, compared with con甘01 group.
Table 1 圖 1 . Teh cell growth data of V79 ceHs after treated with different concentration of 1\宜MA in each 57 plates.
Group Day 1. Day 2.
con甘01 10 36
9 31
11 32
Me缸1+SD 10.3+0.85 33.4 + 2.08 9.32 x10-6 28
30 24
Me缸1+SD 27.3+2.49
9.32 x10-4 27
20 24
h在e缸1+ SD 23 + 2.86
9.32 x10-2 19
24 21
Mean +SD 21+ 1.69
9.32 x10-1 16
20 19
Me缸1+SD 18 + 1.69
9.32 x100 12
16 8
mean+SD 12+3.26
unit of cell number: xl04
in each plate unit of concen佐ation: 虹品生
Day 3. Day4.
65 134
67 114
70 125
67.3 + 2.05 124.3 + 8.18
64
11258 106
64
11962 + 2.83 112+5.31
一
53 99
49 110
58 87
53 + 3.68 98+9.39
55 103
51 110
58 99
48+0.94 80 + 2.62
47 84
49 78
49 79
48+0.94 80 + 2.62
38 65
31 71
37 67
35 + 3.09 67+2.49
Table 2. The plating efficiency of V79 cell treated with Ml\宜A.
Concentration 1hr 3hr 6hr 12hr 24hr (mM)
。
1∞% 100% 1∞% 1∞% 1∞%0.00000932 1∞% 100% 100% 70% 60.9%
0.000932 100% 91.7% 84.6% 70% 39.1%
0.0932 1∞% 75% 84.6% 55% 47.8%
0.932 81.7% 75% 76.9% 50% 21.7%
9.32 63.6% 58.3% 61.6% 30% 17.4%
Table 2國 1 • The colony formation n阻mber fo V79 cells treated with different concentration of MMA in each plate. a
group lhr 3 hrs 6 hrs 12 hrs 24 hrs
control 10 12 12 15 15
9 14 13 14 13
11 11 10 16 17
mean+ SD 10 + 0.82 12 + 1.25 12 + 1.25 15 + 0.82 15 + 1.63
0.00000932 12 15 10 9 7
(mM) 9 10 16 13 10
9 12 10 8 11
mean +SD 10+1.41 12 + 2.05 12 + 2.83 10 + 2.16 9 + 1.70
0.000932 10 11 10 12 5
(mM) 9 12 10 10 6
11 .10 11 11 6
mean +SD 10 + 0.82 11+0.82 10+0.47 10 + 1.24 5 + 0.47
0.0932 10 9 10 8 7
(mM) 8 7 9 9 6
12 11 11 7 8
me缸l+SD 10 + 1.63 9 + 1.63 10+0.82 8 + 0.82 7 + 0.82
0.932 8 9 9 7 3
(mM) 9 9 8 5 4
8 9 10 9 2
mean+SD { 8+0.47 9 + 0.00 9 + 0.87 7 + 1.63 3 + 0.82
9.32 6 6 7 4 2
(mM) 5 6 9 3 1
7 8 5 5 3
mean+ SD 6+0.82 7 + 0.82 7 + 1.63 4 + 0.82 2 + 0.82
a:Me缸1+SD.
unit : colony/plate
Table 3. Chrom.osom.e aberratons of V79 ceU after treated with
h伯質A.a
Concentration (mM)
O
0.00000932 0.000932 0.0932 9.32
Total cell count Break Gap Total
100
。
5 5100
。
30 30100 4 19 23
100 8 25 33
100 16 26 42
aberration
0.05 + 0.22 0.30 + 0.54 0.23 + 0.49 0.33 + 0.55 0.42+0.57 a: Metaphase cells with aberration were scored from 100 well spread
metaphases, value are Mean 士 SD.
* :
Significant at p<0.05, compared wi也 controlgroup.*
*
*
*
TabIe 4. Sister chromatid exchanges (SCE) of V79 ceU after treated with 品質島宜Aa
Concen缸ation Total metaphase TotalSCE Mean 士 S.D I metaphase
ug/ml count number
。
100 268 2.68 + 1.660.00000932 100 293 2.93+2.03
0.000932 100 308 3.08+2.33
0.0932 100 520 5.20 + 3.62
*
9.32 100 627 6.27 + 4.31
*
a: Metaphase cells with aberration were scored from 100 well spread metaphases, value are Mean 士 SD.
* :
Sig剖fic即lt at p<0.05, compared with control group.A
睡
c
間二 V79 細胞的形態
A. 控制組 B.O.0932 mM組 C.932 mM組 (位相差顯微鏡 200X)
mM
0 - 0
A 呵 0.00000932 口自 0.000932
/了/ dÍ~
100
50
( 吋
o
F吋
x
U可 F可
hHω已品ω刊句話語
mM
• - 0.0932 mM
Â"'0.932 mM
曲曲 9.32 mM
的叫什ω。 10
斗4
O
5
-MωAgDZ
1
72 24 48
-24
。
of MMA
addition after
Hours
treated
MMA.
of
af七 er
concentration of V79
growth with different
cel 工
3. The Figure
麗的@ 於細胞聚落形成試驗中 V79 細胞漿落的形成情形
100
y t - k k \合〉司之巨___y.~
37.\\﹒----~、口
\.---111\\.
H吋〉叫kfhH口的
dP OAD--
1 hour 3 hours 6 hours 12 hours 24 hours
•
圈五. V79 細胞的染色體 A. 正常染色體 B. 異常染色體
贊頭處為斷裂位置( Zeiss 顯微鏡的∞X) .
..
Topic 1. Th e Cytoto :xi city of l\笠ethyl
Methacrylic Acid in C討如red V79 Cells
Abstract:
Methyl methacrylate (MMA), a liquid monomer, is used as a chemical intermediate in the manufacture of plexiglass and other acry lic products 缸ld as bone cement in orthopedic an往往ental
pros出esis. Cytotoxicity of MMA on cu1tured Chinese hamster lung fibroblast V79 cell was performed. The data were analysed by paired t-test. The cell growth were inhibited above 9.32 x10-4mM concentration of MMA employed in this study ，缸ld the colonies forming ability were 述。 se and time dependent1y decreased with MMA employment and period of treatment. In chromosomal aberration study, as the MMA concentration increased from 9.32
x10-
6 的9 .32
x 100 mM, the number of chromosomal aberrations was increased. The frequency of sister chromatid exchange was significant1y difference (p<0.05) 的 9 .3 2 xl0-2 and 9.32 x100 mMconcen甘ation of MMA. The resu1ts of this study show that Ml\在Ado have cytotoxicity to V79 cells.
Key words:
Me由ylme也ac可rlate， Chromosmal aberration, Cytotoxicity
第七章參考文獻
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第二篇 Methyl methacrylic acid 對人類淋
巴細胞的毒性研究
摘要
第一章緒論 (Introduction )
電且峙，恥ζJ「。一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一
第二章材特與方法( Material and Methods )一一翩翩一一一一一一一一一切 2- 1.試驗材料
2- 1.1.試藥 2岫 1.2. )包製方法
2-1.3. Medium
一翩翩一一一一一一一一一-55
一一呵呵巴巴巴一-一呵呵一一一55
一一一一一一一--55
一一呵呵呵且一一呵呵呵一一 56
2-1.4. MMA (methyl methacrylic acid) 也呵呵呵自由呵呵呵呵一一--56
2-1.5. Hoechst 33258 一---一--56
2儡 1.6. Fixation solution 呵呵呻-且也自呵呵呵扭扭曲目 57
3-2. 血清有無對加藥後染色體異常之試驗 (chromosomal
aberration test with or without serum ) 目申咱一一---冒個喃喃扭扭62
3-3.姊妹染色分體交換試驗( Sister chromatid exchange test )---62
第四章結果
4帽1.染色體結構異常試驗( Chroomosoome aberration test )一--65 4-2. 血清有無對加藥後染色體異常之試驗 (chromosomal
aberration test with or without serum ) 扭曲間喃喃間65
4岫3. 姊妹染色分體交換試驗( Sister chromatid exchange test )…的 第五章 討論 一一一呵呵呵呵一一一 ---66
第六章 屬表 呵呵呵一--呵呵呵一一呵呵呵--自呵呵呵 --71
表一淋巴細胞在不同濃度品位做作用後染色禮兵會之數目 -71
表二淋巴細胞在合與不含血清和不同濃度孔位也A作用後，染
色體異常之數目 一一自由呵呵呵間由自由呵呵-一一呵呵呵一一 72
表三淋巴細胞在不同濃度~位作為後姊妹染色分體交換
之數目 ……一一一一扭扭扭曲喃喃闖一一個扭曲……73
圈一淋巴細胞染色體其常一由自由呵呵呵呵呵一血呵呵呵呵呵且也呵呵呵-且 74
圈二淋巴細胞姊妹染色分體交換一……一一圓圓圓圓圓曲"四"一個一75
第七章 參考文獻 一一呵呵呵呵呵呵呵呵呵一一一一呵呵呵呵由自由自由 77
搞要
由第一部份的試驗得知 Methyl methacrylic acid (MMA)
對 V79 細胞具有拘傳毒性.目比在體外(扭 vitro )，我們利用人類
淋巴細胞為材科會直接和其位置A 接觸作用.觀察其細脆的染色體
變化.結果得封當的濃度大於 0.932 mM 時會染色體悶隙 9 染色
分體斷裂和姊妹染色分體交換的數詩都呈明顯增加 (p<o.o的﹒我
們推論 MMA 對於人類的淋巴細胞可能具有致突變性
(mutagenicity).
第一章緒論
整形外科手術所使用的生物相容性材科壓克力樹脂 9 其主
要的成份為 Polymethyl methacrylic( 簡稱 PMMA~ CAS NO.9011-4咱 7)，這種材料使用於整形外科手術 p 至今已有 30年以上 (1) 在牙科義當
床製造和樹脂填補材料中，亦有使用封這種單體 (monomer) ，其成份
為 methyl methacrylic acid 簡稱 MMA. 在眼科治療中 9 軟形鏡片
(soft in甘aocular lenses) 的成份也是屬於這種單體 (2) 單體的成份，除 醫療方面的使用外 9 於自常生活中使用的食物包裝材料費建築用的油
漆等費也都含有 MMA 的成份 (3) ﹒
早期在牙科使用義齒沫的材質屬於自動聚合的材料費它與光聚
合的材科比較會發現在聚合後，自動聚合的材質會有少許的單體殘存
的.有更多的報告指出，單體會使牙科技工和牙醫師產生過敏性反應.
Stevenson(5) 和 Moody(6) 提出單體會造成牙醫師的手過敏會濕疹和接
觸性皮膚炎. Stoy (7) 的報告別指出牙科技工接觸到草種後會會產生局
部的皮膚炎. Hollander 和 Kenedy研究牙醫師手部的皮膚，以 Patch
test檢測手部殘存的自動聚合樹脂，發現，有強烈的陽性反應 (8). Pegum
和 Medhurt指出會整形外科醫師的乎有皮膚炎，乃是由於單體會穿通
所戴之手套之故，他將之稱為 "rubber-glove四dermatitis，，(9)
在體外細胞的試驗發現會 h且在A 會造成中國倉鼠卵巢細胞
(Chinese hamster ovary cell 簡稱CHO)<lO)與中國倉鼠肺臟纖維母細胞
( Chinese lung fibroblasr cell 簡稱 V79 )<11) 的染色體異常和姊妹染 色分體交換的頻率增加. Morre 等研究L5 178Y老鼠(mice) 的淋巴瘤細
胞與 Acrylic， methyl acrylate, e由yl acrylate, methyl methacrylate
和 ethyl methylacrylate 的基自毒性會發現細胞的突變率會隨濃度的
增加而增加 (doserelated)(12). Do甘e 等的研究中會發現 MMA會造成
L5 178Y細胞株產生小核 (microneuclear)和染色體異常( 1 3 )試管培養 細胞株和 MMA 作用，在含或是不含 S9(rat的肝代謝梅)的培養下會發
現染色體異常和姊妹染色分體交換的頻率都主明顯的增加 (3)﹒
只於呼吸系統上皮發現封發炎，退化和增生的現象 (14) Tensy 等研究
發現實在 116 ppm (47560pg/ml) 的蒸氣會每自?小時，每過 5 日 9 連 續 6個月讓雄性大鼠 (rat)吸入，結果發現氣管上皮的纖毛發生制落實 上皮微絨毛數目減少(1 5) 而 Merez 等發現展克力工廠工作 p 接觸
h您在A 的 L 人，其染色分鐘互換的頻率有明顯的增加 (3)
水中加入弘俱佳A給予老鼠 (mice)飲用的研究會 Borelleca 等指出 9
2000ppmMMA 濃度給老鼠飲用 2年， 結果並沒有發現由引起的器官
組織傷害出現 (16) 在皮膚塗抹試驗中會 Oppenheimer 等指出在老鼠
的皮膚每過 3 日會連續個 4 月塗抹b部位會結果發現在塗抹區並沒有局
部腫瘤的出現(1 7) 經過聚合的樹脂，經皮下植入後，發現在老鼠命的
和 mice)植入監部位有局部的纖維瘤出現。 8 ， 19)
本篇的研究動機乃基於會牙醫師與技工在工作上會甚至病人會
常會接觸到 MMA 材料，為過去的研究報告對於 MMA 和正常人類
淋巴細胞的直接作用結果則很少.國此想了解 b岱且與正常的人類淋
巴細胞作用後，細胞的染色體異常情形 以了解 MMA對於人類的淋巴
細胞是否為一致突變對 (mutagen).
第二章
材料與方法
2-1 試驗材特
2-1.1 試藥名稱 廠將 產地
1. BrdU (5- Bromo-2"-deoxyuridine) Sigma USA
2. Colcemid Solution Gibco USA
3. DMSO (DimethyIsulphoxide) Sigma USA
4. FBS ( fetal bovine serum ) Gibco USA
5. Fixation soIution
( MethanoI : Acetic acid
=3:1 )
E. 其1erckUSA
6. Giemsa Dye E.Merck USA
7. Hoechst 33258 ,
C25H2是N60.3HCLSigma USA 8. Hypotonic solution , 0.54% KCL E.Merck USA 9. MethyI methacrylic acid ( MMA ) Fluka Switzerland
10. PHA ( phytahemaaglutinin ) Gibco USA
2嘲1.2
?色製方法
2-1.2.1 Mediu朋 preparation
RPMI-1640 + FBS 10 % + I%PSN
90ml + 9ml + 1 ml
2闡 1.2.2 $1包製不同濃度晶晶他
取由 Fluka~ 司製造的島位直A [CH_:C(CH，JCOOCH，J會分子受2- - .... 3' - - 3 100.12，密度為 0.943，濃度為 99% 的 Stocksolution
.
L 2 ml MMA + 1 ml DMSO + 17 ml
RPMI-164。一一一一-932xl02nbfbafA
2. 1 ml of 9.32 x 10'" 2n曲直
MMA+ 9 mlRPMI-164。一一一 ...
932xmh為1: MMA
3. 1 ml of 9.32 x 10
lrr品1:
MMA + 9 ml RPMI-1640 ……..-932x loon也1:J\.岱在A
4. 1 ml of 9.32 x 10 on由1: MMA + 9 ml RPMI-1640 一……9.32 x 10 -ln品1: MMA 5. 1 mlof 9.32 x 10 -ln岱1: MMA+ 9 ml RPMI-1640 ……--9.32 x 10 -2mM MMA6. 1 ml of9.32 x 10-"-2 mM MMA + 9ml RPMI-1640 一一喃喃9.32 xl0-3 n品1: MMA
7. 1 ml of 9.32 xl0--> -3 n也1: MMA+ 9 ml RPMI-1640 …一---9.32 x 10 -4 mM MMA
8. lmlof 9.32 x 1昀O--'n岱1:欄4 MMA+ 9 ml RPMI-1640 申……岫…間且……一…-凶幽幽吵幽幽幽
9. lml of 9.32 x 10-5 口熱1: MMA + 9 ml RPMI-1640 -一一--9.32 xl0 -6 mM MMA
2-1.2.3 正直oechst 33258 :588 ug/l of dist，耳Vater 588g月 H
2 。 一一
--自圓圓圓 1 mole 1 M0.588 g凡 H
2
0 圓明明白自0.0588 g/lOOml H
2 。一一一
--100 ml0.00588 g/100 ml H
20 5,88 mgl100 ml H
20
0.00886 g/l50 ml H
20
0.00294 g/50 ml H
20
2圖 1.2.4 Fixation solution
Meth剖101 3 x + Acetic acid 1x
2圖 1.2.5. 2XSSC
1. Sodium chloride N aCl 8.75 g
2. Trisodium citrate 4.4 g (CLH""Na6--5-~-3 .,0 "7.2H...O)
10-3 M
10-4M
10-4M
10-4
孔
f10-4M
2間1.3 儀器
1. Lamina flow: Bellco Glass Inc (USA) 2. Incubator :
Fonna Scientific Steri四cult incubator
Temperature 37
oc
, RH con缸。167-99% (humidity), 5% C02con甘'Olled， water-jacketed incubator.3. Incubator TC咀 1 heat wanner
振盪田數 50HZl100/min (Shaking) 60 HZl120/min.
4. Cen佐ifuge Hitachi (J apan)
Time and speed (x 1000 rpm) 5. UV light : Model UVL-56
black喘RayLamp, long wave UV帽366nm
115volts,60HZ, 0.16 AM Sau Gabriel CA 91778 USA.
第三章材特與方法
3國1.樣本的收集與培養浪的也製
樣本的來源為取自中山醫學院5名健康的男學生，平均年齡 20岫
(20)
30歲，每位抽取的m1的全血，作淋巴細胞的培養.方法如下
1.用 10 ml 的注射筒，內加 0.2 ml 的抗凝血熱 (hep但n) ，
抽取周邊血液各 10 ml, 混合均勻之後 p 豎立靜星 3 小時會至注射筒 內的血液上層澄清.
2. 培養液的配製:將 RPMI-1640培揍液加入的申 15% 的牛
血清 (fetal bovine serum)及 1% penicillin, streptomycin和
neomycln.
3. 準備培養瓶 9 內裝的 9.4 ml培養液，將上述的注射筒經
輕的搖動會將針頭轉折成倒 V形會慢慢的將上層液推出 0.6 ml 注入培養
3輛2. 軒昂1A作用於人類正常淋巴細胞的染色體異常試驗
1. 肉上述 3 仕步驟 1-3 ，在步驟 3 ，將之分為試驗組
a丸C，社試管和對照是flk試，管.各試管內分別加入0.15
ml Phyto- hemag
l1utinine
(簡稱PHA)及培養液會血液，培養 24 小時.2. 配製不同濃度的，方法如下:
MMA (Fluka
, Switzerland) 以體積比你/v) 的方式 泡製，取 2 ml 的 MMAi容於 1 ml 的 DMSO( Sigma
,USA
)加入 17ml 的培養液偎PMI-1船0) ，依序泡出下列不同濃度的 MMA:A
=
9.32 x10 2mM
, B=
9.32 x101 扭曲症， c =
9.32 x10
0 扭曲哇， D
=
9.32 x10 幅1~哩， E=
9.32 x10 -2 ~哇， F=
9.32 x10-3 mM.鐘.
a丸
3. 由培養箱中取出培養瓶會在 1500 rpm速度下離心 8 分
4. 除去上層液會 k瓶加入不合藥物的新培養液，試驗#組且
E缸
m芷nM的孔岱f臥A ，再產入培養箱內培養45 小時.
5. 於採收細胞胎紅vest)前 30 分鐘會加入 0.2 ug/ml 的秋水仙
素 (co1cemid)於各個培養瓶內，混合均勻-
6. 將培養瓶內容物倒入離心試管會於 1500 rpm速度下離心
8 分鐘，除去上層液.
7.取 0.075 M (56%) 的 potassium chloride (KCl)10 ml
,
加入各個試管內，在 370C度的水浴下作用 10 分鐘.
8. 盡於 1500rpm速度下離心 8 分鐘，除去上層液.
9. 加入的 ml的圈定液 (Fixer~ Methanol Acetic acid = 3: 1 )作用 30分鐘 p 於 1500rpm速度下離心 8 分錢，除去上層液.
10.加入的 10 ml 固定液作用 10 分鐘會離心 8 分鐘，除去上 層液.
1 1.加入的 10 ml 國定液作為 5 分鐘書離心 8 分鐘會除去J:.
層液.
12.加入的 10 ml 自定液作用 5 分鐘會離心 8 分鐘 p 除去上
層液.
13. 準備玻璃片 (Slide) ，作染色體潰片之製作.
定義:裂隙 (gap): 染色體上沒有染色部份的大小，不大於染色 分體之間的寬度，
斷裂 (break): 染色體沒有染色部份的大小，大於染色分 體之闊的寬度.
3岫2. 1\位直A作用在含或不合血清培養的淋巴細胞試驗
方法向上述的步驟，唯一差別是在步驟于 1-2. 培養液的製 備會一組加有含 10%FBS 的血淆，而另一經則不加血清 .MMA 的
試驗濃度 9.32 x 100 mM，觀察其染色體的變化.
3 岫 3. MMA典人類正常淋巴細胞作用的姊妹染色分體交換試驗
(19).
1.採血方法和淋巴細胞的培養，如同上述 3-1 步驟.
2. 於加入 MMA後的 24 小時，加入50uM 的 BrdUra (5咀 bromodeoxy服idine)於各偽培養瓶內會將之暗置於5% CO
2, 98%
溼度， 370C 的自動桂混培養箱內培接 40 小時.
3. 於收集染色體前 30 分鐘曹加入的 0.2 ug/ml秋水仙素
。. 1m!' 於各個培養瓶內.
4. 將培養瓶內容物倒入離心試管 9 於 1500 rpm速度下離心
