(一) 白色來亨雞端粒酶基因互補 DNA (complementary DNA, cDNA) 的 選殖
1.白色來亨雞原腸期胚之顯微抽取、RNA萃取與反轉錄-PCR (reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)：白色來亨雞的雞蛋經過 18 h 孵化，此 時雞胚發育至原腸期，再利用顯微操作取出雞胚 (圖 1)，萃取總 RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen) 供進行 RT-PCR。RT-PCR 的反應體 積為 10 µl，內含雞胚之總 RNA、RT 緩衝液、SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen, CA) 、 Oligo (dT)12-18引 子 (Invitrogen, CA)、DTT及 RNAsin (Promega, USA)。反應條件為 42℃
1h。製備的 cDNA 即可供 PCR 選殖基因之用。
2. PCR及膠體電泳分析：以原腸期雞胚萃取的總 RNA 反轉錄的cDNA 做為模板。參考 NCBI 網路資料庫中家禽端粒酶基因全長 cDNA (access no. AY626231) ， 該 段 序 列 為 雞 (Gallus gallus gallus) telomerase reverse transcriptase (TERT) 基因 cDNA。應用Vector NTI 軟體設計選殖雞端粒酶基因全長 cDNA之引子，sense primer：
GCTGCGTGCGGGGATGGA 、 antisense primer ：
AACAGGAAATGCAAATATACCAAG 。 進 行 PCR (i Cycler ， Bio-Rad ,USA） 擴增出 4,799 bp 片段產物。PCR 反應液含有 10 µM的 sense 與anti-sense引子各 1 µl、Taq DNA聚合酶 0.5 µl (5 U/µl) (Roche, Germany)、10× PCR buffer 3µl、2.5 mM dNTP 0.6 µl及
ddH
2O 22.9µl ， PCR 反 應 總 體 積 為 30 µl 。 PCR 條 件 為
denaturation：94℃ 2 min，之後進行 30 次循環 94℃ 15 s、68 ℃ 30 s、72℃ 2.5 min；72℃ 7 min，反應後保持在 4℃。進行膠體電泳分 析時，取 10 µl PCR 產物，加入 2 µl的 6× Loading buffer，置入 2 % 瓊脂糖 (agarose) 膠片內，於 0.5× 的TAE (Tris-Acetate-EDTA) 液 中進行電泳，條件為 100 Volt 30 min。電泳後將膠片置入染液 [0.5×
的TAE內含 0.1µg/ml 的溴化乙錠 (ethidium bromide)] 中染色，並 於紫外燈箱上觀察並記錄結果。
3. DNA 片段回收與選殖、DNA 與轉譯胺基酸序列之分析與比對：選 殖之 PCR 產物，應用序列分析儀 (ABI 3730) (Applied Biosystems Inc., CA) 進行 DNA 序列分析。完成 DNA 序列分析後，利用 Vector NTI 軟體或網路資料庫 NCBI 中的 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 進行序列比對或轉譯為蛋白質之胺基酸序 列，以了解選殖基因的正確性並比較網路資料庫中相似的基因或蛋
白質序列。
(二)白色來亨雞端粒酶基因啟動子區域之選殖
1. 白色來亨雞血樣品之採集與 DNA 萃取：自白色來亨雞之翼下採集 血樣，置入已添加抗凝血劑 (EDTA) 之離心管，利用染色體 DNA 純化套組 (DNeasy Blood and Tissue kit, Qiagen, GmbH) 進行染色 體 DNA 之 萃 取 並 加 以 定 量 (Nano Drop, ND-1000 Spectrophotometer, USA)。
2. 選殖白色來亨雞端粒酶基因啟動子區域與 3’未轉錄區域之引子設 計：參考National Center for Biotechnology Information (NCBI) 網路 資料庫有關家禽端粒酶基因 (access no. AH013710) 序列，該序列含 有 雞 (Gallus gallus gallus) TERT 基 因 啟 動 子 區 域 (access no.
AY505015S1) 及 3’ 未轉錄區域 (3’UTR) (access no. AY505015S2) 兩段序列。啟動子區域包括了部分表現子 1 (exon 1) 序列，應用 Vector NTI軟體 (Infor Max Inc, USA) 剪貼端粒酶基因轉錄起始點 ATG 開始的 500 bp，設計雞端粒酶基因啟動子區引子為sense Primer ： GGTTGCCCATACTGCCAAT 、 antisense Primer ： CAGCAAGGAGTATCCATACGC。進行聚合酶連鎖反應 (PCR) 擴
增出 1,307 bp 的片段產物 (1~901 為啟動子區域、902~1025 為 Exon 1 部 分 序 列 ) 。 3’ 未 轉 錄 區 域 引 子 序 列 為 sense primer ： CTGTGCCTAGCAAGATATGTGG 、 antisense primer ： CAAAATTTATACCAACCTGCAAC。進行PCR 擴增出 609 bp 的片 段產物 (序列 1~508 為 exon 末端、509~957 為 3-UTR區域)。
3. PCR 及膠體電泳分析：使用純化的白色來亨雞染色體 DNA 進行 PCR 進行 PCR 之儀器及條件同一、(一) 2，但 annealing 温度調整 為 60-65℃。
4. DNA 片段回收與選殖：將 PCR 產物切下，利用 Qiaquick Spin Gel Extraction columns 膠 體 回 收 套 組 (Quiagen, GmbH) 回 收 純 化 DNA 片段，利用 TOPO Vector system II (Invetrogen, USA) 進行 T-A 選殖入多選殖位置 (multiple cloning site, MCS)，再轉型入勝任細胞 (competent cells) E. coli 內，俾進行 DNA 序列分析。
5. DNA 序列分析與比對：同一、(一) 3 的方法進行 DNA 序列之 BLAST。
二、體細胞核轉殖 (somatic cell nuclear transplantation, SCNT) 生產的複製 牛、羊與供核體細胞的端粒 (telomere) 長度分析
(一) 試驗動物：應用 SCNT 技術生產的 4 頭「如意家族」複製牛及複製 羊，分娩日期及年齡資料如表 3 及表 4 所示。做為 SCNT 牛羊同年 齡的對照非複製牛羊亦採集血樣萃取染色體 DNA。
(二) 血樣採集與染色體 DNA 萃取：自乳牛尾根採集全血，置入已添加抗 凝血劑 (EDTA) 之離心管，經 1,000 rpm 離心分離白血球，再利用染 色體 DNA 純化套組 (Qiagen, GmbH) 並依照操作步驟進行染色體 DNA 之萃取與定量。
(三) 供核體細胞：取自牛與羊耳朵組織體外培養的成纖維細胞做為生產複 製牛與羊的供核細胞。牛與羊的供核體細胞分別培養並繼代。體細胞 之體外培養條件為 10 % 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS) 之 DMEM (Dulbecco,s modified Eagle,s medium) 培養基，當細胞數目達到 約 2 × 107 時 用 trypsin/EDTA (0.25 ％ trypsin/0.02 ％ EDTA ； GIBCO/BRL）回收供萃取染色體 DNA 以分析端粒長度用。
(四) 端粒長度分析：端粒長度分析乃應用 Telo TAGGG 端粒長度分析套組 (Roche Molecular Biochemicals, Canada) 並按依其方法測定端粒限制片 段長度（Telomere Restriction Fragment, TRF）。首先將萃取的牛羊染色 體 DNA (1~2.5µg) 經過限制酶HinfI/RsaI (4U/µg 染色體 DNA) 在 37
℃作用 12~16 h後，進行 0.8 % 瓊脂糖膠體電泳，電泳條件為 10V/cm
進行 24 h。電泳後膠體經過變性(denaturation)、中和 (neutralization) 及 南方轉漬 (Southern blotting) 到帶正電之尼龍膜 (Roche Diagnostic, GmbH, Mannheim, Germany)，再與biotinylated Telomere Probe (Roche Molecular Biochemicals) 進行雜合反應 (hybridizaiton)；最後在 X-光片 上 (Kodak, USA) 自動放射顯影或應用化學螢光測定儀 Luminescent Image Analyser (LAS-3000, Jujifirm, Japan) 攫取影像後計算密度，再以 電腦軟體計算平均端粒限制片段(Telomere restriction fragment TRF) 長 度(67)。計算公式為
(五) 統計分析：複製牛羊及其後代的平均 TRF 測定後與對照正常動物比 較，以統計軟體進行 student’s t-test 分析，差異顯著水準為 p＜0.05。
第三章 結果