本研究之目的在選殖白色來亨雞的 TERT 基因。TERT 的活性 在原腸期之雞胚中顯著的表現(58,59)。故本研究採集白色來亨雞孵化 18 h 的雞蛋做為材料，應用顯微操作抽取原腸期雞胚做為總 RNA 來源，經 RT-PCR 合成 cDNA 做為模板，配合選殖 TERT 的引子 進行 PCR，已成功選殖白色來亨雞的全長 TERT 基因，將進一步 次選殖入表現載體，供未來基因轉殖及家禽 PGCs 長期體外培養研 究之用。
關於雞的 TERT 已有學者研究其 DNA 序列與胺基酸的結構
(19)。本研究參考選殖雞的 TERT 方法與 DNA 序列，設計特異之引 子選殖白色來亨雞的 TERT 基因。由於雞的 TERT 基因長 4.7 kb 且含有 GC 核苷酸的比例甚高，研究進行之初經多次嚐試不同 PCR 條件及各種聚合酶均難以順利擴增全長的基因產物，經不斷嘗 試並修正引子序列與 PCR的各種條件，終於順利擴增全長的 TERT 產 物 。 本 研 究 選 殖 的 TERT 序 列 經 BLSAT 比 對 ， 與 NP_001026178.1 之序列相似性最高，達到 99%。雞 TERT 之 DNA 序列轉譯成胺基酸後，為含有 1,346 個胺基酸 (NP_001026178) 的 蛋白質。雞 TERT 之胺基酸序列雖與其他動物具有一定相似性，較
特別之處是雞的 TERT N-端含有一 298 個胺基酸之具彈性連接子 (linker)，而非洲爪蟾蜍、人、小鼠、大鼠、倉鼠則分別長 199 個、
154 個、158 個、158 個與 161 個胺基酸 (附錄 3)，故雞的 TERT 蛋白質較大。雞的具彈性連接子與不同種別動物比較，胺基酸序列 具有高度變異性，幾乎沒有甚至相似性極低(19)。而其他脊椎動物的 TERT研究與蛋白質結構亦有學者探討(18, 20, 60, 61)。
脊椎動物間的 TERT 在 C 端反轉錄酶區具有高度相似性，其 中，又以 motif E 之保留性最強，胺基酸之相似度達 70%。雞的 TERT胺基酸與人、非洲爪蟾蜍、小鼠、大鼠、倉鼠之相似性分別達 45%、38%、41%、40% 與 42%。而脊椎動物 TERT 的 N 端區域
(20)
保留性反轉錄酶區域(21) 具有高度結構相似性，推測這些保留區 域應具有重要的理化功能(22) 。人的 TERT 在 5’ 端鄰近啟動子區 域內含有 E-box、Ik1、MAZ 與 Sp1 位置等各種轉錄因子結合區。
在基因庫中雞的 TERT 基因序列，包括了 5’ 端鄰近啟動子序列與 部 份 密 碼 子 序 列 (AY505015) 、 3’ 端 未 轉 譯 區 及 鄰 近 序 列 (AY505016) 及 5’ 端未轉錄區 (UTR) (AY502592 ) (19)。
而依據人的TERT，可將雞的 TERT 區域分為：region v-I (1~196)、region v-II (495~531)、region v-III (554~588)、region v-IV (625~753)、motif T (756~803)、motif 1 (814~838)、motif 2 (839~870)、
motif A (915~950)、motif B’ (1038~1072)、motif C (1078~1094)、motif D (1095~1120) 與 motif E (1139~1149) (附錄 1 與 3)。雞的 TERT 在 v-I 區域與 v-IV 區內，分別含有其他脊椎動物所缺乏的 15 與
27 個胺基酸序列。若依據相似度的變異做為參數，則區域 (region) 可再區分為 3 個次區域 (domains)，分別為 v-V (aa 1153~1175, 34%)、v-VI (aa 1180~1252, 65%) 與 v-VII (aa 1254~1346, 29%) ，不 同種別動物間在 3’ 端未轉錄區內之變異甚大(20)。
雞 TERT 之 5’ 端鄰近啟動子區域，主要包括了一個位於－
259 開始一直延伸到 + 727 bp 的 CpG 小島；自 5’ 鄰近啟動子區 域的 940 bp 到密碼子起始的 125 bp 內，存在 80 個以上的轉錄因 子 結 合 位 置 ( 附 錄 5) 。 5’ 區 域 之 motifs 含 有 許 多 CACC 及 CCAAT、Sp1、 GR 及 c-Myb、各式 NF 與 AP 位置、E-box 等 序列。在鄰近密碼區 340 bp 與 125 內的 Sp1、c-Myb、AP-1、
AP-2、一個與 Sp1重疊的 MAZ 等 motif 位置。此區域內也確定含 有 NF-1、NF-1/L、NF-ATh、E-box (c-Myc/Mad 1/Max site)、CCAAT 及 CACCC 等位置。比較雞與人的 TERT 5’ 端啟動子區 (500 bp)，發現雞的 TERT 內含有許多與人相似的轉錄因子結合區，例 如 Sp1、MAZ/Sp-1、E-box、Ik1、NF-1 與 AP-1等 (附錄 4)。雞的 TERT 序列中確定沒有 c-Ets-2 或 WT1 的位置。在人的 TERT 近
側啟動子及 5’端未轉錄區內，含有許多雞所欠缺的 motif，包括 E-box 及二個 Sp1 位置。而雞在轉錄起始點區域內僅含一個 Sp1 位置、在 5’端區域含有 4 個 c-myb 結合區是比較特別的。
端粒酶是核醣核酸蛋白質反轉錄酶的一種，由重複序列 (TR) 與具有端粒反轉錄酶 (TERT) 活性的蛋白質所組成(37)。TR 的 RNA 普遍存於動物細胞中，但唯有含 TERT 的細胞才具有端粒酶活性。
端粒酶的活性受到多重機制的調控，除了端粒酶直接作用之外，其 他的作用因子也對端粒產生調控作用。將外源 TERT 轉殖入體細 胞，可以產生端粒酶活性而預防端粒受侵蝕，克服細胞衰老與危機 使細胞達到永生狀態。選殖家禽 TERT基因的重要性，在於源自雞 的體細胞經過體外培養分裂數次後即進入增殖老化期(23)，與染色體 末端的端粒結構短化有密切關係，因為端粒可以保護染色體末端免 於斷裂與融合(12)。雞的染色體端粒 DNA 較人類多 10 倍。維持端 粒長度有賴於端粒酶的作用，是負責將 TTAGGG 的序列加到染色 體的 3’端(62)。缺乏端粒酶的作用，將導致端粒短化及細胞老化。體 外培養的體細胞，可以應用異種間的 TERT 基因轉殖而恢復 TERT 活性，而維持端粒長度，例如將人類的 TERT 基因轉殖表現到人、
綿羊、兔子、牛與鹿的體細胞，因為端粒酶的表現而增加端粒長度，
維持染色體之穩定性而延長細胞壽命(26-29)。然而將人的 TERT 基因
轉殖到體外培養的家禽體細胞，卻不具有 TERT 的活性而維持端粒 長度(63)，顯見家禽的 TERT 仍存在著未知的作用機制。目前對於家 禽與其他動物之 TERT 作用或穩定端粒的分子機制差異性尚未完 全了解，但選殖雞的 TERT 基因轉殖入體外培養的家禽體細胞，可 以順利表現 TERT 的活性。因此，若能應用基因轉殖技術將雞的 TERT 轉入家禽之體細胞，對於建立家禽體細胞及始基生殖細胞系 的體外長期培養系統將有莫大助益利，且能供家禽端粒變化及細胞 老化模式之研究(17)。
本研究成功選殖了白色來亨雞 TERT 基因，將進行後續基因轉 殖到體外培養的家禽體細胞，再分析細胞的端粒長度及端粒酶活 性。
二、複製動物的端粒長度
本研究分析畜產試驗所應用體細胞核轉置技術生產的複製牛、
羊及其後代動物，在特定年齡的端粒長度，並與同年齡非複製動物 比較，以了解複製動物及其後代與對照非複製動物間的端粒長度。
試驗從複製牛、羊及同年齡同性別的非複製動物採集全血，經離心 分離白血球供萃取染色體 DNA，然後應用套組測定端粒限制片段 長度 (TRF)。試驗結果顯示，年齡在 2 歲至 3 歲間的 4 頭複製牛 端粒長度分別為 17.03 kb、17.92 kb、17.92 kb及 17.19 kb，平均端 粒長度為 17.52 ± 0.41 kb；而 4 頭同年齡對照牛正常之端粒長度分 別為 17.79 kb、17.96 kb、17.86 kb 及 17.03 kb，平均端粒長度為 17.66 ± 0.32 kb。複製牛的 4 頭後代之端粒長度分別為 17.92 kb、
17.80 kb、17.92 kb及 17.03 kb，平均端粒長度為 17.67 ± 0.32 kb；
而 5 頭後代對照非複製牛之端粒長度分別為 18.31 kb、19.4 kb、
19.21 kb、18.2 kb及 18.31 kb，平均端粒長度為 18.69 ± 0.50 kb。做 為供核體細胞的端粒長度則為 17.30 kb。複製牛在 3 至 4 歲時的 端粒長度分別為 17.65 kb、17.31 kb、17.82 kb及 17.13 kb，平均端 粒長度為 17.48 ± 0.31 kb；而 6 頭同年齡同性別非複製牛在之端粒 長度分別為 18.76 kb、15.04 kb、19.47 kb、17.59 kb、17.31 kb 及 18.62 kb，平均端粒長度為 17.80 ± 1.57 kb，供核體細胞其端粒長度
為 17.07 kb。複製牛與非複製牛之端粒長度無顯著差異。顯示應用 成體供核體細胞進行 SCNT 生產的複製乳牛，其端粒長度與正常非 複製牛相似，推測在核轉置後基因再程式化的過程順利，使端粒的 長度得以回復正常，並未因為使用成體供核體細胞而導致端粒短化 的現象。
複製羊的分析結果，應用 SCNT 生產的 3 頭複製羊 1、2及 3 號於 50、22 及 6 月齡的端粒長度分別為 16.68 kb、17.05 kb 及 14.32 kb；而與 3 隻複製羊相近月齡非複製羊群的端粒長度分別為 16.92 ± 0.73 kb、17.04 ± 0.62 kb 及 17.37 ± 0.32 kb (圖 19 與 20)。
複製羊的 5 頭後代之端粒長度分別為 15.5、15.86、16.67、16.13 及 16.21 kb，平均端粒長度為 16.07 ± 0.32 kb；而 3 頭對照非複製 羊的端粒長度分別為 16.37、15.77、16.58 及 17.01 kb，平均端粒 長度為 16.43 ± 0.36 kb。複製羊 1、2 及 3 號在 62、34 及 18 月 齡之端粒長度，分別為 12.26 kb、13.50 kb 及 10.39 kb；而與 3 隻 複製羊相近月齡非複製羊群，端粒長度分別為 16.08 ± 0.86 kb、15.72
± 0.61 kb及 16.32 ± 0.61 kb，複製羊之端粒長度顯著較非複製羊短 (P<0.05)。
有關各種複製動物的端粒長度已有學者加以歸納(64) (附錄 2)。
Kubota et al.(65)曾連續複製日本和牛種公牛，生產的複製牛外表健康
且具正常端粒長度。而測定第一代與第二代複製牛的成纖維細胞與 白血球之端粒長度卻明顯不同。供核細胞經過體外培養並繼代 15 次，端粒長度為 14.7 ± 0.4 kb至 12.8 ± 0.4 kb，約減少 63 bp/細胞倍 增。第一代與第二代複製牛的成纖維細胞，平均端粒分別為 15.4 ± 0.5 kb至 16.1 ± 0.7 kb，與自然配種所生的同齡正常非複製仔牛相 似，且均比原來供核公牛的端粒為長。供核細胞、第一代與第二代 複製牛的白血球端粒分別為 13.8 ± 0.8 kb、15.3 ± 0.8 kb與 15.7 ± 0.8 kb。供核細胞的端粒較皮膚成纖維細胞為短。複製牛的端粒回復與 牛胚發育至特定階段時端粒酶的高度活性有關係。
牛與人的精子均維持相當的端粒長度(66)。生殖細胞系的端粒短 化，可經由端粒酶的作用而修補。12 歲的日本種公和牛因遺傳性能 優異而有產數以萬計的優良後代。應用SCNT生產的二頭日本種公用 和牛，在體型、外表行為及採精量、精子濃度、冷凍耐受性、體外 受精 (in vitro fertilization, IVF) 效率與精液性狀均在正常範圍，精液 供人工授精也順利產下正常仔牛。正常公牛與 2 頭複製公牛精子的 端粒分別為 22.42 kb、25.8 kb與 20.9 kb。而來自老公牛的供核肌肉 細胞及精子的端粒分別長 20.1 kb與 22.2 kb，顯示正常的端粒長 度。採自端粒較長複製公牛的精液進行人工授精，生下 9 頭外表健 康的雌性仔牛，其出生體重、生長速率與行為均與正常仔牛無異，
顯示複製公牛供種畜應用的可行性。仔牛與正常對照仔牛的白血球 端粒分別為 20.06 ± 0.45 kb與 19.97 ± 0.41 kb (36)。
Tian et al. (55)應用 13 歲乳母牛的成纖維細胞與卵丘細胞做為 供核源，產製 10 頭複製仔牛中，有 6 頭在分娩後夭折，僅 4 頭 仔牛存活，這 4 頭複製仔牛之端粒長 15.38 ± 0.62 kb，與正常對照 仔牛之 14.73 ± 0.49 kb 並無顯著差異，且均比較供核母牛的 12.43
± 0.49 kb 為長。而分娩後早夭的 6 頭複製仔牛，端粒長 15.87 ± 0.40 kb，與存活的複製仔牛相似，顯示取自 13 歲乳牛的供核細胞 雖然端粒較短，但經過複製後無論子代能否存活，均能使供核體細 胞的端粒回復，而複製仔牛出生後高損失率似與端粒變短無關。母
± 0.49 kb 為長。而分娩後早夭的 6 頭複製仔牛，端粒長 15.87 ± 0.40 kb，與存活的複製仔牛相似，顯示取自 13 歲乳牛的供核細胞 雖然端粒較短，但經過複製後無論子代能否存活，均能使供核體細 胞的端粒回復，而複製仔牛出生後高損失率似與端粒變短無關。母