複製動物的染色體端粒長度

全球第一頭複製羊「桃莉」出生時，健康狀態即成為大眾關注之焦點。

桃莉羊開啟體細胞複製動物的熱潮，也讓複製動物的老化及端粒長度成為 研究的重點。至今，各種複製動物的端粒已有相當多的研究結果，分別有 端粒變短、端粒正常或端粒變長等分歧的結果⁽⁴¹⁾。複製動物的端粒長度不 一致且具有高度變異性，可能與供核細胞種類、端粒酶再程式化的效率、

動物的個體差異、核轉置的操作步驟、分析時採集到的組織或細胞種類、

動物種別間的不同等，導致複製後基因再程式化及發育潛力的差異⁽⁴¹⁾。

(一)、複製牛

複製牛的端粒長度與同年齡的對照牛隻比較，研究結果並不一致。利 用取自老化的供核細胞產製的複製仔牛，端粒長度可以回復正常⁽⁴²⁾，或甚 至比對照仔牛還要長⁽⁴²⁾。應用不同供核細胞生產的複製牛其端粒長度有顯

著的變異⁽⁴⁰⁾，例如應用胎體成纖維細胞生產的複製牛其 DNA 及組蛋白甲 基化異常現象較使用顆粒細胞者為高，發育率也較低⁽⁴³⁾。不同供核細胞生 產的複製動物，端粒的維持受到 epigenetic 機制及未知遺傳因子等調控，

且端粒結合蛋白 TRF1、TRF2 與 TIN2 等也參與端粒的調節，藉由直接抑 制或強化端粒酶與端粒的結合而改變端粒結構，有效的抑制或促進端粒酶 的作用⁽⁴⁴⁾。不同組織或器官的端粒長度也不同，如複製公牛的皮膚端粒與 對照動物相似，但睪丸的端粒長度則明顯較正常對照公牛為短，可能因端 粒結合蛋白之再程式化異常所引起⁽⁴⁵⁾。

牛胚在早期發育的過程，均可見端粒酶的表現⁽⁴⁶⁾。應用成體或胎體成 纖維供核細胞生產的複製牛胚，在著床前桑椹期與囊胚期的端粒與正常牛 胚相似，均較牛卵母細胞或精子為短；而成體細胞者又較胎體成纖維體細 胞為短。正常體內胚或體外生產（in vitro production）之桑椹胚的端粒長度 相近且均較複製的桑椹期牛胚為長。而體外生產或複製囊胚之端粒，均較 桑椹期為長⁽⁴⁷⁾，顯示牛胚的端粒延長約發生在囊胚期，此時端粒酶強烈表 現並調節端粒長度⁽⁴⁶⁾。應用成體或胎體成纖維細胞產製的複製桑椹期-囊胚 具有正常的端粒延長作用⁽⁴⁷⁾，顯示細胞核之再程式化或生殖細胞中端粒的 結構重組與端粒酶活性，或許是促進複製動物端粒回復的主因⁽⁴⁸⁾。

(二)、複製羊

在 1999 年，參與桃莉羊研究的 PPL公司曾檢測桃莉羊的染色體端粒 長度，發現較同齡之正常綿羊短了 20%⁽⁵⁰⁾，推測桃莉羊可能因繼承 6 歲 母羊的端粒，且在進行複製之前供核體細胞經體外培養了一段時間故使端 粒進一步變短。Clark et al.⁽⁵¹⁾應用成纖維細胞生產做為供核細胞的複製綿羊 中，僅部分具有正常的端粒長度；應用上皮細胞產製的複製綿羊，端粒長 度比對照動物為短。應用SCNT複製的公山羊，睪丸之端粒酶活性與對照公 羊並無顯著差異，雖然端粒較正常對照羊隻短，但SCNT複製羊的外表正常 且身體健康，同時具有正常的生殖能力⁽⁴²⁾。

(三)、複製豬

複製豬與基因轉殖豬的生產，在關鍵性生物技術的發展上具有重大潛 力⁽⁵²⁾。當人類的器官缺乏時，豬將是最有可能成為異種器官的供應動物。

應用遺傳工程技術修飾供核細胞的基因，可生產與人類免疫系統相容的基 因改造複製豬，是未來具有應用潛力之技術。然而複製豬的生產效率至今 仍較其他家畜為低，複製豬胚轉殖後最終能順利產下且存活的比率約只有 1%⁽⁵³⁾；這可能與體細胞之基因再程式化不完全有關⁽³⁸⁾。

Jiang et al. ⁽⁵⁴⁾ 曾研究複製豬的端粒長度，結果與自然繁殖生下的豬在 不同年齡與組織中並無差異。不同年齡豬隻之不同組織端粒長度介於 9~23 kb 之間。取自豬胎之 6 個器官的端粒長度介於 20.7~21.7 kb 間，平均長

21.2 kb。到了發身之前與性成熟的豬其端粒長度明顯較短。因此，估算豬 自胎期至發身前期之端粒約短少 4 kb，而由發身前期至性成熟期又將短少 1.5 kb。發身前期與成熟豬隻之不同器官，端粒長度具有顯著的差異。發身 前期豬隻的皮膚與性腺細胞之端粒長度分別為 18.0 ± 0.4 kb與 18.20 ± 0.6 kb，比腎臟、肝臟與心臟細胞之端粒為長。而性成熟後豬隻皮膚與性腺細 胞的端粒分別為 16.1 ± 0.8 kb與 16.6 ± 0.9 kb，較其他組織為長，肝臟細胞 的端粒最短，僅 14.0 ± 1.0 kb。

轉殖綠色螢光蛋白基因 (eGFP) 的胎體成纖維細胞株與表現 eGFP 的 成纖維細胞株，端粒分別長 18.5 kb與 19.1 kb。eGFP 基因轉殖複製豬，皮 膚細胞之端粒為 20.1 kb。轉殖 eGFP的胎體成纖維細胞，端粒較對照胎兒 細胞短約 2 kb，顯示細胞在培養過程會導致端粒變短。4月齡的複製豬其皮 膚細胞之端粒與同齡對照豬並無差異。兩隻分娩後第 3與第 7天早夭的複 製豬，其皮膚端粒分別長 24.7 kb 與 21.9 kb，與懷孕 70 天豬胎兒的 23.3

± 2.0 kb 與 21.7 ± 0.6 kb 沒有明顯差異。

豬、人與小鼠出生後，不同組織的端粒已經不等長，器官間端粒長度 有明顯差異。體細胞複製豬的端粒回復如同複製牛胚般有賴於端粒酶的作 用⁽⁵⁵⁾。Miyashita et al. ⁽⁴⁸⁾ 使用不同供核細胞生產的複製牛，端粒之長度明 顯不同。來自年老動物的供核細胞無法使全數的複製後代回復端粒長度；

應用輸卵管及乳腺上皮細胞生產的複製仔牛，其端粒較對照仔牛為短。而

Jiang et al. ⁽⁵⁴⁾ 的研究證明應用端粒較短的細胞所生產的複製豬，端粒可以 回復到正常同齡豬隻的長度。Jeon et al. ⁽⁵⁶⁾ 分析複製豬及複製牛的端粒，

並與供核的胎體成纖維細胞及同齡正常豬隻比較，發現複製仔豬或基因轉 殖複製仔豬的端粒正常，而複製牛的端粒並未比成體成纖維供核細胞長。

在供核細胞、源自成熟或剛出生豬與牛的正常組織，均可測得端粒酶 的顯著活性，若以酶之活性強弱區分，豬的耳朵細胞又較牛的耳朵細胞或 其他體細胞要強烈。複製仔牛、複製仔豬及供核體細胞具有相似的端粒酶 活性。正常豬與基因轉殖複製豬的端粒酶活性沒有差異。複製豬囊胚與供 核細胞或體外受精豬囊胚比較，其端粒酶活性增強，推測複製仔豬的端粒 延長可能與囊胚期較強的端粒酶活性或其他調控機制有關⁽⁵⁷⁾。而應用培養 的成纖維細胞產製的複製仔豬，其端粒可回復至自然配種所生同齡正常仔 豬。

Jeon et al. ⁽⁵⁶⁾ 應用轉基因雌性成纖維供核細胞進行 SCNT，產製了 15 頭複製豬中有 3 頭帶有 eGFP 或人類血球生成素 (human erythropoietin, hEPO)。非基轉與基轉複製豬之端粒分別為 25.2 ± 0.5 kb 與 24.8 ± 0.5 kb，

兩者並無差異，但均比供核細胞的 22.8 ± 0.5 kb 為長。而供核細胞、複製 仔豬與成豬皆具有顯著的端粒酶活性，豬的組織比牛者具有明顯的端粒酶 活性。應用成體成纖維細胞、輸卵管細胞與卵丘細胞進行 SCNT，以胎體 成纖維細胞產製的豬胚發育最佳，此或許因為胎體成纖維細胞較已分化細

胞在複製時更容易進行基因再程式化所致^{(54, 56)}。 本研究之目的

(一)選殖白色來亨雞的端粒酶基因並進行 DNA 序列分析，探討端粒酶 基因中的調控區域，再次選殖與構築端粒酶之表現載體，發展有效延長家 禽體細胞體外培養的技術平台，簡化家禽始基生殖細胞 (primordial germ cells, PGC) 的長期體外培養，以利後續利用 PGC 進行基因轉殖的研究。

( 二 ) 分 析 體 細 胞 核 轉 殖 (somatic cell nuclear transplantation, SCNT) 複 製 牛 、 羊 、 同 年 齡 非 複 製 對 照 動 物 與 供 核 體 細 胞 的 端 粒 (telomere) 長 度 ， 以 了 解 複 製 動 物 與 非 複 製 動 物 之 染 色 體 端 粒 長 度 。

第 二 章 材 料 與 方 法