嘉南藥理科技大學 生物科技系 碩士論文

嘉南藥理科技大學 生物科技系

碩士論文

雞端粒反轉錄酶基因的選殖與 體細胞核轉置牛羊之端粒長度分析

Cloning of telomerase reverse transcriptase gene from chicken, and analysis of telomere length in cattle and

goats cloned by somatic cell nuclear transfer

指導教授：吳明娟 博士 蕭振文 博士

研 究 生：蔡麗卿

中華民國九十六年七月

嘉南藥理科技大學生物科技系 Department of Biotechnology

Chia-Nan University of Pharmacy & Science

碩士論文

Thesis for the Degree of Master

雞端粒反轉錄酶基因的選殖與 體細胞核轉置牛羊之端粒長度分析

Cloning of telomerase reverse transcriptase gene from chicken, and analysis of telomere length in cattle and goats cloned by

somatic cell nuclear transfer

指導教授：吳明娟 博士 (Dr. Ming-Jiuan Wu) 蕭振文 博士 (Dr. Jen-Wen Shiau) 研 究 生：蔡麗卿 (Lih-ching Tsai)

中華民國九十六年七月二日

July 2, 2007

中文摘要

本論文分為二部份，第一部份研究的目的在選殖白色來亨雞之端 粒 反 轉 錄 酶 (telomerase reverse transcriptase, TERT) 基 因 並 進 行 DNA 序列分析比對，期能供基因轉殖並發展延長家禽體細胞體外培 養的技術平台。試驗應用顯微抽取技術自雞蛋取得原腸期雞胚供萃取 RNA 樣 品 ， 經 過 反 轉 錄 - 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 合 成 互 補 DNA (complementary DNA, cDNA)，並設計特異引子進行 PCR 選殖雞的 TERT。結果 PCR 之後獲得一 4.7 kb 的產物，此產物經膠體回收並 選殖入 TOPO 載體，經過 DNA 序列分析與 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 比對，確定為雞的 TERT 基因。第二部份是分 析行政院農業委員會畜產試驗所應用體細胞核轉置 (somatic cell nuclear transfer, SCNT) 技術生產的複製荷蘭種乳牛與阿爾拜因乳山 羊及其後代動物的端粒 (telomere) 長度。將複製動物的端粒長度與同 年齡的非複製動物進行比較，以了解複製與非複製動物及其後代的端 粒長度變化。試驗自複製牛與羊採集全血，經離心分離白血球供萃取 基因組 DNA，然後應用套組測定端粒限制片段長度（Telomere Restriction Fragment, TRF）。結果顯示，年齡在 2 歲至 3 歲間的 4 頭複製乳牛之端粒長度與同年齡非複製牛之端粒長度相近。複製牛的

4 頭後代之端粒長度也與其同齡非複製乳牛相似；顯示複製牛及其後 代之端粒長度與年齡相近之非複製乳牛之間並無差異顯著（p＞

0.05）。而 3 頭月齡不同的複製羊，其端粒長度則較同齡之非複製對 照羊為短，並隨著月齡的增加，端粒長度顯著較非複製對照羊為短 (p

＜0.05)。而複製羊的 5 頭後代之端粒長度則與同齡對照羊隻相近而 無差異顯著（p＞0.05）。本研究顯示，應用複製技術生產的乳牛，其 端粒長度在經過 NT 操作後，胚在發育過程其基因組順利地經過再程 式化，使端粒長度回復正常，並未因為應用成體供核體細胞進行複製 而導致端粒短化。而應用 SCNT 複製羊其端粒長度較對照正常羊為 短，且隨著月齡增加而與對照之正常羊隻為短，達到統計上的顯著差 異結果，此結果顯示不同複製動物之端粒長度變化並不一致；而複製 動物後代的端粒長度，則與正常動物相似。

關鍵字：雞、端粒反轉錄酶、基因選殖、端粒長度、體細胞核轉置

Abstract

This thesis consists of two parts. The objective of the first part was to clone and sequence the telomerase reverse transcriptase gene (TERT) from gastrula stage embryos of White Leghorn chicken. Total RNA were first extracted by using commercial kit and followed by RT-PCR with specific primers to obtain the full-length of putative TERT cDNA. The obtained PCR product was recovered by agarose gels electrophoresis and then subcloned into TOPO vectors for DNA sequencing. BLAST comparison of the cloned DNA sequences with NCBI Genomes database confirmed the identity of chicken TERT (chTERT). The results showed that the chTERT gene had been successfully cloned and could be subsequently used for gene transfer to establish long-term in vitro culture system for avian cells.

The objective of the second part was to compare the telomere length of somatic cell nuclear transfer (SCNT) cloned animals and their offspring with the non-cloned counterparts. Genomic DNA for terminal restriction fragment (TRF) analysis was purified from whole blood of cloned animals, their offspring and age-matched control animals. The results showed that there was no significant difference in the telomere

lengths between cloned cattles and their age-match cattles aged 2-3 and 3-4 (p＞0.05). Similarly, the average telomere lengths of the offspring of cloned cattles were not significantly different from their age-matched counterparts. However, the cloned dairy goats at different ages have shortened telomere lengths when compared with age-matched controls.

Offspring derived from cloned goats had normal telomere lengths compared with their age-matched counterparts. Our results suggested that the telomere lengths of cloned animals were varied among species. The telomere lengthes in cloned goats were not completely restored as those in the cloned cattle by SCNT from chicken.

Keywords：Chicken, Telomerase reverse transcriptase (TERT), Gene cloning, Telomere length, Somatic cell nuclear transfer (SCNT)

謝誌

本論文承蒙恩師 吳明娟博士與 蕭振文博士二年來對於試驗 研究的辛苦指導和對論文提供諸多的討論與協助，復蒙口試委員 陳 立人博士與 顔瑞鴻博士對本論文的細心審閱與斧正，使 我 獲 益 良 多 ， 也 讓這本論文更加豐富完整，在此致上由衷的感激。

進修期間，系所老師與同學們對論文及試驗上提供的寶貴建 議、討論與協助，使我在研究面臨挫 折 與 困 難 時得以順利突破並向 前邁進，也讓我兩年的研究所生涯更加充實且獲益良多，在此表達誠 摯之謝意。謝謝 F402 實驗室的所有夥伴及桂容還有班上的同學，有 你們一路的相互扶持並共同分亨研究生涯的苦與樂，在 此 均 一 併 致 謝 。

感謝畜產試驗所內長官們的支持、生理組同仁對於研究所需試 驗材料之提供及實驗上的諸多協助，謹致萬分謝忱。

進修期間，感謝內子的鼓勵及支持還有對試驗及論文的諸多幫 忙，感謝我的爸媽及公婆的支持和幫忙，若我有任何一絲成就，我都 要將榮耀歸於你們，給你們幸福。還有我可愛的寶貝兒女旻勳、旻樺 與旻旋，始終是我最重要的精神後盾。若 不 是 他 們 長 久 以 來 的 支 持 ， 陪我走過這忙碌且充實的二年，我 不 可 能 順 利 畢 業 ， 謝謝你 們，我愛你們。

最後，僅將論文獻給每一個曾經在我的人生路上給我鼓勵的你 們。謝謝你們。

目錄

中文摘要--- I 英文摘要--- III 謝誌--- V 目錄--- VII 表目錄--- IX 圖目錄--- X 附錄目錄--- XII 縮寫表--- XIII

論文本文---1

第一章 緒論---1

一、 前言---1

二、 家禽的端粒酶基因與細胞壽命---2

三、 體細胞核轉置家畜的端粒---5

四、 複製動物的染色體端粒長度---7

第二章 材料與方法---13

第三章 結果---19

第四章 討論---24

第五章 結論---38

參考文獻---39 附表與附圖---48 附錄---83

表目錄

表 1. 白色來亨雞全長 TERT 之 DNA 序列進行 BLAST 比對後依序

列相似度排序的結果---48

表 2. 與白色來亨雞 TERT 蛋白質具有最高相似性的 10 種蛋白質序 列---49

表 3. 複製牛及其後代與對照牛之基本資料---50

表 4. 複製羊及其後代之基本資料---51

表 5. 複製牛及其後代與同年齡非複製牛之端粒長度---52

表 6. 複製羊及其後代與同年齡非複製羊之端粒長度---53

圖目錄

圖 1. 應用顯微抽取技術自白色來亨雞蛋取得原腸期雞胚樣品---54 圖 2. 參考網路資料庫 AY626231 之序列進行 PCR 擴增自 5’至 3’的 部分基因片段產物---55 圖 3. 自白色來亨雞胚 (E) 與始基生殖細胞 (PGC) 樣品中擴增家禽

端粒酶基因及陽性對照GAPDH的部分基因片段產物---56 圖 4. 白色來亨雞之 TERT基因產物進行 DNA序列分析與 BLAST

比對之結果---57 圖 5. 自白色來亨雞原腸期胚 cDNA 進行 PCR擴增的 TERT基因

前、中、後段基因---58 圖 6. 白色來亨雞 TERT基因啟動子區與 3^，端未轉錄區應用PCR選

殖後獲得之產物---59 圖 7. 白色來亨雞 TERT全長基因之 PCR選殖產物---60 圖 8. XhoI/SacI切割篩選 pchTERT TOPO質體。4,799 bp片段顯示完

整的TERT基因---61 圖 9. 含有雞 TERT 基因的 pchTERT TOPO 序列分析載體圖譜-62 圖 10. 進行 BLAST比對後與白色來亨雞 TERT之DNA具有相似性

的序列及相似位置圖---63 圖 11. 白 色 來 亨 雞 TERT 的 DNA 序 列 與 相 似 程 度 最 高 的

NM_001031007.1 序列比對結果---70 圖 12. 轉譯之白色來亨雞 TERT 胺基酸序列---71 圖 13. 白色來亨雞 TERT 轉譯之胺基酸序列進行BLAST後呈現之 相關蛋白質與相似位置圖---72 圖 14. 白 色 來 亨 雞 TERT 的 胺 基 酸 序 列 與 相 似 程 度 最 高 的 NP_001026178.1 序列比對結果---75 圖 15. 複製牛 (2-3歲) 及其後代個體之端粒長度分析---76 圖 16. 複製牛對照 (2-3歲) 及其後代對照之同齡正常乳牛端粒長度

分析---77 圖 17. 複製牛3-4歲與同齡非複製牛之端粒長度---78 圖 18. 複製牛及其後代與同齡非複製牛之端粒長度---79 圖 19. 複製羊 1、2與 3號在 50、22與 6月齡 時及其後代之端粒長

度分析---80 圖 20. 複 製 羊 對 照 及 其 後 代 對 照 同 齡 正 常 羊 之 端 粒 長 度 分 析 ---81 圖 21. 複製羊1、2與3號在不同月齡時與非複製羊對照羊的端粒長度 分析---82

附錄目錄

附錄 1. 不同脊椎動物 TERT 蛋白質區域之相似性---83

附錄 2. 各種複製哺乳動物已進行端粒長度分析的結果---84

附錄 3. 不同脊椎動物之 TERT 蛋白質比對分析---85

附錄 4. 雞與人 TERT 基因 5’端鄰近/啟動子區域上游的比較---87

附錄 5. 雞 TERT 5’端鄰近啟動子區域內的轉錄因子的結合序列 ---88

縮寫表 INT Interspecies nuclear transfer NT Nuclear transfer SCNT Somatic cell nuclear transfer TERT Telomerase reverse transcriptase UTR Untranslational region CEF Chick embryonic fibroblast

TR Tandem repeat

BLAST Basic Local Alignment Search Tool TRF Telomere restriction fragment cDNA Complementary DNA

PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse transcription PCR

ALT Alternative lengthening of telomeres eGFP Enhance green fluorescent protein hEPO Human erythropoietin PGC Primordial germ cells MCS Multiple cloning site

NCBI National Center for Biotechnology Information

IVF

In vitro fertilization

In vitro production

第一章 緒論 一、前言

正常的體細胞有一定壽命，在歷經多次的細胞分裂後即進入衰老期而 無法再分裂。引起細胞衰老的主要因素與染色體的端粒變短有關係⁽¹⁾。端粒 位於染色體末端，由短且重複的 DNA 序列和蛋白質結構所組成^{(2, 3)}。至 今，已有部分動物的染色體端粒被研究，發現物種間的端粒基因序列變異 極小，甚至在演化上岐異度極大的物種亦然。例如屬於原生生物門纖毛蟲 綱之單細胞生物四膜蟲 (Tetrahymena) 之端粒序列為 TTGGGG，而人類的 端粒序列則為 TTAGGG。端粒的長度會隨著細胞分裂次數的增加而縮短，

每次分裂約 20~200 bp ⁽⁴⁾，故染色體的端粒被稱為細胞的「分子時鐘 (Mitotic clock)」⁽⁵⁾。端粒對保持染色體的穩定性、染色體的完整及預防異常 重組以利 DNA 的正常複製具有重要功能。端粒變短將使染色體容易纏 黏，並使細胞發生異常而步入死亡之途。端粒的短化起因於 DNA 聚合酶 失去作用，因而無法再複製線型 DNA 的末端，短化之端粒將被端粒-結合 蛋白質視為斷裂的雙股 DNA，故啟動訊號傳遞以活化腫瘤抑制因子 p53 與 p16/pRB，抑制衰老細胞之分裂而導致細胞生長停滯⁽⁶⁾。為了解救阻抑細 胞的生長，可以應用致癌基因例如 SV40 large T 抗原，其作用可以使 p53 與 p16/pRB 失去活性，進而使細胞再度復原生長的能力⁽⁷⁾。然而此種作用 仍有時間限制，仍會因為端粒持續變短而使細胞老化並走向不增殖階段

(non-proliferative stage)，此階段又稱之為端粒截斷 (telomere crisis)。此時，

僅有極少數的細胞可以因端粒酶 (telomerase)的再活化而能避開端粒截斷 期並存活下來⁽⁷⁾。

端粒酶 (telomerase) 是屬於核醣核酸蛋白質 (ribonucleoprotein) 反轉 錄酶的一種，其組成是由重複序列 (tandem repeat, TR) 及具有端粒反轉錄 酶 (telomerase reverse transcriptase, TERT) 活性的蛋白質所組成⁽⁸⁾。TR 的RNA於動物細胞中普遍存在，使 端 粒 重 複 序 列 得 以 附 加 到 染 色 體 上 ，但唯有含TERT的細胞才具有端粒酶活性⁽⁸⁾。端粒酶可藉由合成新的端 粒DNA而維持端粒長度。端粒酶的活性受到多重機制調控⁽²⁾。端粒長度的 調節除了直接受端粒酶修飾外，例如 TRF1 與 TRF2 端粒結合蛋白質也會 結合 TTAGGG 序列並協同其他調控端粒蛋白質而對端粒產生調控作用。

端粒酶僅在永生細胞株、癌細胞、生殖細胞或再生組織表現^(9-10)，而不表現 在正常的體細胞。因此，端粒酶的表現被認為與細胞永生或癌化有著密切 關係。缺 乏 端 粒 酶 的 作 用 將 導 致 端 粒 短 化 及 細 胞 老 化。將外源的異種 TERT 轉殖入不同物種之體細胞，可誘發端粒酶之活性而維持端粒長度，

克服細胞衰老與端粒截斷期並使細胞達到永生狀態。

二、家禽的端粒酶基因與細胞壽命

體 外 培 養 的 家 禽 體 細 胞或 源 自 雞 胚 的 成 纖 維 細 胞(chick embryonic

fibroblast, CEF），在經歷數次分裂後即因為端粒短化而進入增殖老化期 (replicative senescence)⁽¹¹⁾。細胞藉由老化或細胞凋亡 (apptosis) 等機制可以 防止老化細胞的無限制增殖。因此，端粒具有保護染色體末端免於斷裂融 合，並利於染色體的複製等功能⁽¹²⁾。

雞與人的染色體差異最大之處在於其端粒 DNA較人類多達 10 倍。家 禽的端粒 DNA依結構與長度之不同，可區分為長度介於 0.5~2 Mb之間的 I、II與III型⁽¹³⁾。第一型端粒 DNA又稱為間隙 (interstitial) 端粒序列，位於 染色體之內長約 0.5~10 kb，能扺抗限制酶 Bal 31 的切割為其特性。第二 型端粒 DNA長約 10~40 kb。第三型端粒長 40 kb ~20 Mb，是目前已知的 脊椎動物中最長者，位於染色體末端並能被限制酶 Bal 31 迅速切割⁽¹³⁾。

端粒酶是一種核糖核酸蛋白，負責將 TTAGGG 序列添加到染色體的 3’端⁽¹⁴⁾。重複序列在 3’-連接形成數百個核苷酸的突出G鏈，並受到端粒結 合蛋白的保護。目前研究人類的 TERT，多數是應用小鼠模式進行，然因 小鼠與人的差異甚大，應用小鼠模式研究做為人類TERT之作用以解開癌症 或老化問題，存在實際的困難。雞則是完全不同的動物模式，與人的 TERT 在生物學上具有許多共同點，例如部分鳥類的壽命相當長，故可作為人類 細胞老化與轉型的研究模式^(15-17)。

包括雞與金鋼鸚鵡 (macaw) 等 35 種脊椎動物，TERT 的 RNA 序列 及二級結構已有學者加以探討⁽¹⁸⁾，發現脊椎動物的TERT蛋白質的特異區域

內具有保留性，顯示保留區對於 TERT 結構及酶作用的重要性。

雞的 TERT研究，已有學者自原腸期雞胚中選殖全長 4,497 bp TERT mRNA，自第一個轉錄起始點 ATG起始可轉譯成長 1,346 個胺基酸產物

(19)。雞的 TERT 與其他動物比較，最大之差異在於 N-端的彈性連接子相 當長，比人類多了 144 個胺基酸，故雞的 TERT 蛋白質較大。雞的TERT 胺基酸與人、非洲爪蟾蜍、小鼠、大鼠、倉鼠之相似性分別達 45%、38%、

41%、40% 與 42%。而脊椎動物 TERT的 N端區域⁽²⁰⁾ 與保留性反轉錄酶

區域 ⁽²¹⁾ 具有高度之結構相似性，顯示保留區域應具有重要理化功能⁽²²⁾。雞

的 TERT 位於染色體 2q21 上接近空隙 (interstitial) 端粒的位置。雞與人 TERT在 5’端鄰近啟動子區含有各種轉錄因子之結合區，例如 E-box、Ik1、

MAZ與 Sp1 位置等。在網路基因庫中有關雞TERT之基因序列包括長 11,025 bp 的 5’端鄰近啟動子序列與部份密碼子序列 (AY505015)、長 957 bp 的 3’端未轉譯區及鄰近序列 (AY505016)及長 4,497 bp的 5’端未轉錄 區 (UTR) (AY502592 ) ⁽¹⁹⁾。

體外培養的雞胚成纖維細胞，通常在增殖 25~35 代之後即進入增殖老 化期⁽²³⁾。而雞胚成纖維細胞在達到成長高點 (plateau) 後，有超過 90％ 的 細胞可以被檢出細胞老化指標的 ß-galactosidase染色，顯示細胞已老化，細 胞中並無殘存之細胞株成長出來，雞胚成纖維細胞無法自發成為永生細 胞。成纖維細胞老化後其端粒酶的活性會下降甚至喪失， TRF 1 與RAD 51

基因的表現也隨之降低，RAD 52 基因的表現量則提升。細胞增殖數目加倍 後其端粒約短少 60 bp ⁽¹⁷⁾。而分離自體外培養CEFs之成纖維細胞，每一個 世代端粒的短化約為 300bp。而體外培養的成纖維細胞老化時，端粒長度 的變化有可能變長、變短或維持不變^{(17, 24)}，顯示鳥類細胞之端粒調控有其 他的延長機制（alternative lengthening of telomeres, ALT），例如同源重組而 調控端粒長度⁽²⁵⁾。

體外培養的人、綿羊、兔子、牛與鹿的體細胞，可藉由轉殖人類端粒 酶基因而產生端粒酶活性，進而增加端粒長度而延長細胞壽命^(26-29)。這些 細胞與腫瘤細胞不同，不會異常生長或惡性轉移，顯示人類端粒酶基因在 動物細胞中表現，除具有相容性外並能使細胞免於增值老化而獲得永生。

例外的是，人的 TERT轉入雞的成纖維細胞卻無法產生端粒酶的作用而延 長細胞壽命，與未轉染TERT的對照細胞均呈現老化現象⁽³⁰⁾。人的 TERT在 雞的成纖維細胞未產生端粒酶活性的原因，有可能是 chaperone的功能不當 而導致蛋白質組裝不正確所致。人的TR基因與兔、牛的 TR 具有高度的 DNA相似性，但與雞的相似性則偏低⁽³¹⁾。而端粒酶之活性，需要正確的模 板才得以發揮作用。雞 TERT 內的 N端及 7 個反轉錄區與人或其他脊椎動 物具有高度相似性⁽¹⁹⁾。

三、體細胞核轉置家畜的端粒

細胞核轉置 (nuclear transfer, NT) 技術的概念始於 1938 年；首次將細 胞核轉置成功地應用於體細胞複製動物的紀錄出現於 1952 年在兩棲類動 物的研究，Briggs and King⁽³²⁾ 將胚葉細胞注入未受精的去核卵子而成功生 產蝌蚪。之後到 20 世紀末葉，一直未再見到動物體細胞成功複製的例子。

1997 年，英國羅斯林研究所（Roslin Institute）利用取自 6 歲母綿羊的乳 腺上皮細胞做為供核源進行核轉置，在複製 276 個羊胚後，最終獲得一隻 複製羊「桃莉」，首創哺乳動物體細胞核轉置 (somatic cell nuclear transfer, SCNT) 複製成功之例而震撼全球⁽³³⁾。桃莉的誕生被視為二十世紀末期生物 科技成就的里程碑，也是 1997 年「科學」雜誌票選為年度科學的最大突 破。迄今，應用取自胎體或成體動物之體細胞而成功複製的哺乳動物，包 括綿羊、牛、小鼠、山羊、豬、大鼠、貓、兔子、騾、馬及狗等⁽³⁴⁾。複製 技術應用在農業，可以擴大遺傳背景一致的高性能優良種畜的生產、復育 與保種高度瀕臨絕種動物及基因轉置家畜的生產等用途。傳統上種公牛的 選拔需歷經至少 6~8 年的長期後裔檢定始能完成，若能利用 SCNT 技術 來複製優良種公牛，將具有重要的經濟價值並縮短後裔測定所需的時間

(49)。對於關鍵生物技術、基礎研究與組織再生的研究也具應用潛力^(35,36)。 複製的供核細胞置入受核體的細胞質，將經歷染色質的重組、DNA 甲 基化、染色體銘印效應 (imprinting)、端粒 (telomere) 長度的回復、組蛋白 (histone) 的修飾作用、epigenetic 傳承及 X-染色體去活化等的複雜過程。目

前，學界對於複製動物的生產效率偏低、發育異常及出生後的高死亡率等

(37)，咸認為可能與供核體細胞的基因再程式化不全而導致發育過程中重要 基因的表現異常⁽³⁸⁾，例如 DNA甲基化異常、X-染色體去活化的異常、銘印 基因的表現以及端粒長度的變異^(39,40)等現象。因此，近年來複製技術針對這 些課題不斷研發改進，期能有效提升成功率與生產效率。

四、複製動物的染色體端粒長度

全球第一頭複製羊「桃莉」出生時，健康狀態即成為大眾關注之焦點。

桃莉羊開啟體細胞複製動物的熱潮，也讓複製動物的老化及端粒長度成為 研究的重點。至今，各種複製動物的端粒已有相當多的研究結果，分別有 端粒變短、端粒正常或端粒變長等分歧的結果⁽⁴¹⁾。複製動物的端粒長度不 一致且具有高度變異性，可能與供核細胞種類、端粒酶再程式化的效率、

動物的個體差異、核轉置的操作步驟、分析時採集到的組織或細胞種類、

動物種別間的不同等，導致複製後基因再程式化及發育潛力的差異⁽⁴¹⁾。

(一)、複製牛

複製牛的端粒長度與同年齡的對照牛隻比較，研究結果並不一致。利 用取自老化的供核細胞產製的複製仔牛，端粒長度可以回復正常⁽⁴²⁾，或甚 至比對照仔牛還要長⁽⁴²⁾。應用不同供核細胞生產的複製牛其端粒長度有顯

著的變異⁽⁴⁰⁾，例如應用胎體成纖維細胞生產的複製牛其 DNA 及組蛋白甲 基化異常現象較使用顆粒細胞者為高，發育率也較低⁽⁴³⁾。不同供核細胞生 產的複製動物，端粒的維持受到 epigenetic 機制及未知遺傳因子等調控，

且端粒結合蛋白 TRF1、TRF2 與 TIN2 等也參與端粒的調節，藉由直接抑 制或強化端粒酶與端粒的結合而改變端粒結構，有效的抑制或促進端粒酶 的作用⁽⁴⁴⁾。不同組織或器官的端粒長度也不同，如複製公牛的皮膚端粒與 對照動物相似，但睪丸的端粒長度則明顯較正常對照公牛為短，可能因端 粒結合蛋白之再程式化異常所引起⁽⁴⁵⁾。

牛胚在早期發育的過程，均可見端粒酶的表現⁽⁴⁶⁾。應用成體或胎體成 纖維供核細胞生產的複製牛胚，在著床前桑椹期與囊胚期的端粒與正常牛 胚相似，均較牛卵母細胞或精子為短；而成體細胞者又較胎體成纖維體細 胞為短。正常體內胚或體外生產（in vitro production）之桑椹胚的端粒長度 相近且均較複製的桑椹期牛胚為長。而體外生產或複製囊胚之端粒，均較 桑椹期為長⁽⁴⁷⁾，顯示牛胚的端粒延長約發生在囊胚期，此時端粒酶強烈表 現並調節端粒長度⁽⁴⁶⁾。應用成體或胎體成纖維細胞產製的複製桑椹期-囊胚 具有正常的端粒延長作用⁽⁴⁷⁾，顯示細胞核之再程式化或生殖細胞中端粒的 結構重組與端粒酶活性，或許是促進複製動物端粒回復的主因⁽⁴⁸⁾。

(二)、複製羊

在 1999 年，參與桃莉羊研究的 PPL公司曾檢測桃莉羊的染色體端粒 長度，發現較同齡之正常綿羊短了 20%⁽⁵⁰⁾，推測桃莉羊可能因繼承 6 歲 母羊的端粒，且在進行複製之前供核體細胞經體外培養了一段時間故使端 粒進一步變短。Clark et al.⁽⁵¹⁾應用成纖維細胞生產做為供核細胞的複製綿羊 中，僅部分具有正常的端粒長度；應用上皮細胞產製的複製綿羊，端粒長 度比對照動物為短。應用SCNT複製的公山羊，睪丸之端粒酶活性與對照公 羊並無顯著差異，雖然端粒較正常對照羊隻短，但SCNT複製羊的外表正常 且身體健康，同時具有正常的生殖能力⁽⁴²⁾。

(三)、複製豬

複製豬與基因轉殖豬的生產，在關鍵性生物技術的發展上具有重大潛 力⁽⁵²⁾。當人類的器官缺乏時，豬將是最有可能成為異種器官的供應動物。

應用遺傳工程技術修飾供核細胞的基因，可生產與人類免疫系統相容的基 因改造複製豬，是未來具有應用潛力之技術。然而複製豬的生產效率至今 仍較其他家畜為低，複製豬胚轉殖後最終能順利產下且存活的比率約只有 1%⁽⁵³⁾；這可能與體細胞之基因再程式化不完全有關⁽³⁸⁾。

Jiang et al. ⁽⁵⁴⁾ 曾研究複製豬的端粒長度，結果與自然繁殖生下的豬在 不同年齡與組織中並無差異。不同年齡豬隻之不同組織端粒長度介於 9~23 kb 之間。取自豬胎之 6 個器官的端粒長度介於 20.7~21.7 kb 間，平均長

21.2 kb。到了發身之前與性成熟的豬其端粒長度明顯較短。因此，估算豬 自胎期至發身前期之端粒約短少 4 kb，而由發身前期至性成熟期又將短少 1.5 kb。發身前期與成熟豬隻之不同器官，端粒長度具有顯著的差異。發身 前期豬隻的皮膚與性腺細胞之端粒長度分別為 18.0 ± 0.4 kb與 18.20 ± 0.6 kb，比腎臟、肝臟與心臟細胞之端粒為長。而性成熟後豬隻皮膚與性腺細 胞的端粒分別為 16.1 ± 0.8 kb與 16.6 ± 0.9 kb，較其他組織為長，肝臟細胞 的端粒最短，僅 14.0 ± 1.0 kb。

轉殖綠色螢光蛋白基因 (eGFP) 的胎體成纖維細胞株與表現 eGFP 的 成纖維細胞株，端粒分別長 18.5 kb與 19.1 kb。eGFP 基因轉殖複製豬，皮 膚細胞之端粒為 20.1 kb。轉殖 eGFP的胎體成纖維細胞，端粒較對照胎兒 細胞短約 2 kb，顯示細胞在培養過程會導致端粒變短。4月齡的複製豬其皮 膚細胞之端粒與同齡對照豬並無差異。兩隻分娩後第 3與第 7天早夭的複 製豬，其皮膚端粒分別長 24.7 kb 與 21.9 kb，與懷孕 70 天豬胎兒的 23.3

± 2.0 kb 與 21.7 ± 0.6 kb 沒有明顯差異。

豬、人與小鼠出生後，不同組織的端粒已經不等長，器官間端粒長度 有明顯差異。體細胞複製豬的端粒回復如同複製牛胚般有賴於端粒酶的作 用⁽⁵⁵⁾。Miyashita et al. ⁽⁴⁸⁾ 使用不同供核細胞生產的複製牛，端粒之長度明 顯不同。來自年老動物的供核細胞無法使全數的複製後代回復端粒長度；

應用輸卵管及乳腺上皮細胞生產的複製仔牛，其端粒較對照仔牛為短。而

Jiang et al. ⁽⁵⁴⁾ 的研究證明應用端粒較短的細胞所生產的複製豬，端粒可以 回復到正常同齡豬隻的長度。Jeon et al. ⁽⁵⁶⁾ 分析複製豬及複製牛的端粒，

並與供核的胎體成纖維細胞及同齡正常豬隻比較，發現複製仔豬或基因轉 殖複製仔豬的端粒正常，而複製牛的端粒並未比成體成纖維供核細胞長。

在供核細胞、源自成熟或剛出生豬與牛的正常組織，均可測得端粒酶 的顯著活性，若以酶之活性強弱區分，豬的耳朵細胞又較牛的耳朵細胞或 其他體細胞要強烈。複製仔牛、複製仔豬及供核體細胞具有相似的端粒酶 活性。正常豬與基因轉殖複製豬的端粒酶活性沒有差異。複製豬囊胚與供 核細胞或體外受精豬囊胚比較，其端粒酶活性增強，推測複製仔豬的端粒 延長可能與囊胚期較強的端粒酶活性或其他調控機制有關⁽⁵⁷⁾。而應用培養 的成纖維細胞產製的複製仔豬，其端粒可回復至自然配種所生同齡正常仔 豬。

Jeon et al. ⁽⁵⁶⁾ 應用轉基因雌性成纖維供核細胞進行 SCNT，產製了 15 頭複製豬中有 3 頭帶有 eGFP 或人類血球生成素 (human erythropoietin, hEPO)。非基轉與基轉複製豬之端粒分別為 25.2 ± 0.5 kb 與 24.8 ± 0.5 kb，

兩者並無差異，但均比供核細胞的 22.8 ± 0.5 kb 為長。而供核細胞、複製 仔豬與成豬皆具有顯著的端粒酶活性，豬的組織比牛者具有明顯的端粒酶 活性。應用成體成纖維細胞、輸卵管細胞與卵丘細胞進行 SCNT，以胎體 成纖維細胞產製的豬胚發育最佳，此或許因為胎體成纖維細胞較已分化細

胞在複製時更容易進行基因再程式化所致^{(54, 56)}。 本研究之目的

(一)選殖白色來亨雞的端粒酶基因並進行 DNA 序列分析，探討端粒酶 基因中的調控區域，再次選殖與構築端粒酶之表現載體，發展有效延長家 禽體細胞體外培養的技術平台，簡化家禽始基生殖細胞 (primordial germ cells, PGC) 的長期體外培養，以利後續利用 PGC 進行基因轉殖的研究。

( 二 ) 分 析 體 細 胞 核 轉 殖 (somatic cell nuclear transplantation, SCNT) 複 製 牛 、 羊 、 同 年 齡 非 複 製 對 照 動 物 與 供 核 體 細 胞 的 端 粒 (telomere) 長 度 ， 以 了 解 複 製 動 物 與 非 複 製 動 物 之 染 色 體 端 粒 長 度 。

第 二 章 材 料 與 方 法 一、實驗動物：白色來亨雞 (White Leghorn Chicken)

(一) 白色來亨雞端粒酶基因互補 DNA (complementary DNA, cDNA) 的 選殖

1.白色來亨雞原腸期胚之顯微抽取、RNA萃取與反轉錄-PCR (reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)：白色來亨雞的雞蛋經過 18 h 孵化，此 時雞胚發育至原腸期，再利用顯微操作取出雞胚 (圖 1)，萃取總 RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen) 供進行 RT-PCR。RT-PCR 的反應體 積為 10 µl，內含雞胚之總 RNA、RT 緩衝液、SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen, CA) 、 Oligo (dT)_12-18引 子 (Invitrogen, CA)、DTT及 RNAsin (Promega, USA)。反應條件為 42℃

1h。製備的 cDNA 即可供 PCR 選殖基因之用。

2. PCR及膠體電泳分析：以原腸期雞胚萃取的總 RNA 反轉錄的cDNA 做為模板。參考 NCBI 網路資料庫中家禽端粒酶基因全長 cDNA (access no. AY626231) ， 該 段 序 列 為 雞 (Gallus gallus gallus) telomerase reverse transcriptase (TERT) 基因 cDNA。應用Vector NTI 軟體設計選殖雞端粒酶基因全長 cDNA之引子，sense primer：

GCTGCGTGCGGGGATGGA 、 antisense primer ：

AACAGGAAATGCAAATATACCAAG 。 進 行 PCR (i Cycler ， Bio-Rad ,USA） 擴增出 4,799 bp 片段產物。PCR 反應液含有 10 µM的 sense 與anti-sense引子各 1 µl、Taq DNA聚合酶 0.5 µl (5 U/µl) (Roche, Germany)、10× PCR buffer 3µl、2.5 mM dNTP 0.6 µl及

ddH

O 22.9µl ， PCR 反 應 總 體 積 為 30 µl 。 PCR 條 件 為

denaturation：94℃ 2 min，之後進行 30 次循環 94℃ 15 s、68 ℃ 30 s、72℃ 2.5 min；72℃ 7 min，反應後保持在 4℃。進行膠體電泳分 析時，取 10 µl PCR 產物，加入 2 µl的 6× Loading buffer，置入 2 % 瓊脂糖 (agarose) 膠片內，於 0.5× 的TAE (Tris-Acetate-EDTA) 液 中進行電泳，條件為 100 Volt 30 min。電泳後將膠片置入染液 [0.5×

的TAE內含 0.1µg/ml 的溴化乙錠 (ethidium bromide)] 中染色，並 於紫外燈箱上觀察並記錄結果。

3. DNA 片段回收與選殖、DNA 與轉譯胺基酸序列之分析與比對：選 殖之 PCR 產物，應用序列分析儀 (ABI 3730) (Applied Biosystems Inc., CA) 進行 DNA 序列分析。完成 DNA 序列分析後，利用 Vector NTI 軟體或網路資料庫 NCBI 中的 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 進行序列比對或轉譯為蛋白質之胺基酸序 列，以了解選殖基因的正確性並比較網路資料庫中相似的基因或蛋

白質序列。

(二)白色來亨雞端粒酶基因啟動子區域之選殖

1. 白色來亨雞血樣品之採集與 DNA 萃取：自白色來亨雞之翼下採集 血樣，置入已添加抗凝血劑 (EDTA) 之離心管，利用染色體 DNA 純化套組 (DNeasy Blood and Tissue kit, Qiagen, GmbH) 進行染色 體 DNA 之 萃 取 並 加 以 定 量 (Nano Drop, ND-1000 Spectrophotometer, USA)。

2. 選殖白色來亨雞端粒酶基因啟動子區域與 3’未轉錄區域之引子設 計：參考National Center for Biotechnology Information (NCBI) 網路 資料庫有關家禽端粒酶基因 (access no. AH013710) 序列，該序列含 有 雞 (Gallus gallus gallus) TERT 基 因 啟 動 子 區 域 (access no.

AY505015S1) 及 3’ 未轉錄區域 (3’UTR) (access no. AY505015S2) 兩段序列。啟動子區域包括了部分表現子 1 (exon 1) 序列，應用 Vector NTI軟體 (Infor Max Inc, USA) 剪貼端粒酶基因轉錄起始點 ATG 開始的 500 bp，設計雞端粒酶基因啟動子區引子為sense Primer ： GGTTGCCCATACTGCCAAT 、 antisense Primer ： CAGCAAGGAGTATCCATACGC。進行聚合酶連鎖反應 (PCR) 擴

增出 1,307 bp 的片段產物 (1~901 為啟動子區域、902~1025 為 Exon 1 部 分 序 列 ) 。 3’ 未 轉 錄 區 域 引 子 序 列 為 sense primer ： CTGTGCCTAGCAAGATATGTGG 、 antisense primer ： CAAAATTTATACCAACCTGCAAC。進行PCR 擴增出 609 bp 的片 段產物 (序列 1~508 為 exon 末端、509~957 為 3-UTR區域)。

3. PCR 及膠體電泳分析：使用純化的白色來亨雞染色體 DNA 進行 PCR 進行 PCR 之儀器及條件同一、(一) 2，但 annealing 温度調整 為 60-65℃。

4. DNA 片段回收與選殖：將 PCR 產物切下，利用 Qiaquick Spin Gel Extraction columns 膠 體 回 收 套 組 (Quiagen, GmbH) 回 收 純 化 DNA 片段，利用 TOPO Vector system II (Invetrogen, USA) 進行 T-A 選殖入多選殖位置 (multiple cloning site, MCS)，再轉型入勝任細胞 (competent cells) E. coli 內，俾進行 DNA 序列分析。

5. DNA 序列分析與比對：同一、(一) 3 的方法進行 DNA 序列之 BLAST。

二、體細胞核轉殖 (somatic cell nuclear transplantation, SCNT) 生產的複製 牛、羊與供核體細胞的端粒 (telomere) 長度分析

(一) 試驗動物：應用 SCNT 技術生產的 4 頭「如意家族」複製牛及複製 羊，分娩日期及年齡資料如表 3 及表 4 所示。做為 SCNT 牛羊同年 齡的對照非複製牛羊亦採集血樣萃取染色體 DNA。

(二) 血樣採集與染色體 DNA 萃取：自乳牛尾根採集全血，置入已添加抗 凝血劑 (EDTA) 之離心管，經 1,000 rpm 離心分離白血球，再利用染 色體 DNA 純化套組 (Qiagen, GmbH) 並依照操作步驟進行染色體 DNA 之萃取與定量。

(三) 供核體細胞：取自牛與羊耳朵組織體外培養的成纖維細胞做為生產複 製牛與羊的供核細胞。牛與羊的供核體細胞分別培養並繼代。體細胞 之體外培養條件為 10 % 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS) 之 DMEM (Dulbecco^,s modified Eagle^,s medium) 培養基，當細胞數目達到 約 2 × 10⁷ 時 用 trypsin/EDTA (0.25 ％ trypsin/0.02 ％ EDTA ； GIBCO/BRL）回收供萃取染色體 DNA 以分析端粒長度用。

(四) 端粒長度分析：端粒長度分析乃應用 Telo TAGGG 端粒長度分析套組 (Roche Molecular Biochemicals, Canada) 並按依其方法測定端粒限制片 段長度（Telomere Restriction Fragment, TRF）。首先將萃取的牛羊染色 體 DNA (1~2.5µg) 經過限制酶HinfI/RsaI (4U/µg 染色體 DNA) 在 37

℃作用 12~16 h後，進行 0.8 % 瓊脂糖膠體電泳，電泳條件為 10V/cm

進行 24 h。電泳後膠體經過變性(denaturation)、中和 (neutralization) 及 南方轉漬 (Southern blotting) 到帶正電之尼龍膜 (Roche Diagnostic, GmbH, Mannheim, Germany)，再與biotinylated Telomere Probe (Roche Molecular Biochemicals) 進行雜合反應 (hybridizaiton)；最後在 X-光片 上 (Kodak, USA) 自動放射顯影或應用化學螢光測定儀 Luminescent Image Analyser (LAS-3000, Jujifirm, Japan) 攫取影像後計算密度，再以 電腦軟體計算平均端粒限制片段(Telomere restriction fragment TRF) 長 度⁽⁶⁷⁾。計算公式為

(五) 統計分析：複製牛羊及其後代的平均 TRF 測定後與對照正常動物比 較，以統計軟體進行 student^’s t-test 分析，差異顯著水準為 p＜0.05。

第三章 結果 一、家禽 TERT 基因之選殖

雞的 TERT 活性雖然可以在孵化前的胚葉細胞中測得，但是在 原腸期之雞胚中將會顯著表現。本研究採集已孵化 18 h 的白色來 亨雞蛋為材料，應用顯微操作抽取原腸期雞胚做為總 RNA 的來源 (圖 1)，經過 RT-PCR 合成 cDNA做為模板，設計 TERT 特異引子 進行 PCR 以選殖標的 TERT 基因。擴增 TERT 的引子序列係參 考網路資料庫編號 AY626231 的基因序列，先行針對 TERT 基因 前、中與後段設計引子，進行 PCR 並獲得預期之片段產物 (圖 2)。

而進行全長 TERT 基因選殖之前，也先行應用 PCR 測定源自原腸 期雞胚或體細胞樣品所建構的 cDNA 庫中是否存在著標的基因，結 果可自原腸期雞胚 cDNA 庫的模板中順利擴增出長度 508 bp 的 TERT 與 283 bp 的陽性對照3-磷酸甘油醛脫氫酶 (GAPDH, 管家 基因) 基因片段產物；而源自家禽體細胞的 cDNA 只能擴增出

GAPDH 基因產物而未見到 TERT 的表現 (圖 3)。自雞胚樣品所擴 增之 508 bp TERT 產物經膠體回收、 DNA 序列分析及 BLAST，

顯示為正確之 TERT 部份序列 (圖 4)。故試驗進一步應用 PCR 擴 增 TERT 基因前段、中段與後段產物並分別成功獲得不同長度的片 段產物 (圖 5)。證明 cDNA內確實含有完整的 TERT 基因。

本研究也擴增 TERT 基因的啟動子區域與 3’ 端未轉錄區，結 果亦自白色來亨雞之染色體 DNA 中分別擴增獲得 1,307 bp 及 609 bp 的片段長度 (圖 6)。由於 TERT 長度達 4.7 kb，經多次試 驗並修正引子序列與 PCR 條件後，終於順利擴增一條長 4.7 kb 的 特異性 TERT 基因產物 (圖 7)。將此全長 TERT 產物選殖入 TOPO Vector system 載體供進行 T-A cloning，再應用限制酶 XhoI/

SacI 切割以確認插入片段，結果切割出長 4.7 kb 的片段 (圖 8)。

此一完成選殖的序列分析質體命名為 pchTERT TOTP，長 8,418 bp (圖 9)。本試驗選殖的白色來亨雞全長 TERT 基因 DNA 序列經過 NCBI 的 BLAST 比對後，依照與 TERT 基因的序列相似度進行排 序，其中相似度最高者為家雞 TERT 全長 mRNA 序列 (Gallus

gallus telomerase reverse transcriptase (TERT))，基因庫之編號分別為

NM_001031007.1與 AY502592.1，相似度達到 99% (圖 10，圖 11，

表 1)。故可以確定為雞的 TERT 基因。選殖的白色來亨雞 TERT 應用分析軟體進行核酸序列轉譯，結果為一含有 1,346 個胺基酸的 蛋白質 (圖 12)。將雞的 TERT 蛋白質進行 BLAST 比對，結果與 其相似程度最高的 10 種蛋白質序列如表 2及圖 13 所示。其中相 似度最高的序列即為編號 NP_001026178.1 的雞 TERT，兩種蛋白 質的胺基酸序列進行 BLAST，相似程度達到 99% (圖 14)。本研究

已成功選殖白色來亨雞的全長 TERT 基因，該構築體將可供後續基 因轉殖及家禽 PGCs 長期體外培養研究之用。

二、複製動物的染色體端粒長度

分析行政院農業委員會畜產試驗所應用 SCNT 生產的複製 牛、羊及其後代，在不同年齡的端粒長度，並與同年齡非複製動物 比較，以了解複製動物及其後代與對照非複製動物間的端粒長度是 否有差異。試驗自複製牛、羊及同年齡對照非複製動物採集全血，

並 萃 取 染 色 體 DNA ， 然 後 應 用 套 組 測 定 端 粒 限 制 片 段 長 度 (Telomere Restriction Fragment, TRF)。有關複製牛羊及對照動物的性 別與年齡等基本資料如表 3 及表 4 所示。試驗結果顯示，年齡在 2 歲至 3 歲間的 4 頭複製牛端粒長度分別為 17.03 kb、17.92 kb、

17.92 kb及 17.19 kb，平均端粒長度為 17.52 ± 0.41 kb；而 4 頭同 年齡同性別非複製牛之端粒長度分別為 17.79 kb、17.96 kb、17.86 kb 及 17.03 kb，平均端粒長度為 17.66 ± 0.32 kb (圖 15、16、表 5)。

複製牛的 4 頭後代之端粒長度分別為 17.92 kb、17.80 kb、17.92 kb 及 17.03 kb，平均端粒長度為 17.67 ± 0.32 kb；而 5 頭後代對照非 複製牛之端粒長度分別為 18.31 kb、19.4 kb、19.21 kb、18.2 kb及 18.31 kb，平均端粒長度為 18.69 ± 0.50 kb，做為供核體細胞的端粒

長度則為17.30 kb (圖 15、16、表 5)。複製牛在 3 至 4 歲時的端 粒長度分別為 17.65、17.31、17.82及 17.13 kb，平均端粒長度為 17.48 ± 0.31 kb；而 6 頭同年齡同性別非複製牛在之端粒長度分別 為 18.76、15.04、19.47、17.59、17.31及 18.62 kb，平均端粒長度 為 17.80 ± 1.57 kb；供核體細胞之端粒長度為 17.07 kb (圖 17、

18 )。結果顯示，複製牛及其後代之端粒長度與非複製正常動物之間 並無顯著差異存在（p＞0.05）。本研究顯示應用複製技術生產的乳 牛，其端粒長度在經過 NT 操作之後，胚在發育過程其染色體能順 利地再程式化，使端粒長度回復正常，並未因為以成體供核體細胞 進行複製而導致端粒短化。

複製羊的分析結果，年齡在 50、22及 6月齡的複製羊 1、2 及 3 號，端粒長度分別為 16.68 kb、17.05 kb及 14.32 kb；而與 3 隻 複製羊相近月齡非複製羊的端粒長度分別為 16.92 ± 0.73、17.04 ± 0.62 及 17.37 ± 0.32 (圖 19、20 與表 6)。複製羊的 5 頭後代之端 粒長度，分別為 15.5、15.86、16.67、16.13及 16.21 kb，平均端粒 長度為 16.07 ± 0.32 kb；而 4 頭對照非複製羊的端粒長度分別為 16.37、15.77、16.58 及 17.01 kb，平均端粒長度為 16.43 ± 0.36 kb (圖 19、20 表 6)。複製羊 1、2及 3 號在 62、34 及 18 月齡的端粒 長度，分別為 12.26、13.50 及 10.39 kb；而與複製羊月齡相近的 3

組非複製羊，端粒長度分別為 16.08 ± 0.86、15.72 ± 0.61及 16.32 ± 0.61 kb (圖 21)，而做為供核之體細胞株 GE1244P2 與 GE0918P8 之端粒長度分別為 14.86 kb 與 14.20 kb。顯示不同月齡之複製羊其 端粒長度顯著較非複製羊為短 (p<0.05)。本研究顯示，應用 SCNT 技術生產的複製羊，其端粒長度較正常非複製羊為短，且隨著月齡 的增加，端粒長度的減損將顯著較非複製羊明顯。

第四章 討論 一、家禽端粒酶基因之選殖

本研究之目的在選殖白色來亨雞的 TERT 基因。TERT 的活性 在原腸期之雞胚中顯著的表現^(58,59)。故本研究採集白色來亨雞孵化 18 h 的雞蛋做為材料，應用顯微操作抽取原腸期雞胚做為總 RNA 來源，經 RT-PCR 合成 cDNA 做為模板，配合選殖 TERT 的引子 進行 PCR，已成功選殖白色來亨雞的全長 TERT 基因，將進一步 次選殖入表現載體，供未來基因轉殖及家禽 PGCs 長期體外培養研 究之用。

關於雞的 TERT 已有學者研究其 DNA 序列與胺基酸的結構

(19)。本研究參考選殖雞的 TERT 方法與 DNA 序列，設計特異之引 子選殖白色來亨雞的 TERT 基因。由於雞的 TERT 基因長 4.7 kb 且含有 GC 核苷酸的比例甚高，研究進行之初經多次嚐試不同 PCR 條件及各種聚合酶均難以順利擴增全長的基因產物，經不斷嘗 試並修正引子序列與 PCR的各種條件，終於順利擴增全長的 TERT 產 物 。 本 研 究 選 殖 的 TERT 序 列 經 BLSAT 比 對 ， 與 NP_001026178.1 之序列相似性最高，達到 99%。雞 TERT 之 DNA 序列轉譯成胺基酸後，為含有 1,346 個胺基酸 (NP_001026178) 的 蛋白質。雞 TERT 之胺基酸序列雖與其他動物具有一定相似性，較

特別之處是雞的 TERT N-端含有一 298 個胺基酸之具彈性連接子 (linker)，而非洲爪蟾蜍、人、小鼠、大鼠、倉鼠則分別長 199 個、

154 個、158 個、158 個與 161 個胺基酸 (附錄 3)，故雞的 TERT 蛋白質較大。雞的具彈性連接子與不同種別動物比較，胺基酸序列 具有高度變異性，幾乎沒有甚至相似性極低⁽¹⁹⁾。而其他脊椎動物的 TERT研究與蛋白質結構亦有學者探討(18, 20, 60, 61)。

脊椎動物間的 TERT 在 C 端反轉錄酶區具有高度相似性，其 中，又以 motif E 之保留性最強，胺基酸之相似度達 70%。雞的 TERT胺基酸與人、非洲爪蟾蜍、小鼠、大鼠、倉鼠之相似性分別達 45%、38%、41%、40% 與 42%。而脊椎動物 TERT 的 N 端區域

(20)

保留性反轉錄酶區域⁽²¹⁾ 具有高度結構相似性，推測這些保留區 域應具有重要的理化功能⁽²²⁾ 。人的 TERT 在 5’ 端鄰近啟動子區 域內含有 E-box、Ik1、MAZ 與 Sp1 位置等各種轉錄因子結合區。

在基因庫中雞的 TERT 基因序列，包括了 5’ 端鄰近啟動子序列與 部 份 密 碼 子 序 列 (AY505015) 、 3’ 端 未 轉 譯 區 及 鄰 近 序 列 (AY505016) 及 5’ 端未轉錄區 (UTR) (AY502592 ) ⁽¹⁹⁾。

而依據人的TERT，可將雞的 TERT 區域分為：region v-I (1~196)、region v-II (495~531)、region v-III (554~588)、region v-IV (625~753)、motif T (756~803)、motif 1 (814~838)、motif 2 (839~870)、

motif A (915~950)、motif B’ (1038~1072)、motif C (1078~1094)、motif D (1095~1120) 與 motif E (1139~1149) (附錄 1 與 3)。雞的 TERT 在 v-I 區域與 v-IV 區內，分別含有其他脊椎動物所缺乏的 15 與

27 個胺基酸序列。若依據相似度的變異做為參數，則區域 (region) 可再區分為 3 個次區域 (domains)，分別為 v-V (aa 1153~1175, 34%)、v-VI (aa 1180~1252, 65%) 與 v-VII (aa 1254~1346, 29%) ，不 同種別動物間在 3’ 端未轉錄區內之變異甚大⁽²⁰⁾。

雞 TERT 之 5’ 端鄰近啟動子區域，主要包括了一個位於－

259 開始一直延伸到 + 727 bp 的 CpG 小島；自 5’ 鄰近啟動子區 域的 940 bp 到密碼子起始的 125 bp 內，存在 80 個以上的轉錄因 子 結 合 位 置 ( 附 錄 5) 。 5’ 區 域 之 motifs 含 有 許 多 CACC 及 CCAAT、Sp1、 GR 及 c-Myb、各式 NF 與 AP 位置、E-box 等 序列。在鄰近密碼區 340 bp 與 125 內的 Sp1、c-Myb、AP-1、

AP-2、一個與 Sp1重疊的 MAZ 等 motif 位置。此區域內也確定含 有 NF-1、NF-1/L、NF-ATh、E-box (c-Myc/Mad 1/Max site)、CCAAT 及 CACCC 等位置。比較雞與人的 TERT 5’ 端啟動子區 (500 bp)，發現雞的 TERT 內含有許多與人相似的轉錄因子結合區，例 如 Sp1、MAZ/Sp-1、E-box、Ik1、NF-1 與 AP-1等 (附錄 4)。雞的 TERT 序列中確定沒有 c-Ets-2 或 WT1 的位置。在人的 TERT 近

側啟動子及 5’端未轉錄區內，含有許多雞所欠缺的 motif，包括 E-box 及二個 Sp1 位置。而雞在轉錄起始點區域內僅含一個 Sp1 位置、在 5’端區域含有 4 個 c-myb 結合區是比較特別的。

端粒酶是核醣核酸蛋白質反轉錄酶的一種，由重複序列 (TR) 與具有端粒反轉錄酶 (TERT) 活性的蛋白質所組成⁽³⁷⁾。TR 的 RNA 普遍存於動物細胞中，但唯有含 TERT 的細胞才具有端粒酶活性。

端粒酶的活性受到多重機制的調控，除了端粒酶直接作用之外，其 他的作用因子也對端粒產生調控作用。將外源 TERT 轉殖入體細 胞，可以產生端粒酶活性而預防端粒受侵蝕，克服細胞衰老與危機 使細胞達到永生狀態。選殖家禽 TERT基因的重要性，在於源自雞 的體細胞經過體外培養分裂數次後即進入增殖老化期⁽²³⁾，與染色體 末端的端粒結構短化有密切關係，因為端粒可以保護染色體末端免 於斷裂與融合⁽¹²⁾。雞的染色體端粒 DNA 較人類多 10 倍。維持端 粒長度有賴於端粒酶的作用，是負責將 TTAGGG 的序列加到染色 體的 3’端⁽⁶²⁾。缺乏端粒酶的作用，將導致端粒短化及細胞老化。體 外培養的體細胞，可以應用異種間的 TERT 基因轉殖而恢復 TERT 活性，而維持端粒長度，例如將人類的 TERT 基因轉殖表現到人、

綿羊、兔子、牛與鹿的體細胞，因為端粒酶的表現而增加端粒長度，

維持染色體之穩定性而延長細胞壽命^(26-29)。然而將人的 TERT 基因

轉殖到體外培養的家禽體細胞，卻不具有 TERT 的活性而維持端粒 長度⁽⁶³⁾，顯見家禽的 TERT 仍存在著未知的作用機制。目前對於家 禽與其他動物之 TERT 作用或穩定端粒的分子機制差異性尚未完 全了解，但選殖雞的 TERT 基因轉殖入體外培養的家禽體細胞，可 以順利表現 TERT 的活性。因此，若能應用基因轉殖技術將雞的 TERT 轉入家禽之體細胞，對於建立家禽體細胞及始基生殖細胞系 的體外長期培養系統將有莫大助益利，且能供家禽端粒變化及細胞 老化模式之研究⁽¹⁷⁾。

本研究成功選殖了白色來亨雞 TERT 基因，將進行後續基因轉 殖到體外培養的家禽體細胞，再分析細胞的端粒長度及端粒酶活 性。

二、複製動物的端粒長度

本研究分析畜產試驗所應用體細胞核轉置技術生產的複製牛、

羊及其後代動物，在特定年齡的端粒長度，並與同年齡非複製動物 比較，以了解複製動物及其後代與對照非複製動物間的端粒長度。

試驗從複製牛、羊及同年齡同性別的非複製動物採集全血，經離心 分離白血球供萃取染色體 DNA，然後應用套組測定端粒限制片段 長度 (TRF)。試驗結果顯示，年齡在 2 歲至 3 歲間的 4 頭複製牛 端粒長度分別為 17.03 kb、17.92 kb、17.92 kb及 17.19 kb，平均端 粒長度為 17.52 ± 0.41 kb；而 4 頭同年齡對照牛正常之端粒長度分 別為 17.79 kb、17.96 kb、17.86 kb 及 17.03 kb，平均端粒長度為 17.66 ± 0.32 kb。複製牛的 4 頭後代之端粒長度分別為 17.92 kb、

17.80 kb、17.92 kb及 17.03 kb，平均端粒長度為 17.67 ± 0.32 kb；

而 5 頭後代對照非複製牛之端粒長度分別為 18.31 kb、19.4 kb、

19.21 kb、18.2 kb及 18.31 kb，平均端粒長度為 18.69 ± 0.50 kb。做 為供核體細胞的端粒長度則為 17.30 kb。複製牛在 3 至 4 歲時的 端粒長度分別為 17.65 kb、17.31 kb、17.82 kb及 17.13 kb，平均端 粒長度為 17.48 ± 0.31 kb；而 6 頭同年齡同性別非複製牛在之端粒 長度分別為 18.76 kb、15.04 kb、19.47 kb、17.59 kb、17.31 kb 及 18.62 kb，平均端粒長度為 17.80 ± 1.57 kb，供核體細胞其端粒長度

為 17.07 kb。複製牛與非複製牛之端粒長度無顯著差異。顯示應用 成體供核體細胞進行 SCNT 生產的複製乳牛，其端粒長度與正常非 複製牛相似，推測在核轉置後基因再程式化的過程順利，使端粒的 長度得以回復正常，並未因為使用成體供核體細胞而導致端粒短化 的現象。

複製羊的分析結果，應用 SCNT 生產的 3 頭複製羊 1、2及 3 號於 50、22 及 6 月齡的端粒長度分別為 16.68 kb、17.05 kb 及 14.32 kb；而與 3 隻複製羊相近月齡非複製羊群的端粒長度分別為 16.92 ± 0.73 kb、17.04 ± 0.62 kb 及 17.37 ± 0.32 kb (圖 19 與 20)。

複製羊的 5 頭後代之端粒長度分別為 15.5、15.86、16.67、16.13 及 16.21 kb，平均端粒長度為 16.07 ± 0.32 kb；而 3 頭對照非複製 羊的端粒長度分別為 16.37、15.77、16.58 及 17.01 kb，平均端粒 長度為 16.43 ± 0.36 kb。複製羊 1、2 及 3 號在 62、34 及 18 月 齡之端粒長度，分別為 12.26 kb、13.50 kb 及 10.39 kb；而與 3 隻 複製羊相近月齡非複製羊群，端粒長度分別為 16.08 ± 0.86 kb、15.72

± 0.61 kb及 16.32 ± 0.61 kb，複製羊之端粒長度顯著較非複製羊短 (P<0.05)。

有關各種複製動物的端粒長度已有學者加以歸納⁽⁶⁴⁾ (附錄 2)。

Kubota et al.⁽⁶⁵⁾曾連續複製日本和牛種公牛，生產的複製牛外表健康

且具正常端粒長度。而測定第一代與第二代複製牛的成纖維細胞與 白血球之端粒長度卻明顯不同。供核細胞經過體外培養並繼代 15 次，端粒長度為 14.7 ± 0.4 kb至 12.8 ± 0.4 kb，約減少 63 bp/細胞倍 增。第一代與第二代複製牛的成纖維細胞，平均端粒分別為 15.4 ± 0.5 kb至 16.1 ± 0.7 kb，與自然配種所生的同齡正常非複製仔牛相 似，且均比原來供核公牛的端粒為長。供核細胞、第一代與第二代 複製牛的白血球端粒分別為 13.8 ± 0.8 kb、15.3 ± 0.8 kb與 15.7 ± 0.8 kb。供核細胞的端粒較皮膚成纖維細胞為短。複製牛的端粒回復與 牛胚發育至特定階段時端粒酶的高度活性有關係。

牛與人的精子均維持相當的端粒長度⁽⁶⁶⁾。生殖細胞系的端粒短 化，可經由端粒酶的作用而修補。12 歲的日本種公和牛因遺傳性能 優異而有產數以萬計的優良後代。應用SCNT生產的二頭日本種公用 和牛，在體型、外表行為及採精量、精子濃度、冷凍耐受性、體外 受精 (in vitro fertilization, IVF) 效率與精液性狀均在正常範圍，精液 供人工授精也順利產下正常仔牛。正常公牛與 2 頭複製公牛精子的 端粒分別為 22.42 kb、25.8 kb與 20.9 kb。而來自老公牛的供核肌肉 細胞及精子的端粒分別長 20.1 kb與 22.2 kb，顯示正常的端粒長 度。採自端粒較長複製公牛的精液進行人工授精，生下 9 頭外表健 康的雌性仔牛，其出生體重、生長速率與行為均與正常仔牛無異，

顯示複製公牛供種畜應用的可行性。仔牛與正常對照仔牛的白血球 端粒分別為 20.06 ± 0.45 kb與 19.97 ± 0.41 kb ⁽³⁶⁾。

Tian et al. ⁽⁵⁵⁾應用 13 歲乳母牛的成纖維細胞與卵丘細胞做為 供核源，產製 10 頭複製仔牛中，有 6 頭在分娩後夭折，僅 4 頭 仔牛存活，這 4 頭複製仔牛之端粒長 15.38 ± 0.62 kb，與正常對照 仔牛之 14.73 ± 0.49 kb 並無顯著差異，且均比較供核母牛的 12.43

± 0.49 kb 為長。而分娩後早夭的 6 頭複製仔牛，端粒長 15.87 ± 0.40 kb，與存活的複製仔牛相似，顯示取自 13 歲乳牛的供核細胞 雖然端粒較短，但經過複製後無論子代能否存活，均能使供核體細 胞的端粒回復，而複製仔牛出生後高損失率似與端粒變短無關。母 牛的成纖維體細胞在體外培養過程端粒會逐漸變短，短化速率平均 為 155 bp/繼代 (或＞100 bp/細胞倍增)，而人或綿羊之端粒短化速 率約 50 bp ⁽⁶⁷⁾與 172 bp ⁽⁶⁸⁾/細胞倍增。複製與體外培養的 IVF 牛 胚，在整個發育過程可測得端粒酶的活性，但在囊胚期時端粒酶的 活性上升，如同 IVF 牛胚一般⁽⁴⁶⁾。而此結果與綿羊之分析結果有 差異⁽⁵²⁾，顯示動物種別、動物的數量及分析時 DNA 的來源，將會 影響測定的結果。例如白血球的數目會因為動物受感染而明顯增 生。以胎體供核細胞產製的複製牛，端粒較同年齡對照牛隻為長

(69)。以年老成熟母牛供核細胞生產的複製仔牛，端粒長度均在正常

之範圍內⁽⁵⁵⁾。此種差異，應與供核細胞及培養條件不同有關。供核 細胞僅短暫的體外培養或經長期培養至近乎老化期才進行複製的程 度 ⁽²⁸⁾。應用老化的供核細胞，進行 SCNT 後或許因基因再程式化 時之過度補償作用，而導致複製個體的端粒較應用胎體供核細胞者 為長⁽⁵⁵⁾。

Lanza et al. ⁽⁶⁹⁾分析雌性複製仔牛組織的端粒，結果與同年齡對 照牛隻相似；取自胎體或老化之成纖維細胞，均可以重建端粒長度 並延長了增殖壽命。應用老化的供核細胞，生產的複製仔牛，有端 粒明顯加長或長度重建的結果，而到了 5~10 月齡，複製牛之白血 球端粒較同齡對照牛或初生牛為長⁽⁴²⁾。Miyashita et al. ⁽⁴⁸⁾ 應用取自 不同組織的 4 種供核細胞生產之複製牛，端粒的長度明顯不同，應 用上皮細胞者產製的複製牛，其端粒長度明顯比肌肉細胞或成纖維 細胞者為短。而 7歲母牛的端粒長 19.5 ± 0.5 kb，10 歲供核母牛的 耳朵成纖維細胞端粒為 18.5 ± 0.5 kb，較 7 日齡新生仔牛的 20.5 ±

0.5 kb 為短⁽⁵⁶⁾。複製牛 1.5 歲的端粒平均為 18.0 ± 0.5 kb ⁽⁵⁴⁾。 為了解釋複製牛胚及小鼠胚在發育過程的端粒延長作用，學者 應用老化供核細胞生產複製動物，發現端粒可以回復正常⁽⁶⁷⁾。在體 外胚的生產 (in vitro production, IVP) 條件下，端粒長度的調節除受 端粒酶的活性影響外，也受到其他端粒結合蛋白質的調控 ⁽⁷⁰⁾。核轉

置或孤雌生殖牛囊胚，端粒酶的表現會增加，端粒之長度經由端粒 酶-依存 (dependent) 的機制，決定桑椹期或囊胚期。而體內胚、

IVP、複製牛胚或小鼠胚，桑椹期-囊胚之轉換是端粒延長的關鍵時 期，顯示著床前的胚發育必然遵循一定之程式進行。此時細胞開始 分化成為內細胞群與滋養葉，緊實的桑椹胚發育成為具有囊腔的囊 胚，在外觀及胚的基因表現均呈現明顯變化的情況相符⁽⁷¹⁾。

在複製羊的部份，SCNT奈及利亞侏儒山羊的端粒長度與供核細 胞有所差異，且其後代之端粒明顯比同齡非複製山羊為短。應用成 體顆粒細胞複製的山羊，皮膚細胞的端粒顯著較非複製動物為短，

而應用胎體成纖維細胞生產的複製公羊，端粒的長度雖有變異但皆 在正常範圍內。複製公羊的皮膚細胞及白血球的端粒較同齡非複製 羊為短。複製羊的睪丸細胞端粒長 9.3 ± 0.52 kb，明顯較非複製羊 之 16.3 ± 1.07 kb為短；複製羊後代的睪丸細胞端粒長 12.8 kb，也明 顯較非複製公羊為短，而睪丸細胞的端粒酶活性則與非複製公羊没 有顯著差異。這些結果，顯示供核細胞種類及複製步驟，會影響後 代之端粒長度。在活體內，端粒變短的速度平均約 0.78 ± 0.28 kb/

每年。動物之血球端粒又較皮膚組織者短約 15 %。正常的奈及利亞 侏儒山羊在 90~135 日齡之端粒為 14.96 ± 0.25 kb，較 775~895 日 齡的老羊 12.71 ± 0.62 kb為長。應用胎體成纖維細胞生產的複製公

羊在 71~350 日齡之端粒長 12.60 ± 0.51 kb，較 69~530 日齡的 5 頭 非複製羊 14.03 ± 0.44 kb為短。應用成體卵丘細胞生產的複製女 羊，在 74~89 日齡之皮膚細胞端粒長 13.28 ± 0.41 kb，顯著較

90~135 日齡的非複製羊 14.96 ± 0.25 kb為短。複製公羊與正常母羊 配種所生的 9 頭羔羊，不論皮膚或血液之平均端粒均較同齡對照羊 為短⁽⁴²⁾。Betts et al. ⁽⁴⁵⁾ 的研究顯示 SCNT 公山羊外表正常、身體 健康，且具有正常的生殖能力。

Clark et al. ⁽⁵¹⁾ 的研究顯示，應用成纖維細胞生產的 SCNT 綿 羊中，僅部分綿羊具有正常的端粒長度；而應用上皮細胞產製的 SCNT綿羊其端粒長度較非複製動物為短。Alexander et al. ⁽⁷²⁾ 分析 SCNT複製綿羊及其性成熟後自然配種所生的 3 隻後代之端粒長 度，同時採集 35 隻 1 至 36 月齡的非複製綿羊做為對照。結果顯 示，應用體外培養的體細胞進行 SCNT產製的綿羊，其端粒長度較 相同年齡的對照羊為短。正常非複製綿羊之 TRFs 平均為 12 至 21 kb之間。而做為 SCNT之供核細胞，體外培養第一代 (P1) 時的 TRFs為 17-19 kb，而源自 SCNT之胎體成纖維細胞在體外培養到 P17 即達到老化階段。正常的對照細胞株則分別在 P25-P27 時達到 老化階段。體外培養的體細胞在 P10 之前，端粒的磨損狀態並不明 顯，但在 P10 之後，端粒將明顯磨損而直到進入老化階段。4 頭 28、

16、13 及 14 月齡 SCNT 綿羊的端粒長度分別為 11.3、14.45、13.85 及 11.75 kb；而同年齡對照綿羊的長度分別為 17.51 ± 0.65、17.45 ± 1.18、17.52 ± 0.37 及 17.52 ± 0.37，兩者比較除了 16 月齡 SCNT 綿羊及其對照羊沒有差異外，其餘均已達顯著差異的水準 (p＜

0.05)。而 SCNT複製綿羊達到性成熟後自然配種所生的後代，則具 有與同齡非複製羊相似的端粒長度。體外培養超過 20 代的供核體 細胞端粒長度顯著較短，且呈現高度染色體數目及結構的異常現象。

由於複製動物的生產效率偏低，可能的主要原因在於 SCNT 後 基因再程式化的錯誤 (epigenetic reprogramming errors) 所致。各種 複製動物之端粒已經有相當多的研究，雖然結果並不一致，經過複 製後，端粒有變短、正常或甚至變長的結果。造成複製動物端粒長 度變異的因素，可能與供核細胞的種類與體外培養條件、端粒酶再 程式化效率、動物的個體差異、複製的操作步驟、分析的組織或細 胞種類、動物種別間的差異等，因而導致複製之後基因再程式化能 力與發育潛力的差異。

本研究應用複製技術生產的複製牛，其端粒長度顯示與非複製 牛無差異，經過 NT 操作之後，複製胚在發育之過程染色體可能已 順利地再程式化，並使端粒回復正常長度。近年來，國內的動物複 製平台已成功建立，且相繼有牛、羊及豬順利產生。而複製技術建

立後，可繼續生產複製動物供做相關研究的材料之外，亦可提供做 為保種或擴增優良種畜的重要方法。此外，複製動物胚發育調控機 制的研究、利用核轉置生產具有高經濟價值基因的轉殖動物、了解 粒線體 DNA 的命運等，對於改善複製生產效率、探討哺乳動物胚 的早期發育機制及基因調控都將有重要影響，亦可做為稀有或瀕臨 絕種動物保育或復育之重要策略。目前，複製動物的生產效率仍然 相當低，透過全球相關實驗室的積極研發，應能夠在未來找到提升 技術及改善生產效率，使複製成為可以商業應用的可行技術。若配 合其他先進之生物技術，將可以成為影響生物醫學基礎研究及實際 應用的關鍵技術平台。

第五章 結論

一、本研究已成功選殖到白色來亨雞之端粒反轉錄酶 (telomerase reverse transcriptase, TERT) 基 因 並 進 行 DNA 序 列 分 析 比 對，期能供基因轉殖並發展延長家禽體細胞體外培養的技術平 台。

二、 本研究已完成 畜產試驗 所應用體 細胞核 轉置 (somatic cell

nuclear transfer, SCNT) 技術生產的複製荷蘭種乳牛與阿爾拜 因乳山羊及其後代動物在不同特定年齡的端粒 (telomere) 長 度，發現複製牛與正常同齡動物並無顯著差異存在，本研究證 明應用 SCNT 技術生產的複製牛，其調控端粒長度的相關基 因可以順利的進行再程式化，使端粒維持一定的長度水準，並 沒有因為使用成體之耳朵成纖維細胞做為供核細胞而導致端粒 短化的老化現象。但複製羊則顯著（p＜0.05）較正常同齡對照 羊為短。本研究顯示，應用 SCNT 技術生產的複製羊其端粒長 度較正常對照為短，隨著月齡的增加，端粒的長度顯著較對照 羊為短。應用複製技術生產的乳牛及乳羊，可能因為動物種別 不同，其端粒長度在經過 NT 操作後，會因為胚在發育過程其 染色體再程式化程度之不同，使端粒長度回復正常或較正常動 物為短。

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