材料與方法

壹、實驗設計及流程

貳、動物飼養、飼料製備、組織取樣及樣品前處理

(一) 動物飼養

自成大醫學院動物中心購入4 週大之 C57BL/6J apoE knockout 母鼠 19 隻，

適應二週後進行卵巢切除手術，手術恢復期一週，適應期及手術恢復期給予chow

diet(MF-18,oriental yeast,日本)餵食。其中有兩隻老鼠因手術過程中麻醉過量致 死，一隻因體型較小，故將其排除在外。剩餘16 隻依體重排序 S 型分成兩組，

並剪耳標辨別，分別為OVX 組(20 % fat)及 OVX + EM 組(20%fat + 0.5 % sesamin)，以眼窩採血方式採取 baseline 血液後，開始給予實驗飼料。小鼠分別 飼養於4 個透明塑膠鼠籠中(4 隻/籠)，動物室環境溫度維持 25±2℃，光照週期 14 小時(上午 6 時至下午 20 時)，黑暗週期為 10 小時，飼料及飲水自由攝取，每 週更換一次飼料並同時秤重紀錄飼料消耗情形，體重每週秤量一次，直至犧牲為 止。

實驗過程中，OVX + EM 組 1 隻於實驗中期因採血過程不幸身亡，故 OVX + EM 組樣本數調整為 n=7。

(二) 飼料組成及製備

飼料基本組成是以AIN-76(American Institute of Nutrition,1976)配方為依據 再進行適度調整，將fat 含量 5% (低脂)之 AIN-76 配方比例經調整過後，使 fat 含 量20% (高脂)飲食之 protein, mineral, vitamin, cellulose 其營養密度和 fat 5%相 同，並將其corn starch 與 sucrose 之比例修正為 1:1。實驗期間所使用之飼料組成 如表3-1 所示。

表 3-1 實驗期飼料之組成

Table 3-1 Composition of the Test Diets¹

1. The composition of AIN-76 Vitamin Mixture and AIN-76 Mineral mixture is as described in AIN. (1977)

2. Casein, ICN purified Biomedicals, Inc ; Metionine, Sigma M-9500 ; Corn starch, Samyang genex Co., LTD. SEOUL, Korea ; Cellulose, Virtacel J.

Betten-maier & Sohn, Germary ; Vitamin mixture, AIN-76, ICN Co. ; Mineral mixture, AIN-76, ICN Co. ; Choline, Sigma C-1879 ; Cholesterol, Hanawa, Japan ; safflower oil:台糖紅花籽油 ; butter:安佳無水奶油

半合成飼料成分包括酪蛋白（ICN Biomed）、甲硫胺酸（Sigma,USA）、玉 米澱粉（Samyang Genex corp,Seoul,Korea）、纖維素(JRS. Vitacel,Germany)、AIN-76 礦物質混和物(ICN Biomed)、AIN-76 維生素混和物(ICN Biomed)、膽鹼(Sigma)、

膽固醇(Hanawa,Japan)、紅花籽油(台糖紅花籽油)、奶油(安佳無水奶油)、實驗組 的飼料另添加之芝麻抽出物Sesamin，含量為 95.7%，由馬來西亞商食益補國際(股) 公司台灣分公司白蘭氏所提供。

OVX OVX+SE Ingredients of diets²

g/kg diet

Total calorie (Kcal/100g) 458.0 455.5 Calorie density (Kcal/g) 4.6 4.6 CHO/calorie (g /1000 Kcal) 100.4 100.5 Protein/calorie (g /1000 Kcal) 51.3 51.2 Fat/calorie (g /1000 Kcal) 43.7 43.7

飼料配製方式須先將蔗糖用貴夫人牌磨粉機磨細後使用，再將其所有粉狀成 份秤取所需重量， 一一加入研缽中磨細之後混勻。待其粉狀成份混勻後，分次 拌入所需比例之奶油及紅花籽油，均勻混合後，以篩網過篩兩次，裝入雙層封口 袋密封保存。添加物部份，芝麻抽出物sesamin 與粉狀成份一同處理。

將粉末飼料製成固體之方式為取一定量粉末緩慢分次加入二次水，稍微攪拌

待其可成團即可，秤重，捏成長方形塊狀，置入烘箱中以40℃低溫烘乾兩天，

秤重後裝入密封袋並置於-20℃冰箱保存。

(三) 動物犧牲及樣本收集

實驗開始第0 週先以眼窩採血的方式採集 baseline 血液樣本約 100μl，之後 開始餵食飼料，在第4、8 週也以同樣的方式採集血液樣本約 100μl，最後於第 11 週進行犧牲，每次採集血樣或犧牲前必須取走飼料隔夜禁食 12~15 小時。犧

牲當日先行秤重，以乙醚麻醉，眼窩採血至少1ml，再注射過量麻醉藥讓動物安

樂死後，迅速取下肝臟、腎周脂、子宮周圍脂肪秤重紀錄後丟入液態氮急速冷凍，

保存於-80℃備用；取；脾臟及腎臟秤重記錄。從腹部剖開至胸，以鑷子將腹主 動脈 (abdominal aorta)及胸主動脈 (thoracic aorta)與周圍之組織分離，接者以鑷 子小心將整段動脈挑起，並除去黏附在動脈上的結締組織，以剪刀將動脈連同部

分心臟取下，稍微吸乾周圍組織液後秤重，放入含PBS 之滅菌拋棄式培養皿中，

盡量移除動脈周圍之結締組織，隨後將胸主動脈與腹主動脈分成兩段，胸主動脈 放入含4％福馬林(paraformadehyde)之 PBS 固定液中進行固定 3 小時，腹主動脈 則以液態氮冷凍之。血液以3500g 、4℃ 15min 離心後，取上層血清分裝保存於 -80℃，供日後分析。

叁、血液脂質分析

(一) 血清中膽固醇(total cholestrol)含量測定 1. 原理

利用detergent 將膽固醇及膽固醇酯自 lipoprotein 中釋出，再以 cholesterol

esterase 水解膽固醇酯可得游離膽固醇(free cholesterol)。 (Randox)，以 Enzymatic CHOD-PAP method 測定。產生紅色的 quinoneimine 測其 500nm 吸光值。以 cholesterol calibrator standard(Randox)做一標準曲線，利用內 插法推算其濃度。

(二) 血清中三酸甘油脂(triglyceride)含量測定 1. 原理

Glycerol phosphate oxidase

L-α-glycerol-3-phosphate + O2

2. 實驗方法

取 5 μl 血清加入 96 well plate 中，再加 200 μl 反應試劑，反應時間 10 分鐘，

作二重複，使用市售組合試劑 (Randox)，以 Enzymatic CHOD-PAP method 測定。

在peroxidase 催化下，H2O2與4-aminophenazone 和 4-chlorophenol 作用，產生紅 色的quinoeimine，測其 500nm 吸光值。以 triglyceride calibrator standard(Randox) 做一標準曲線，利用內插法推算其濃度。

(三) 血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量測定

取20 μl 血清加入 40 μl 沉澱劑 (Randox)，利用沉澱劑中磷鎢酸

(phosphotungstic acid)及氯化鎂可將血清中含 apoB 的脂蛋白(LDL、VLDL)沉澱，

離心後取上層含HDL 部分，同前述 enzymatic CHOD-PAR 法進行二重複測定 peroxidase

HDL 的膽固醇濃度，以 cholesterol calibrator standard(Randox)做一標準曲線，利 用內插法推算其濃度。

肆、血清 adiponectin 分析

1. 原理

本實驗採用市售adiponectin/Acrp30 ELISA set (R&D)，根據三明治(sandwich) 酵素免疫分析原理測量血液中adiponectin 濃度，此法係利用 96 孔的分析盤中已 結合抗adiponectin 的單株抗體，可與 adiponectin 分子專一結合，再結合 horseradish peroxidase conjugates anti mouse adiponectin polyclonal antibody，藉由 horseradish peroxidase 與 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine 及 H2O2反應呈色而得知樣本中 adiponectin 濃度。

2. 實驗方法 (a) plate 製備

加入100μl 稀釋過的 Capture Ab 至 96 well plate，保存於 4℃隔夜靜置。以 400μl PBST 洗 5 次，拍打數次後移除多餘液體，加入 Block buffer 300μl/well，

室溫下靜置1 小時，再以 400μl PBST 洗 5 次。

(b) 實驗流程

加入50μl 標準品(序列稀釋)、血樣(稀釋 2000 倍)入分析盤中，室溫靜置 2 小時後，以400μl PBST 洗 6 次，使未結合的樣本在清洗的過程中被洗去，再加 入100μl biotinylated gout anti-mouse adiponectin(detection antibody)室溫靜置 2 小 時，以400μl PBST 洗 6 次，再加入 100μl Streptavidin-HRP，室溫下避光靜置 20 分鐘，以400μl PBST 洗 7 次，最後加入 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine 及 H2O2(新 鮮配製)，室溫下避光反應 20 分鐘後加入 2 N H2SO4終止酵素呈色反應，使藍色 產物變為黃色，於波長450 nm 讀取吸光值，吸光值愈高表示樣品中所含

adiponectin 濃度愈高，其濃度利用標準品並乘上稀釋倍數即可相對換算出。

伍、血清中 enterolactone 含量測定

1. 原理

本實驗採用市售 Enterolactone ELISA kit (cayman)，根據 Competitive Enzyme Immunoassay 分析原理測量血液中 enterolactone 濃度，此法係利用一定量無標記 的 mouse monoclonal antibody 附著在孔盤底部，再加入標記的 enterolactone tracer(enterolactone 與 acetycholinesterase(AChE) 結合)及無標記的 enterolacone 互 相競爭與吸附在塑膠孔內的抗體結合，洗去非專一性結合後，反應呈色，藉由加 入 不 同 量 的 未 標 記 的 已 知 抗 原 標 準 品 畫 出 曲 線 可 比 較 得 知 測 定 樣 品 中 enterolactone 含量。

2. 方法

將所需的溶液製備好後，依序加入分析孔盤中。加入100 μl ELA buffer 至 非專一性結合(NSB)的孔洞內，加入 50μl ELA buffer 至 Maximun Binding (Bo)孔 洞內，再將50 μl 標準品及樣品加入孔洞，做二重複，隨後加入 50 μl enterolactone AChE tracer 入各孔洞中(除了 Total Activity(TA)及 Blank(Blk)外)，最後加入 50μl enterolactone antiserum 入各孔洞(除了 Total Activity(TA)、Blank(Blk)及(NEB)外)，

將plate 覆蓋好，放至 4℃反應 overnight。隔天，以 wash buffer 洗掉非專一性結 合，wash 五次後拍乾，最後在每個 well 中加入 200μl Ellman’s Ragent，且在 TA 孔洞加入5μl tracer，避光搖晃 90~120 分鐘，於波長 405~420 nm 下可測其吸光 值。

陸、血管縱切與脂肪堆積染色

1. 藥品配製 [Oil red-O]

◎使用藥品：

Oil red-O 250mg Isopropanol 100ml

◎方法：

將Oil red-O 粉末加入 Isopropanol mix 均勻後，置於 56℃水浴機加熱 1 小時 後取出，待冷卻後過濾之。

2. 實驗方法

將取下之主動脈弓(aortic arch)及胸主動脈(thoracic aorta)旁的脂肪組織剔除 乾淨後，以含4％福馬林(paraformadehyde)之 PBS 固定液進行固定，更換兩次後 處理隔夜，接著以PBS 清洗後，浸泡於 50 % isopropanol 10 分鐘，再以配置好的 Oil red-O (5 mg/ml in isopropanol)染色 2 分鐘，再以 50 % isopropanol 退染 1 分 鐘，最後置於PBS 內保存。經由 Oil-red-O 染色後，從血管腹面縱向剪開後，脂 肪條會呈現深紅色斑點，接著以照相系統(Olympus)進行拍照，最後使用 Image J

軟體分析主動脈前1 公分長度脂肪條面積與血管面積的比率。

柒、統計分析

數值以mean ± S.E.M 表示。先檢測數據是否為常態分佈，若非常態分佈將 進行轉換。採用student t-test 分析組間是否具有顯著差異，p < .05 表示有顯著差 異。使用SPSS 14.0 軟體進行統計分析。

在文檔中 數種植物性雌激素對代謝症候群的影響 (頁 43-51)