第三章 芝麻素對動脈粥狀硬化之影響
第四節 討論與結論
壹、sesamin 對於血脂及動脈損傷之影響
ApoE 基因剔除小鼠為探討高膽固醇血症及動脈粥狀硬化相關疾病之良好的 動物模式(Nakashima et al., 1994; Reddick, Zhang, & Maeda, 1994)，因其缺乏 apoE 無法有效的清除血液中chylomicron 及 VLDL，致使血膽固醇及三酸甘油酯濃度 上升，而若給予western-type diet (含 21% fat 及 0.15%cholesterol)，可使血膽固醇 大幅上升且加速動脈損傷進展，過去已有很多研究選用apoE(-/-)小鼠探討動脈損 傷及血脂異常，黑米色素區分物可顯著下降apoE(-/-)小鼠血液總膽固醇、減少動 脈損傷及上升血液HDL-C，具有抑制動脈硬化之功效(M. Xia, Ling, Ma, Kitts, &
Zawistowski, 2003)，另一項使用 apoE(-/-)小鼠探討紅酒多酚對於動脈硬化之影 響，發現其可顯著減少主動脈脂肪堆積(Waddington, Puddey, & Croft, 2004)，故本 研究使用apoE 基因剔除小鼠並餵食 20% fat 及 0.15% cholesterol 之高脂高膽固 醇飼料，以期sesamin 能減少動脈損傷情形及改善血脂。
過去研究指出 sesamin 具有降血脂的功效，大鼠餵食含 0.5% sesamin 的未添
加膽固醇之飼料4 週後，可顯著下降血液及肝臟膽固醇濃度，其可能抑制膽固醇
合成及吸收(Hirose et al., 1991)，另一項研究顯示大鼠予以餵食含 0.2%或 0.5%
sesamin 之飼料 15 天，可顯著下降其血液中 TG 及 FFA 濃度(Ashakumary et al., 1999)，但本研究並未得到相似的結果。本次實驗發現去除卵巢之 apoE(-/-)小鼠餵 食含0.5% sesamin(w/w)的高脂飼料，相較於控制組顯著上升血液中 TC 濃度，但 血液中TG 及 HDL-C 濃度並無顯著影響，且顯著增加腎周脂重量，顯示其對於 血脂改善及抗肥胖的效用不如預期，過去研究指出卵巢切除之apoE(-/-)小鼠給予 雌激素治療後，顯著下降體重、血液TC 和 VLDL-C 及主動脈損傷面積(Bourassa, Milos, Gaynor, Breslow, & Aiello, 1996)，同樣的 OVX 大鼠注射 E2後顯著顯著減 少體重及腹部脂肪堆積(J. F. Wang et al., 2004)，而雌激素對於改善血脂的作用機
轉可能有：(1)影響 VLDL 產量及清除率(2)降低肝內脂肪生合成作用(3)增加 LDL receptor 表現量(4)增加 LPL 活性(M. S. Liu et al., 1994; Walsh & Schiff, 1991)，故 推測餵食0.5% sesamin 之 apoE(-/-)卵巢切除鼠，在體內可能產生antagonist 之作 用，拮抗脂肪組織所製造的雌一醇與飼料中添加之奶油所含雌一醇及雌二醇 (Wolford & Argoudelis, 1979)，導致血清 TC 濃度及腹部脂肪堆積反而比控制組 高。
在本實驗條件下含 0.5 % sesamin 之高脂高膽固醇飼料 11 週後，顯著上升 apoE 剔除鼠血液 TC 濃度，過去研究發現 sesamin 能夠增加大鼠肝中脂肪酸氧化 速率，可能透過調控PPARα之活性，以達降血脂(Ashakumary et al., 1999)，臨床 上常用在高血脂患者上降血脂的藥物為fibrate，此類藥物是 PPARα之活化劑，
透過活化肝中PPARα以達下降血液 TC 及 TG，會促進囓齒類動物肝中過氧化質 體增生且亦可能出現腫瘤增生的現象，但在人類沒有此副作用，本研究發現餵食 OVX+SE 組相較於 OVX 組，肝組織絕對重量及相對重量皆有顯著增加，顯示 sesamin 作用可能相似於 fibrate 類藥物，皆為 PPARα促效劑，具有降血脂之功效。
但有研究發現apoE 剔除鼠予以餵食含 0.1% 之 fenofibrate 高膽固醇飼料 14 週 後，相較於控制組無法下降血脂，反而上升血液TC、TG，下降血液 HDL-C (Declercq et al., 2005)，而另一項研究也指出餵食同樣為 fibrate 類類藥物
ciprofibrate，亦使 apoE 剔除鼠血脂上升情形更加嚴重，且發現血液中攜帶 apoB48 lipoprotein remnants 增加(Fu, Kashireddy, & Borensztajn, 2003)，一般正常的動物，
血液循環中富含TG 之脂蛋白 chylomicron 或 VLDL remnant 能夠透過 apoE 與 LDL receptor 及 LDL receptor-related protein (LRP)結合，有效的在肝中進行回收。
但apoE 剔除鼠缺乏 apoE 基因，血液中攜帶 apoB48 之 chylomicron，無法透過 LDL receptor 或 LRP 在肝中回收進而累積在血液中，需透過其他途徑將 remnant
在肝中代謝掉，可能透過肝細胞上接受器SR-BⅠ經由胞飲作用將其攝入肝中進
行代謝(Crawford & Borensztajn, 1999)，因此推測 sesamin 可能抑制 SR-BⅠ之作 用使得apoE 剔除鼠失去清除血液 lipoprotein remnants 能力，進而造成血液 TC
上升。
雖然無顯著改善血脂但對於主動脈脂肪堆積有減少的趨勢，主動脈損傷面積 6.45%低於控制組 9.88%，達邊際統計差異(p=0.07)。可能原因有(1) 抗氧化性：
在高血壓大鼠模式，飼料添加1% sesamin 可顯著抑制主動脈血管上 O2
-的生成量 (Nakano et al., 2002)，而血管壁上若產生過多的 O2-會誘發內皮細胞損傷，致使動 脈粥狀硬化產生。過去研究指出sesamin 在肝中具有抗氧化活性，近來發現此抗 氧化的特性並非來自sesamin 本身，而是 sesamin 會經由肝臟代謝成具抗氧化效 用的化合物，因此在肝中具有對抗氧化損傷之作用(Nakai et al., 2003)。本次實驗 sesamin 可稍微減少 apoE 剃除小鼠主動脈脂肪條堆積，推測可能為 sesamin 在肝 中之代謝產物在血管上發揮與在肝中相同的抗氧化作用，藉由抑制主動脈上O2
-產生，進而減少內皮細胞損傷，使其不易進展至粥狀動脈硬化。
(2) 抗發炎：過去研究亦發現 sesamin 亦具有抗發炎之效用。sesamin 能夠藉 由向下調節p38 MAPK 訊息傳遞路徑且抑制 NF-κB 活化，進而減少 IL-6 生成，
具有抗發炎的效用(Jeng, Hou, Wang, & Ping, 2005)。而本實驗室先前指出 sesamin 可顯著下降以TNFα刺激之主動脈內皮細胞上黏著因子 ICAM-1 的表現量，且近 來亦發現其可顯著減少以oxLDL 刺激之人類單核球細胞之 IL-1β及 TNFα分泌 量，而apoE 剔除鼠若再將 TNFα基因剔除，其主動脈竇損傷面積顯著低於 apoE 剔除鼠(Ohta et al., 2005)，發現 TNFα為致動脈硬化之因子。故推測本研究主動脈 脂肪條減少，可能經由抑制促發炎因子TNFα及 ICAM-1 表現量，進而減少血管 發炎、減少單核球黏著進入血管內，以避免一連串發炎反應進行，可能具有預防 心血管疾病發生之潛力。
貳、sesamin 代謝產物 ENL 之效用
Sesamin 在體內的代謝及其代謝產物對其生理效應亦扮演一個重要角色。
Penalvo 等人提出在體外實驗 sesamin 可經由糞便發酵成哺乳類動物之 lignan ENL 及 END，且芝麻經人體攝入後其血液中 ENL 及 END 的濃度會上升，因此
指出sesamin 可經由腸內微生物將其待謝成具生物活性之 ENL 及 END(Penalvo et al., 2005)。本研究發現 apoE 基因剔除小鼠餵食含 sesamin 的高脂高膽固醇飼料 (0.5% sesamin w/w) 10 週後，測得血液中平均 ENL 濃度為 1239 pg/ml，顯著高於 未添加sesamin 的組別，指出 sesamin 確實被小鼠攝入後會經體內消化待謝成 ENL。過去研究指出胡麻子為飲食中植物性木質素的豐富來源，其成分為
secoisolariciresinol diglucoside(SDG)，亦可經由腸內菌將其待謝為 ENL 及 END(L.
Q. Wang, Meselhy, Li, Qin, & Hattori, 2000)，而從胡麻子分離出的 lignan 複合物添
加於高膽固醇飼料中，可顯著減少兔子主動脈損傷面積37%、下降血液及主動脈
上脂質過氧化產物malondialdehyde (MDA)、下降血液 TC 及 LDL-C 且上升 HDL-C，具有保護動脈硬化的效用(Prasad, 2005)。本研究部分結果與上述研究結 果相歧，apoE 剔除小鼠餵食添加 sesamin 之高膽固醇飼料，顯著上升血液 ENL 及TC 濃度但不影響血液中 HDL-C 含量，主動脈損傷面積有減少的趨勢，但未
達顯著差異，在相關性分析發現ENL 與主動脈損傷面積無顯著相關，但與血液
TC 濃度達顯著正相關(r = 0.757, p＜0.05)，sesamin 代謝產物 ENL 可能為血脂上
升的可能原因之一，而體外實驗指出ENL 具有雌激素及抗雌激素效用，故推測
ENL 可能產生抗雌激素作用，因而造成血脂異常。
叁、結論
Sesamin 具有減少 apoE 剔除鼠主動脈損傷面積的潛力，但無法有效改善血脂 異常及腹部脂肪堆積，其確切機轉仍需進一步研究證實。
第四章
芝麻素及異黃酮對代謝症候群之影響
第一節 前言
更年期婦女體內雌激素的量下降，造成脂肪分佈改變，由四肢或皮下轉到 腹腔內堆積引起腹部肥胖，稱為中廣型肥胖，為引發一連串之代謝紊亂之主因。
雌激素對於心血管疾病及代謝症侯群相關病灶具保護效應，可降低體脂肪量、影 響胰島素敏感度、影響脂蛋白代謝及內皮細胞功能…等，去除卵巢之大鼠及小 鼠，給予雌激素治療可下降體重或減少脂肪重量，但若使用雌激素治療可能增加 罹患乳癌風險。
過去研究指出卵巢切除小鼠餵食不同劑量之genistein 皆能減少脂肪組織堆 積及減少LPL mRNA 表現量，顯示其具有抗脂肪生成之效用(Naaz et al., 2003)，
且可抑制食慾、降低體重及降體脂，因此可預防更年期後腹部脂肪的堆積(H. K.
Kim et al., 2006)。
故本章研究目的為欲瞭解具SERM 之植物性雌激素食材是否可提供類似雌
激素功能。使用C57BL/6J 母鼠並將其卵巢切除，誘發體脂增加及血脂異常，模 擬女性更年期體內的生理狀態，探討芝麻內容物sesamin 及大豆異黃酮之
genistein 對停經後引起之代謝症候群的影響，觀察是否能夠下降血脂、血糖、肝 臟TG 及 TC、脂肪細胞激素、減少腹部脂肪堆積。
第二節 材料與方法
壹、實驗設計及檢測項目
貳、動物飼養、飼料製備、組織取樣及樣品前處理
(一) 動物飼養
自財團法人國家實驗中心購入4 週大之 C57BL/6J 母鼠 40 隻，適應二週後 依體重排序S 型分成四組，並剪耳標辨別，分別為 Sham (20%fat)、High fat (OVX, 20%fat)、0.5% sesamin (OVX+SE, 20%fat + 0.5% sesamin)及 0.5% isoflavone (OVX+IS, 20%fat + 0.5% isoflavone)，Sham 組進行假手術，其餘三組進行卵巢切 除手術，手術恢復期一週，適應期及手術恢復期給予chow diet (MF-18,oriental yeast,日本)餵食。以眼窩採血方式採取 baseline 血液後，開始給予實驗飼料。小 鼠分別飼養於7 個透明塑膠鼠籠中 (5~6 隻/籠)，動物室環境溫度維持 25±2℃，
光照週期14 小時 (上午 6 時至下午 20 時)，黑暗週期為 10 小時，飼料及飲水自
由攝取，每週更換一次飼料並同時秤重紀錄飼料消耗情形，體重每週秤量一次，
直至犧牲為止。
實驗過程中，OVX 組 1 隻於實驗後期因採血過程不明原因身亡，故 OVX 組 樣本數調整為n=10。
(二) 飼料組成與製備
飼料成分及製備方式同第三章第二節。飼料配方OVX、OVX+SE 組同第三
章第二節；Sham 組飼料成分同 OVX 組；OVX+IS 組的飼料成分亦同 OVX 組，
但另添加0.5%異黃酮，此為大豆提取物 (內含去糖基大豆異黃酮約 40.74%，包 括：35.54 % genistein 及 10.90 % daidzein；其餘成分還有皂素 40~50%、多種微 量元素6 ~ 7 %、脂肪 2~3%及灰分＜2%) ，由統園企業有限公司所提供 (表 4-1)。
表4-1 實驗期飼料之組成
Table 4-1 Composition of the Test Diets1
1. The composition of AIN-76 Vitamin Mixture and AIN-76 Mineral mixture is as described in AIN. (1977)
2. Casein, ICN purified Biomedicals, Inc ; Metionine, Sigma M-9500 ; Corn starch, Samyang genex Co., LTD. SEOUL, Korea ; Cellulose, Virtacel J.
Betten-maier & Sohn, Germary ; Vitamin mixture, AIN-76, ICN Co. ; Mineral mixture, AIN-76, ICN Co. ; Choline, Sigma C-1879 ; Cholesterol, Hanawa, Japan ; safflower oil:台糖紅花籽油 ; butter:安佳無水奶油
Sham OVX OVX+SE OVX+IS Ingredients of diets2
g/kg diet
Total calorie (Kcal/100g) 458.0 458.0 455.5 455.0 Calorie density (Kcal/g) 4.6 4.6 4.6 4.6 CHO/calorie (g /1000 Kcal) 100.4 100.4 100.5 97.1 Protein/calorie (g /1000 Kcal) 51.3 51.3 51.2 51.0
Fat/calorie (g /1000 Kcal) 43.7 43.7 43.7 43.4