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植物萃取物清除 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)之能力

第二章、 實驗材料與方法

第二節、 實驗方法

9. 植物萃取物清除 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)之能力

DPPH 自由基︽是一種較為安定的自由基︽當遇到抗氧化劑時︽顏色會由深 紫色轉變為淡紫色或黃色︽可利用ELISA 檢測波長 530 nm 顏色變化︽因測試方法 簡易且容易觀察︽可藉此進行具有清除自由基特性之原料篩選〈

9-2. 分析步驟

於96 孔盤中︽加入待測物(100 µl)或 Vitamin E (對照組)︽以 10% DMSO 為實

驗組及對照組之空白試驗〈進行試驗前吸收波長測試︽(A0 為空白測試之背景值﹀

B0為實驗組或對照組測試之背景值)︽再加入 200 µM DPPH 溶液(100 µl) 置於 25

℃︾400 rpm 避光反應 30 分鐘︽進行試驗後吸收波長測試︽扣除背景值後︽計算 清除自由基能力〈公式如下「

(A-A0)-(B-B0)/ (A-A0)*100%

A「為空白組所得之吸收值〈

B: 為實驗組或對照組所得之吸收值〈

A0:為空白組背景值

B0:為實驗組或對照組背景值

10.

統計學分析

本實驗重覆數為 3 次,實驗結果皆以實驗次數之平均值±標準誤差(mean ± S.D.) 表示。根據 Student’s t- test 作為統計分析,若 p<0.05,則表示有意義的差異。

六︾相關性分析

在統計學上︽判定變數間是否有關係︽可依據彼此間相關係數(r)判斷〈相關 係數為-1 到 1 之間的實數︽在簡單線性相關性分析中︽相關係數越接近 1︽表示 變數之間有一線性增加或減少的趨勢︽而相關係數越低︽則表示變數間線性相關 的程度也就越小︽但相關係數為 0︽並不表示變數間全����������������������������������然無關︽也可能是相關的

趨勢呈現一種非線性的樣子〈利用 SPSS 軟體︽進行抗痤瘡活性與植物成分之相

關性分析〈

七︾皮膚毒性試驗

1. 體內動物實驗-單一劑量皮膚毒性試驗 1-1. 實驗目的

單一劑量�急性…毒性試驗主要是探討藥物於24 小時內投予單次或多次劑量

後所產生毒性作用的試驗︽任何即將運用於人類����������������������������������的藥物都需要有動物急性毒性試 驗〈這些試驗的結果有助於重覆劑量試驗︾皮膚過敏性試驗︾皮膚刺激性試驗及 光過敏性試驗的設計︽也可用來預測特定器官的毒性作用︽有時甚至也可看出延 遲性毒性的反應〈急性毒性試驗之結果也可幫助第一期人體試驗之劑量選擇︽避 免人體試驗產生藥物過量反應〈

1-2. 實驗步驟

(1) 飼養於 12 小時光照與 12 小時無光照循環交替環境︽溫度控制於 25±1℃︽給 予充足的水與飼料

(2) 於測試前將背部之毛髮剔除〈剔毛 24 小時後︽先行檢測皮膚是否完整無過敏 現象︽再將製備好的 neomycin︾Esculetin 與石榴萃取物︽塗抹於老鼠背上︽

每隻塗抹3 處︽每處塗抹面積為 2.5 × 2.5 cm2之正方形︽塗藥時觀察大白鼠是 否有異狀︽並先測量塗藥前Wistar 大鼠皮膚的基礎顏色〈

(3) 待塗藥以後 24 與 48 小時測量︽利用 Scalar USB shot 及檢測軟體 USB Digital scalar 1.0E 觀察是否有皮膚過敏現象︽並參考 Draize-FHSA scoring System 觀 察敷藥部位的皮膚反應︽評估每隻測試動物之皮膚過敏反應程度〈紅斑與紅腫 的發生頻率與程度可藉由與正對照組與空白組的比較加以評估〈

(4) 皮膚紅腫試驗評估後︽將大白鼠犧牲︽取下皮膚組織︽以縱切方式︽觀察皮膚 角質層︾真皮層形態〈

第三章︾實驗結果

第一節︾常用於治療青春痘之中草藥抗痤瘡作用

一、常用之抗痤瘡中草藥之抗菌活性分析

金黃葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 與痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes)︽

皮膚常見的細菌︽於免疫力低下時造成皮膚的感染︽以此 2 種細菌進行萃取物

抗菌活性分析,在1 mg 的劑量下,與 penicillin (10U)作為實驗正對照組,結果 顯示:常用中藥以大青葉、黃連、石榴、訶子、黃柏、黃芩、苦參、芍藥、白 芷及甘草具有良好的抑制金黃色葡萄球菌(S. aureus)生長,其中大青葉、石榴、

苦參與訶子之最低抑菌劑量為31.25 與 62.5 µg。如表十五之一。

唇形科植物之抗菌活性分析︽結果顯示於表十六之一︽在 10 mg 的劑量

下,唇形科植物具有抗菌活性,其中又以迷迭香屬植物︽如針葉迷迭香︾斑葉 迷迭香︾與迷迭香具有良好的抗菌活性︽最低抑菌劑量分別介於 0.3125-0.625 mg〈而羅勒屬香草皆不具有抗菌活性〈

痤瘡桿菌(P. acnes)抗菌活性分析,中藥萃取物在抗菌活性分析,在 1mg 的 劑量下,大青葉、黃連、石榴、訶子、黃柏、黃芩、苦參、芍藥、白芷、甘草、

知母、決明子、夏枯草、荊芥、青蒿與茵陳蒿,具有良好的抑菌作用,其中黃 連、石榴、苦參與黃柏最低抑菌劑量分別為小於或等於31.25 與 62.5 µg。如表 十五之一。

二、常用之抗痤瘡植物之脂質分解酵素活性分析

脂質分解酵素是一種水溶性酵素︽許多真菌和細菌可以利用此酵素分解脂 肪︽自外部獲得養分︽得以孳生或入侵宿主〈痤瘡桿菌會利用此酵素︽分解皮 膚上脂質︽而大量生長︽此外︽在表皮上分解後的產物︽也容易引起皮膚的發 炎反應〈因此本實驗︽利用脂質分解酵素(lipase)︽加入 4-methylumbelliferyl butyrate solution︽評估抗痤瘡植物是否具抑制脂質分解酵素的能力〈結果顯示「

大部份的中藥在濃度為200 µg/ml 時︽不具有抑制脂質分解酵素的活性︽僅有石

榴超過 20%的抑制︽其次為黃芩︾白頭翁︾黃連︾訶子具有較好 10%的抑制〈

如表十五之二〈

三︾常用之抗痤瘡植物之抗發炎活性分析

發炎反應是身體正常的保護的防線︽當皮膚受到細菌感染或外界的刺激時︽

造成過度或慢性的發炎︽對於皮膚組織︾結締組織造成破壞︽使痤瘡惡化引起 更嚴重的傷害︽因此本實驗︽利用脂多醣(lipoolysaccharide︽LPS)誘導老鼠巨噬 細胞(RAW 264.7)︽評估抗痤瘡植物是否具抑制發炎的能力〈以 L-NAME 作為 正對照組〈結果顯示「中藥的大青葉︾黃連︾石榴︾黃柏與黃芩具有好的抗發 炎活性︽其中黃連︾石榴︾黃芩與黃柏NO 抑制 50%濃度皆低 100 µg/ml〈如表 十五之二〈

唇形科植物中薰衣草屬︾鼠尾草屬與迷迭香屬香草皆具有抑制 NO 產生的

能力︽以迷迭香屬其NO 抑制 50%濃度(IC50)皆低 40 µg/ml︽其中又以迷迭香藍 色小孩抑制最為明顯︽如表十六之二〈

四︾常用之抗痤瘡植物之抗氧化活性分析

當痤瘡產生誘導皮膚發炎時︽同時也會產生自由基的傷害︽利用清除 DPPH 自由基之能力︽評估植物萃取物抗氧化能力︽並利用(+)α-Tocopherol 作 為正對照組〈結果顯示如表十五之二「大青葉︾石榴︾連翹︾金銀花︾芍藥︾

訶子︾黃柏︾地骨皮︾黃芩︾薄荷︾桑白皮︾決明子︾夏枯草︾青蒿︾茵陳蒿 與蒲公英︽具有較好的清除自由基的能力︽而石榴︾芍藥︾訶子︾黃芩︾桑白 皮︾夏枯草與茵陳蒿其IC50皆低於100 µg/ml〈

唇形科植物樣品抗氧化能力︽並利用(+)α-Tocopherol 作為正對照組〈結果 顯示如表 十 六 之 二 ︽薰衣草屬植物︽具有較好的清除自由基的能力︽而清除 50 %DPPH 自由基的能力在紫色印記薰衣草︾馬約蘭花︾鑲邊到手香︾到手香 效果較好︽其IC50皆低於0.2 mg/ml〈

表十五之一︾34 種常用抗痤瘡中藥萃取物之抗菌活性分析

表十五之二︾34 種常用抗痤瘡中藥萃取物之抑制 NO 產生︾清除 DPPH 自由基與抑

表十六之一︾28 種唇形科萃取物之抗菌︾抑制 NO 產生與清除 DPPH 自由基活性分析

表十六之二︾28 種唇形科萃取物之抗菌︾抑制 NO 產生與清除 DPPH 自由基活性分析

a:萃取物濃度為 1mg 與 Penicillin 10U,抑菌圈相除比率 n=3

中文名

S. aureus 抗菌活性 NO 抑制率 DPPH 自由基清除率

Ratioa

(%) (µg) (µg) Inhibition (%, at 0.2 mg/ml)

IC50 value (mg/ml)

Inhibition (%, at 0.5 mg/ml)

IC50 value (mg/ml)

馬約蘭花 10.45 ± 4.78 - - 44.65 ± 13.01 > 0.20 76.17 ± 2.13 0.10

越南香蜂草 0.00 ± 0.00 - - 52.89 ± 14.69 0.19 68.10 ± 3.52 0.27

舖地香 14.30 ± 0.22 - - 30.22 ± 24.73 > 0.20 57.95 ± 1.47 0.43

鑲邊到手香 28.05 ± 0.78 - - 32.96 ± 3.08 > 0.20 71.05 ± 2.90 0.18

到手香 0.00 ± 0.00 - - 57.92 ± 1.94 0.18 48.90 ± 2.33 0.66

Penicillin 100.0 - - - -

L-NAME - - - - 0.331 mM - -

(+)-Tocopherol - - - 0.02 mM

第二節︾臨床與市售常用之抗痤瘡植物植物多酚︾總黃酮成分檢測 一︾常用之抗痤瘡植物之總多酚類����������������������������������含量測定

多酚類����������������������������������廣泛存在於各種天然植物中︽檢測臨床與市售常用之抗痤瘡植物樣 品總多酚類����������������������������������的含量︽結果顯示如表十七總多酚類����������������������������������含量以訶子與石榴含量最高︽

其中每毫克(mg)含量︽有超過 500 微克(µg)等價的沒食子酸(gallic acid)︽其次為 茵陳蒿與夏枯草〈

28 唇形科雖種源相近︽但總多酚類����������������������������������含量範圍很大︽每毫克含有 gallic acid 從39.9-165.9 µg/mg︽其中以迷迭香屬的含量最高︽其次為薰衣草屬及羅勒屬︽

結果如表十八〈其中馬約蘭花的總多酚含量最高 165.9 µg/mg︽薰衣草屬中紫 色印記薰衣草及法國薰衣草︾鼠尾草屬的鳳梨鼠尾草︾弦葉鼠尾草及金色鼠尾 草︾迷迭香屬的迷迭香及藍色小孩迷迭香總多酚類����������������������������������含量每 mg 皆超過相對於 90 µg /mg〈

二︾常用之抗痤瘡植物之黃酮類����������������������������������總含量測定

黃酮類����������������������������������的成分以黃酮類����������������������������������為主常與抗發炎或抗氧化活性有關︽檢測臨床與市 售常用之抗痤瘡植物樣品之黃酮類����������������������������������含量︽結果如表十七「中藥中黃酮類����������������������������������的成分 以茵陳蒿為最多︽每毫克 (mg) 超過 100 微克 (µg) 等價的兒茶素 (catechin)︽其 次為薄荷︾梔子︾荊芥〈

唇形科植物中以薰衣草屬的植物其黃酮類����������������������������������的含量每 mg 皆超過 20 µg︽其 中又以紫色印記薰衣草的含量最高︽鼠尾草屬︾迷迭香屬及羅勒屬的香草其黃 酮類����������������������������������的含量皆不高︽每mg 皆未超過 15 µg︽只有聖羅勒較高︽如表十八︽馬約 蘭花黃酮類����������������������������������含量每mg 也有超過相對於 20 µg〈

表十七︾34 種常用之抗痤瘡中草藥之植物多酚成分分析

中藥

總多酚含量 gallic acid

總黃酮類����������������������������������含量

catechin 中藥

總多酚含量 gallic acid

總黃酮類����������������������������������含量 µg gallic acid/mg「每毫克(mg)植物萃取中含有等價沒食子酸的微克數(µg)

µg catechin/mg「每毫克(mg)植物萃取中含有等價兒茶素的微克數(µg)

表十八︾唇形科植物萃取物植物化學成分分析

唇形科香草

總多酚含量 gallic acid

總黃酮類����������������������������������含量

catechin 唇形科香草

總多酚含量 gallic acid

總黃酮類����������������������������������含量

µg gallic acid/mg「每毫克(mg)植物萃取中含有等價沒食子酸的微克數(µg) µg catechin/mg「每毫克(mg)植物萃取中含有等價兒茶素的微克數(µg)

第三節︾抗痤瘡活性與植物化學成分含量之關聯性探討

常用之中藥種類����������������������������������繁多︽用途各異︽包含了許多科屬︽活性複雜︽成分多元︽

較不易整理歸納其關聯性︽因此根據上述實驗結果︽我們選擇相近基源的28 種

唇形科植物︽利用 SPSS 軟體以無母數分析法進行回歸分析︽探討抗痤瘡活性

與植物化學成分含量之關聯性︽如表十九〈抗發炎作用及抗菌活性也呈現高度 正相關︽相關(R = 0.767︽p<0.01)〈此外清除 DPPH 自由基之抗氧化活性與總多 酚及總黃酮類����������������������������������含量成明顯的正相關︽其相關係數為 R = 0.542 及 0.613︽p<0.01〈

進一步分析︽我們將 28 種唇形科分為四組的屬︽包括薰衣草︽鼠尾草︽

進一步分析︽我們將 28 種唇形科分為四組的屬︽包括薰衣草︽鼠尾草︽