第二章、 實驗材料與方法
第二節、 實驗方法
1. 總多酚類含量測定：Folin-Ciocalteu reaction
利用Folin-Ciocalteu Reagent 中 phosphotungstic acid 和 phosphomolybdic acid 容易被多酚類����������������������������������分子氧化的特性︽以gallic acid 作為標準品︽評估總多酚類����������������������������������含量〈
1-2. 分析步驟
取待測樣品(100 µl)︽依序加入的 Folin-Ciocalteu 試劑(500 µl)與 7.5%碳酸鈉 溶液(400 µl )混和均勻〈將混合物放置於 50℃反應 5 分鐘︽取出冷卻至室溫〈以 ELISA Reader 波長 600 nm 測定〈
1-3. 含量換算
以Gallic Acid 作為標準品製作標準曲線︽利用內差法將待測物 O.D.值轉換︽
計算出相對於Gallic Acid 之總多酚類����������������������������������含量〈
2. 黃酮類���������������������������������� (Condensed Tannin )含量測定「Vanillin Assay100 2-1. 分析原理
利用 Vanillin 和 Catechin 在濃硫酸的︽相似結構的成分也會有類����������������������������������似的反應︽
藉此以Catechin 作為標準品︽檢測黃酮類����������������������������������的化合物的量〈
2-2. 分析步驟
將0.1 g 的 Vanillin 粉末溶解在 10 ml 的 80 % H2SO4〈取待測樣品(300 µl)與上 述溶液(600 µl)混合均勻︽20℃反應 15 分鐘〈以 ELISA Reader 波長 530 nm 測定〈
2-3. 含量換算
以Catechin 為標準品製作標準曲線︽利用內差法將待測藥物的 O.D.值轉換成 等量之Catechin 表示〈
五︾抗痤瘡活性分析
1. 體外抗菌試驗- Staphylococcus aureus 與 Propionibacterium acnes 1-1. 分析原理
痤瘡常由細菌感染而造成︽其中又以好氧金黃葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus) 與兼性厭氧痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes)最為常見︽因此利用此兩種
細菌進行待測物之抗菌活性分析〈
1-2. 試液配製
(1). 培養液 Tryptic soy broth (TSB) 之配製「
將培養液Tryptic soy broth (TSB) 30 g 溶於 1 升之二次水後攪拌均勻︽置於高 壓滅菌鍋中以溫度121℃︽壓力 1.2 kg/cm2下滅菌30 分鐘︽冷卻至室溫︽備用〈
(2). 培養基 Tryptic soy agar (TSA) 之配製「
培養基Tryptic soy agar (TSA) 40 g 溶於 1 升之二次水中︽攪拌均勻︽置於高 壓滅菌鍋中以溫度121℃︽壓力 1.2 kg/cm2下滅菌30 分鐘︽備用〈
1-3. 紙錠瓊脂擴散試驗(Disc Agar Diffusion Test)分析步驟 101
利用 TSB 將金黃色葡萄球菌調整成 McFarland 0.5 濁度標準 (1.5 × 108 CFU/ml)︽痤瘡桿菌調整成 McFarland 4 濁度標準 (12 x 108 CFU/ml)︽再以 1:9 比率 加入尚未凝固之 TSA 培養基︽將上述混合液每 10 ml 分裝於培養皿中〈萃取物以 50%甲醇溶解︽滴入直徑為 8 mm 紙錠烘烤︽各組依每紙錠中所含劑量分組︽將含 萃取物之紙錠置於金黃色葡萄球菌培養皿上︽於 37 ℃恆溫培養 24 小時︽痤瘡桿 菌於 37 ℃恆溫厭氧培養 24 小時觀察抑菌圈以評估各萃取物對金黃色葡萄球菌與 痤瘡桿菌的抑菌效能〈
萃取物依照不同劑量與細菌直接作用︽利用抑菌圈評估抗菌活性︽本論文將 可觀察之最小抑制圈生長之劑量定義為最低有效劑量︽每次實驗皆以 penicillin 紙 錠(10U)作為正對照組︽萃取物之抑菌圈直徑與 penicillin 抑菌圈直徑之比值︽做為 比較抗菌活性之依據〈
Ratio % = (實驗組之抑菌圈/penicillin 之抑菌圈)×100
2. 細菌形態學分析 2-1. 分析原理
掃描式電子顯微鏡(SEM「Scanning Electron Microscope)主要是利用高加速電 壓之入射電子束打擊在樣品後︽產生相關二次訊號來分析︽對於研究物體之表面 結構功效特別顯著︽例如「材料之斷口︾生物醫學︾化學︾物理等方面最多〈
2-2. 試液配製
(1). 前固定液「glutaraldehyde (2). 後固定液「osmium tetroxide 2-3. 實驗步驟
細菌樣品 PBS 清洗後︽以固定液於 4℃反應 2 小時︽減緩細胞中酵素的活性︽
再用系列酒精濃度 35%50%70%85%95%100%進行脫水︽再加入利用臨 界點乾燥(CPD)約 24 小時後︽在碳帶上固定樣品(mounting) ︽鍍膜再上機觀察〈
3. 脂肪分解酵素(Lipase)活性的抑制 101 3-1. 分析原理
脂解酵素(lipase︽Triacylglycerol acylhydrolase︽EC 3.1.1.3)催化三酸甘油酯 (triacylglycerols)水 解 成 甘 油 或 是 單 酸 甘 油 酯(monoacylglycerols)與 雙 酸 甘 油 酯 (diacylglycerols)與其脂肪酸〈脂解酵素普遍存在於生物界︽痤瘡桿菌可利用此酵素 分解皮膚上油脂維持自生所需之養分︽利用抑制lipase 酵素達到抑菌的作用〈
3-2. 分析步驟
利用Tris Buffer (pH 8.0) 配製 4-methylumbelliferyl butyrate solution (10 µM)︽
lipase solution (100 U/ml)︽sodium citrate (0.1 M)︽ 將 待 測 物 25 µL 與 4-methylumbelliferyl butyrate solution 50 µL 均勻混和再加入 lipase solution 25 µL 反應 30 分鐘︽再加入 sodium citrate 100 µL 終止反應〈以 Tris Buffer 與 sodium citrate 做 為空白組︽扣除背景值︽再使用Fluorometrical microplate reader 測量螢光數 (λex:
365 nm, λem: 445 nm )〈
4. 角質細胞增生抑制實驗 4-1. 分析原理
角質細胞不正常增生︽是引起痤瘡的第一步︽荷爾蒙與發炎因子可以調控角質 細胞的增生〈因此利用不同的誘導劑︽刺激角質細胞增生︽藉此評估抑制角質細 胞增生的能力〈
4-2. 試液配製
培養液︾Phosphate buffer solution︾MTT reagent 配製方法與 RAW264.7 細胞相同〈
4-3. HaCaT 細胞 培養與分析步驟 (1). 培養方法「
將培養皿中的舊培養液(DMEM)吸出︽用 PBS 清洗一至兩遍︽吸出 PBS︽加 入未稀釋之Trypsine 作用 10 分鐘︽加入培養液終止反應︽於 4 ℃轉速 1200rpm 離 心後以培養液調整細胞至適當濃度，分配至10 公分培養皿中︽再放回培養箱在 37
℃︽5% CO2中培養〈
(2). 實驗步驟
HaCaT 細胞數目 1.0×105 cell/ml 200 µl 種於 96 孔盤︽24 小時後加入萃取物培 養 24 小時後︽去除上清液︽剩餘的細胞部份以 PBS 清洗 2 次後︽加入 90 µl 之 DMEM 及 10 µl MTT (500 µg/ml)靜置 4 小時後︽取出 50 µl 之上清液︽再加入 200 µl 含 0.04 N 之 HCl Isopropanol 至 Formazan 結晶溶解後︽以 ELISA reader (600 nm) 測吸光值︽評估待測物之細胞毒性〈
(3). 抑制百分比 (Cytotoxicity %)「
C % = (1≒(實驗組之 O.D.值/對照組之 O.D.值))×100 5. 體外抗發炎試驗 50
5-1. 分析原理
發炎反應常由於細菌︾病毒侵入體內︽或受到外界刺激所釋放出毒素引起︽使 巨噬細胞產生一些連鎖的反應〈利用脂多醣(lipopolysaccharide︽LPS)誘導老鼠巨 噬細胞(RAW 264.7)︽ 評估是否具抑制發炎的能力〈
5-2. 試液配製 (1). 培養液「
將Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)及 3.7 g NaHCO3 溶於 1 升之
滅菌水後攪拌均勻︽將pH 值調至 7.4︽以 0.22 µm 之濾膜過濾︽再加入 10 % Fetal bovine serum︽1 % L-Glutamine 及 1 % Penicillin-Streptomycin〈
(2). Phosphate buffer solution (PBS)之配製「
分別秤取 0.20 g 的 KCl︾8.00 g 的 NaCl︾1.14 g 的 Na2HPO4與 0.20 g 的 KH2PO4︽溶於1 公升的蒸餾水︽配製成 PBS 溶液︽使用前放入高壓滅菌鍋滅菌〈
(3). Griess reagent 配製方法「
分別秤取 0.25 g 的 Napthyl-Ethylene-Diamine-Dihydrochloride 與 2.50 g 的 Sulfanilamide 溶於 15 ml 之 85% H3PO4後加入235 ml 二次水︽避光儲存於 4 oC 冰 箱備用〈
(4). MTT reagent 配製方法「
精秤50 mg MTT︽加入 PBS (10 ml)溶解後︽以 0.22 µm 濾膜過濾︽避光儲存 於4 oC 冰箱備用〈
5-3. RAW 264.7 吞噬細胞培養與分析步驟 (1). 培養方法「
將培養皿中的舊培養液(DMEM)吸出︽用 PBS 清洗一至兩遍︽吸出 PBS︽加
入培養液調整細胞至適當濃度︽分配至 10 公分培養皿中︽再放回培養箱在 37 ℃︽
5% CO2中培養〈
(2). 分析原理「
以 LPS 誘導 RAW264.7 產生 Nitric Oxide (NO)︽NO 在酸性條件下遇到 Sulfanilamide 及 Napthyl-Ethylene-Diamine-Dihydrochloride 產生紅色的 Azo Product︽
用ELISA 波長 530 nm 測定 〈 (3). 實驗步驟
取200 µl 之 RAW 264.7 細胞(數目 4.0×105 cell/ml)植入於 96 孔盤︽24 小時後 加入萃取物或 L-NAME (正對照組)與 LPS 500 ng/ml 培養 18 小時︽取出上清液 100 µl 並加入 Griess reagent 100 µl 測試︽利用 NaNO2製作 standard curve︽以 ELISA reader 530 nm 為 NO 之吸光值測試〈剩餘的細胞部份以 PBS 清洗 2 次後︽
加入90 µl 之 DMEM 及 10 µl MTT (500 µg/ml)靜置 4 小時後︽取出 50 µl 之上清液︽
再加入 200 µl 含 0.04 N 之 HCl Isopropanol 至 Formazan 結晶溶解後︽以 ELISA reader (600 nm) 測吸光值︽評估待測物之細胞毒性〈
(4). 抑制百分比 (Concentration of Inhibition ︽IC %)「
IC % = (1≒(實驗組之 O.D.值/對照組之 O.D.值))×100 6. 痤瘡桿菌誘導體外抗發炎試驗
6-1. 分析原理
痤瘡的發炎病程︽常由於痤瘡桿菌所釋放出毒素引起︽利用 LPS 做為正對照 組︽瞭解痤瘡桿菌是否具有誘導老鼠巨噬細胞(RAW 264.7)與人類����������������������������������單核球細胞 (THP-1)︽產生發炎介質的能力︽並以此模式評估石榴萃取物之抑制發炎的能力〈
6-2. 試液配製
RAW 264.7 細胞培養如前所述〈
THP-1 細胞培養之 Phosphate buffer solution︾MTT reagent 配製方法與 RAW264.7 細胞相同〈
THP-1 細胞培養液配製方式如下「
將Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)及 2.2 g NaHCO3 溶於 1 升 之滅菌水後攪拌均勻︽將 pH 值調至 7.4︽以 0.22 µm 之濾膜過濾︽再加入 10 % Fetal bovine serum︽1 % L-Glutamine 及 1 % Penicillin-Streptomycin〈
6-3. THP-1 人類����������������������������������單核球細胞培養與分析步驟 (1). 培養方法「
THP-1 為懸浮型細胞︽將培養皿中的舊培養液(RPMI)與細胞一同吸出︽加入 培養液調整細胞至適當濃度︽分配至10 公分培養皿中︽再放回培養箱在 37 ℃︽5
% CO2中培養〈
(2). 熱處理痤瘡桿菌「
痤瘡桿菌菌液濃度調整為濁度4︽用 PBS 清洗 2 次去除培養基︽在溫度為 80
oC 水浴鍋加熱 30 分鐘︽殺����������������������������������死痤瘡桿菌〈剩餘之細胞殘渣︽以冷凍乾燥處理後備用〈
(3). 實驗步驟
RAW 264.7 細胞數目 4.0×105 cell/ml 200 µl 種於 96 孔盤︽24 小時後加入萃取
物與熱處理痤瘡桿菌 100 µg/ml 培養 18 小時︽取出上清液 100 µl 並加入 Griess reagent 100 µl 測試︽利用 NaNO2製作standard curve︽以 ELISA reader 530 nm 為 NO 之吸光值測試〈剩餘的細胞部份以 PBS 清洗 2 次後︽加入 90 µl 之 DMEM 及 10 µl MTT (500 µg/ml)靜置 4 小時後︽取出 50 µl 之上清液︽再加入 200 µl 含 0.04 N 之 HCl Isopropanol 至 Formazan 結晶溶解後︽以 ELISA reader (600 nm) 測吸光值︽
評估待測物之細胞毒性〈
THP-1 細胞數目 1.0×106 cell/ml 1000 µl 種於 24 孔盤︽24 小時後加入萃取物 與熱處理痤瘡桿菌 200 µg/ml 培養 18 小時︽取出上清液 100 µl 並加入 Griess reagent 100 µl 測試︽利用 NaNO2製作standard curve︽以 ELISA reader 530 nm 為 NO 之吸光值測試〈剩餘的細胞部份以 PBS 清洗 2 次後︽加入 90 µl 之 DMEM 及 10 µl MTT (500 µg/ml)靜置 4 小時後︽取出 50 µl 之上清液︽再加入 200 µl 含 0.04 N 之 HCl Isopropanol 至 Formazan 結晶溶解後︽以 ELISA reader (600 nm) 測吸光值︽
評估待測物之細胞毒性〈
(4). 抑制百分比 (Concentration of Inhibition IC %)「
IC % = (1≒(實驗組之 O.D.值/對照組之 O.D.值))×100 7. 發炎相關蛋白質(iNOS 與 COX-2)表現量分析
7-1. 分析原理
蛋白質根據其分子量不同︽在 SDS-PAGE︽樣本中分子量越小的分子︽就跑
得越下面〈
7-2. 試劑製備
(1). 懸浮緩衝液( Radioimmunoprecipitation Assay Buffer, RIPA )
50mM Tris-HCl, pH 7.4︾1 % NP-40︾0.25 % Sodium deoxycholate︾150 mM NaCl︾1 mM EDTA︾1 mM PMSF︾1 µg/ml Aprotinin︾1 µg/ml Leupeptin︾1 µg/ml Pepstatin︾1 mM Na3VO4︾1 mMNaF〈
(2). Running buffer
0.025 M Tris-base︾0.192 M Glycin︾0.1 % SDS〈
(3). Transfer Solution (pH 8.3)
0.025 M Tris-base︾0.192 M Glycin︾20 % MeOH〈
(4). Blocking Solution
1 % Bovine Serum Albumin︾0.1 % Tween 20︾0.1 % NaN3 in PBS〈
(5). AP buffer
100 mM NaCl︾5mM MgCl2︾100mM Tris base (pH 9.5)〈
(6). NBT/BCIP 之呈色劑
將NBT/BCIP 呈色錠加入 10 ml H2O 溶解〈
7-3. SDS-PAGE 之製作
(1). 10 % Tris-glycine SDS-polyacrylamide gel
H2O 1.9 ml
30 % acrylamide 1.7 ml 1.5 M Tris�pH8.8 1.3 ml
10 % SDS 0.05 ml
10 % ammonium persulfate 0.05 ml
TEMED 0.002 ml
5.000 ml (2). 5 % Stacking gel
H2O 1.4 ml
30 % acrylamide 0.33 ml 1 M Tris�pH6.8 0.25 ml
10 % SDS 0.02 ml
10 % ammonium persulfate 0.02 ml
TEMED 0.002 ml
2.000 ml
7-4. 分析步驟
收集已處理過的細胞︽加入50 µl 之 RIPA︽放置於-20 ℃冰箱 24 小時以上︽
將細胞溶解〈細胞溶解液在 4 ℃下︽15000 rpm 離心 30 分鐘〈取上清液︽利用 Bradford 法定量總蛋白質含量〈取 20 µg 之蛋白質樣本︽注入已配置好之 10 % SDS-PAGE 膠體中〈在 95V 下電泳三小時後︽利用電轉印槽�Electrotransfer tank 以250 mA 將蛋白質自 SDS-PAGE 轉印至 Hybond-PVDF 膜︽轉印完成後︽以 1 % BSA blocking solution 作用 1～2 小時︽再取出 PVDF 膜︽置入 1:1000 之一級抗體︽
於 4 ℃下持續振搖作用隔夜〈取出 PVDF 膜︽以 PBST 振搖 5 分鐘︽清洗 3 次〈
再加入1:5000 之二級抗體︽作用 1 小時後︽以 PBST 振搖 5 分鐘︽清洗 3 次〈加 入NBT/ BCIP 之呈色劑︽室溫下避光︽至呈色後加入清水洗去呈色劑後晾乾〈
8. PGE2 ︾IL-8︾TNF-α 含量分析 8-1. 分析原理
酵素連結免疫吸附����������������������������������分析(enzyme-link immunosorbent assay︽ELISA)︽利用抗原 (antigen︽就是蛋白質)與抗體(antibody)結合的專一性︽加上酵素的呈色(或產生螢
光)反應︽來顯示特定蛋白質是否存在〈檢測時︽將待測檢體蛋白質固定在一個介
面上�非專一性的結合 ︽加入一次抗體(待測的蛋白質具專一性的抗體)來偵測︽
再加入另一個對一次抗體有專一性之二次抗體的酵素
(酵素連結抗體︽enzyme-labeled antibody)︽二次抗體與一次抗體產生專一性結合併藉此將酵素也帶到有蛋 白質存在的位置︽然後加入酵素的受質(substrate)︽經過作用︽酵素會催化受質反 應而呈現顏色或產生螢光︽最後在介面上特定位置呈色或螢光量︽檢測該蛋白質 的含量〈
8-2. 分析步驟
配製PGE2 標準品濃度 39.1-2500 pg/ml︽IL-8 標準品濃度 15.6-1000 pg/ml︾
TNF-α 標準品濃度 15.6-1000 pg/ml︽分別加入 50 µl 之標準品及樣品至 96-well kit︽
TNF-α 標準品濃度 15.6-1000 pg/ml︽分別加入 50 µl 之標準品及樣品至 96-well kit︽