石榴萃取物之單一劑量皮膚急性毒性試驗

石榴萃取物之單一劑量毒性試驗︽利用建立大白鼠單一劑量皮膚急性毒 性試驗︽評估可能產生的皮膚毒性〈結果顯示︽石榴萃取物於濃度 1 mg/site︾

5 mg/site 與 10 mg/site 時︽皆不具有皮膚刺激的作用〈如表三十︾三十一與 圖二十〈

表二十五︾Neomycin 單一劑量皮膚刺激試驗紅腫比較

Neomycin 10% 20% 40% 100 % DMSO

0 hr 0 ± 0 0 ± 0 1.22 ± 0.92 1.32 ± 1.83 24 hr 0.04 ± 0.06 3.36 ± 2.92 12.26 ± 7.02 2.26 ± 0.57 48 hr 3.25 ± 2.76 11.22 ± 14.01 13.54 ± 2.33 0.48 ± 0.42

表二十六︾紅腫程度評分比較表

評讀分數 皮膚刺激性 嚴重程度

﹦0.0 - 1.0 Nonirritant (完全����������������������������������無刺激性) ≒

﹦1.0 - 3.0 Negligible irritant (幾乎無刺激性) ∞

﹦3.0 - 10 Mild irritant (弱刺激性) ∞∞

﹦10 - 20 Moderate irritant (中度刺激性) ∞∞∞

﹦20 Severe irritant (強刺激性) ∞∞∞∞

表二十七︾Neomycin 紅腫程度評分比較表

0 hr 24 hr 48 hr

10% Neomycin ≒ ≒ ∞

20% Neomycin ≒ ∞∞ ∞∞∞

40% Neomycin ∞ ∞∞∞ ∞∞∞

0 小時

24 小時

48 小時

Solvent control 10 20 40 (DMSO) Neomycin (%)

圖十八︾不同濃度的Neomycin 所引發之大鼠急性皮膚毒性 圖示為每格2.5x2.5 cm²

表二十八︾Esculetin 之單一劑量皮膚急性毒性試驗評分表

Esculetin 100 nM/site 500 nM/site 1 µM/site 5 µM/site 10 µM/site 0 hr 0.22 ± 0.27 0.28 ± 0.25 0.42 ± 0.33 0.07 ± 0.12 0.65 ± 0.14 24 hr 1.12 ± 0.75 6.60 ± 3.44 32.28 ± 2.80 39.06 ± 9.23 34.40 ± 12.13 48 hr 1.41 ± 0.97 18.29 ± 6.36 28.66 ± 3.64 41.83 ± 5.27 61.29 ± 14.18

表二十九︾Esculetin 皮膚塗藥前後紅腫比較

0 hr 24 hr 48 hr

Esculetin 10 µM/site ≒ ∞∞∞∞ ∞∞∞∞

Esculetin 5 µM/site ≒ ∞∞∞∞ ∞∞∞∞

Esculetin 1 µM/site ≒ ∞∞∞∞ ∞∞∞∞

Esculetin 500 nM/site ≒ ∞∞ ∞∞∞

Esculetin 100 nM/site ≒ ∞ ∞

圖十九︾不同濃度的Esculetin 所引發之大鼠急性皮膚毒性 site「每格 2.5x2.5 cm²

0 小時

5 µM/site 10 µM/site Esculetin

500 nM/site 1 µM/site 100 nM/site

0 小時

24 小時

48 小時

表三十︾石榴萃取物之單一劑量皮膚急性毒性試驗評分表

石榴萃取物 0.1 mg/site 1 mg/site 5 mg/site 10 mg/site 0 hr 0.67 ± 0.13 0.58 ± 0.21 0.16 ± 0.05 0.35 ± 0.18 24 hr 0.28 ± 0.80 0.28 ± 0.80 0.06 ± 0.23 0.40 ± 0.13 48 hr 0.66 ± 0.64 0.66 ± 0.64 0.83 ± 0.27 0.29 ± 0.18

表三十一︾石榴萃取物皮膚塗藥前後紅腫比較

石榴萃取物 0.1 mg/site 1 mg/site 5 mg/site 10 mg/site

0 hr - - - -

24 hr - - - -

48 hr - - - -

圖二十︾不同濃度石榴萃取物所引發之大鼠急性皮膚毒性 site「每格 2.5x2.5 cm²

0 小時

24 小時

48 小時

10 石榴 mg/site

5 1

0.1

二、石榴萃取物單一劑量皮膚毒性之切片分析

將塗抹藥物48 小時後之皮膚組織取下，利用 Haematoidin-Eosin 染色，以縱 切觀察皮膚表皮層與真皮層之病理變化，結果顯示：Sham 組的皮膚組織切片中 如圖(A)，可以看見表皮層(a)與真皮層(b)，其中角質層完整，角質細胞多層排 列 ， 下 方 顆 粒 細 胞 層 、 有 脊 層 與 基 底 層 細 胞 排 列 整 齊 。 而 正 對 照 組 塗 抹 Esculetin 後的皮膚組織切片(B)，其角質層部份明顯脫落，顆粒層有發炎細胞浸 潤，表示 Esculetin 對皮膚確實有刺激作用，對於真皮層則無明顯影響。(C)-(F) 圖表示石榴萃取物由低濃度到高濃度，分別為0.1 mg/site、1 mg/site、5 mg/site 與10 mg/site，所有的結果皆顯示，石榴萃取物對皮膚皆無明顯的影響。

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

圖二十一︾石榴萃取物於皮膚之單一劑量毒性組織切片

(A)Sham 組、(B)Esculetin (1 µM/site)、(C) 石榴萃取物 0.1 mg/site、(D) 石 榴萃取物1 mg/site、(E) 石榴萃取物 5 mg/site 與(F) 石榴萃取物 10 mg/site

a b b

a

第四章︾討論

一︾現代中醫常用於抗痤瘡藥材

根據古代典籍考察與現代中醫臨床常用之抗痤瘡藥材整理如表三與表六︽

我們選擇 34 種常用之中藥材進行現代抗痤瘡活性篩選︽依照功效整理如表三

十二發現︽其中有 20 種清熱藥︾4 種補益藥︾3 種發散藥︾2 種固澀藥︾3 種

利水滲濕藥及2 種止咳平喘藥︽其中以清熱藥佔有最高比例〈

表三十二︾34 種常用抗痤瘡之中藥材藥效分類����������������������������������

效用分類����������������������������������   中藥  

清熱藥  

大青葉︾連翹︾白頭翁︾黃連︾淡竹葉︾知母︾金 銀花︾決明子︾苦參︾白鮮皮︾黃柏︾地骨皮︾夏 枯草︾黃芩︾梔子︾青蒿︾蒲公英︾白薇、蓮心︾

板藍根

補益藥   芍藥︾生地黃︾甘草︾當歸   解表藥   白芷︾薄荷︾荊芥  

固澀藥   石榴︾訶子  

利水滲濕藥   薏苡仁︾茯苓︾茵陳蒿   止咳平喘藥   桑白皮︾天花粉  

此外利用抑制金黃色葡萄球菌與痤瘡桿菌之抗菌試驗︾抑制脂質分解酵素 活性試驗︾體外 LPS 誘導 RAW264.7 所產生的 NO 細胞之抗發炎試驗與清除 DPPH 自由基之抗氧化活性試驗做為抗痤瘡活性評估方式︽綜合結果以大青葉、

黃連、苦參、黃柏、黃芩、石榴與訶子萃取物，同時具有良好的抗菌與抗發炎 活性，且黃連、石榴、訶子與黃芩更具有抑制脂質分解酵素的活性。

根據上述效用分類，黃連與黃芩屬於清熱藥，清熱藥︽凡以清解裡熱作用 的藥物〈清熱藥的藥性多為寒涼︽入肺︾胃︾心︾肝︾大腸經〈又功效與作用以 及熱證的不同類����������������������������������型︽可分為清熱泄火藥︾清熱燥濕藥︾清熱涼血藥︾清熱解毒藥︾

清虛熱藥等五類����������������������������������〈如表三十三〈

表三十三、清熱藥功效分類

公英、板藍根、魚腥草、苦參等能抗流感病毒、皰疹病毒等。又現已明確的抗菌

有效成分有小檗鹼(黃連、黃柏)、黃芩素(黃芩)、苦參鹼(苦參)等。此外金銀花、

大青葉、板藍根、魚腥草。穿心蓮、黃連、黃芩、苦參、龍膽草、知母、桅子、

赤芍、丹皮、玄參等對角叉菜膠所致大鼠足腫脹有顯著的抑制作用。金銀花、知 母、黃芩、丹皮、赤芍等對大鼠佐劑性關節炎也有一定的抑制作用 ^113-120。綜合 上述清熱藥的現代藥理作用與古書的討論︽推測可能是清熱藥具有開發治療痤瘡 潛力的主因〈

石榴與訶子屬於固澀藥，凡以收斂固澀為主要功用，用於治療各種耗散滑 脫的藥物，叫做固澀藥。大多性味酸澀，具有斂汗、止瀉、固精、止帶、止血、

止嗽等作用，入肺經或大腸經，具有歛肺止咳喘和澀腸止瀉痢作用。屬歛肺止 咳之品，對痰多壅肺所致的咳喘不宜用；屬澀腸止瀉之品，對瀉痢初起，邪氣 方盛，或傷食腹瀉者不宜用。常見藥材有：五味子、肉豆蔻、五倍子、烏梅、

訶子與石榴皮。用於痤瘡治療時機常為療程後期，借此類藥物具有收澀的功能，

使痤瘡部位消炎，促使傷口加速癒合，固澀藥中的訶子、五倍子、肉豆蔻與石 榴皆有文獻指出具有抗菌與抗發炎的活性 ^50,121-122，因此固澀藥為另一種具有開 發治療痤瘡藥物之良好標的。

二︾抗痤瘡活性關聯性評估

由於唇形科植物廣泛用於傳統醫藥和園藝︽如「黃芩︾荊芥︾夏枯草與薄 荷︽甚至現代常用的替代性療法如芳香療法︽如「薰衣草︾鼠尾草︾迷迭香︽

植物的多元性與實用性在應用與開發占有舉足輕重的地位︽因此我們利用相近

基源之28 種唇形科植物進行植物化學成分與抗痤瘡活性篩選︽試圖找到其可能

之關聯性〈

綜合結果︽植物成分與抗痤瘡活性關係中︽總多酚類����������������������������������與抗氧化活性︽黃酮 類����������������������������������成分與抗發炎︾抗菌活性具有良好的正相關︽抗痤瘡活性間關係則是︽抗菌 活性與抗發炎活性具有良好的正相關︽因此未來可以快速的篩選其植物成分︽

並高效率地篩選潛在具有抗痤瘡活性的植物〈

三︾具開發潛力之抗痤瘡中草藥

根據唇形科抗痤瘡活性與成分所建立之關聯性︽多酚類����������������������������������含量高之薰衣草︾鼠 尾草及迷迭香植物皆表現出較強的抗氧化能力與抗發炎活性︽其中迷迭香屬植物 具有較強的抗炎和抗金黃色葡萄球菌的活性︽因此迷迭香也可以發展成為抗痤瘡 產品〈

因此利用此關聯性評估常用於抗痤瘡中草藥︽含有較高多酚類����������������������������������含量的藥材如 石榴︾訶子具有很好的抗氧化與抗菌效果︽其中石榴更具有良好的抗發炎與抗氧 化活性︽以及抑制脂質分解酵素〈石榴在傳統分類����������������������������������為固澀藥︽在古代典籍中雖較 少記載︽但實驗發現石榴富含多酚類����������������������������������成分以及具有良好抗痤瘡功效︽確實可開發 成為新一代可具有多種功能的抗痤瘡藥〈

四︾石榴多酚應用於痤瘡治療之抗生素開發潛力

痤瘡形成的原因，目前最常被討論的是痤瘡桿菌於毛囊滋生，並分解毛囊內 皮脂，而形成引起發炎的物質，吸引白血球進入引發更嚴重的結節性發炎反應。

痤瘡的治療，則是針對上述成因，及連帶引起之發炎反應，多使用外敷或內服抗 生素如：紅黴素、四環黴素、美滿黴素、鉑黴素、膚即淨、麗歐迅及殺菌劑等，

但資料顯示人體皮膚內的痤瘡桿菌對於常用抗生素，有越來越多抗藥性情形產生，

使痤瘡的治療效果不佳，因此開發新的抑制痤瘡桿菌生長的抗生素類藥物，是一 個日漸重要的議題。根據實驗結果，石榴多酚在低濃度下，即具有很好的抑菌活

性，其中 1 與 2 成分，對於金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為

6.25 µg 與 12.5 µg。

一般抗生素作用機制，包含：抑制細菌細胞壁合成、改變細菌細胞膜功能、

干擾細菌蛋白質合成、阻斷細菌核酸合成、影響細菌細胞新陳代謝。抑制脂質分 解酵素(Lipase)活性是較新的抑菌機轉，此酵素是細菌分解皮膚脂肪獲得養分的 方式，抑制酵素活性，減少細菌能量獲取，借以抑制細菌生長，石榴萃取物與多 酚類成份不只抑制細菌生長，同時兼具有抑制脂質分解酵素活性，以減少抗藥性 的產生，在新一代抗生素開發，具有很高的潛力。

五︾石榴多酚應用於痤瘡治療之抗發炎能開發潛力

痤瘡桿菌孳生，細菌因脂質分解酵素產生之有機酸，常誘發皮膚的發炎反 應 ， 因 此 本 論 文 利 用 熱 處 理 之 痤 瘡 桿 菌 以 常 使 用 之 發 炎 誘 導 劑 脂 多 醣 (lipopolysaccharide LPS)，做為正對照組，誘發免疫細胞產生發炎反應。此外，

抗體內發炎模式研究中，熱處理之痤瘡桿菌可誘導小鼠 ^123-125 和人類 ¹²⁶ 免疫刺 激反應，在獸醫常被應用作為免疫興奮劑 ¹²⁷。文獻指出，痤瘡桿菌與 LPS 作用 機轉類似，如圖二十二。可藉由活化 Toll-like receptor(TLRs)，尤其是 TLR2 和 TLR4¹²⁸，刺激藉 MAPK、ERK 和 JNK 途徑，進而誘發 IKB 與 NF-κB，釋放炎 性細胞因子如 IL-1α，IL-6，IL-8 和 TNF-α¹²⁸，其中又以 IL-8 誘導後產生的量最 多，在痤瘡患者皮膚檢品中，IL-8 基因表現也最為明顯¹²⁹。

IL-8 是一種強的中性粒細胞趨化因子，因此痤瘡的發炎現象，可能是痤瘡桿 菌誘導的 IL-8 的分泌，造成發炎的最主要因素 ¹³⁰。在本論文中，熱處理之痤瘡 桿菌會大量誘發THP-1 細胞產生 IL-8，石榴多酚 1-4 皆具有抑制 IL-8 與 TNF-α 的分泌。同時也可以抑制由LPS 或 P. acnes 誘導細胞產生 nitric oxide (NO) 的能 力以及減少iNOS 蛋白質的表現。4 成分更具有抑制 COX-2 蛋白質表現︽以減少 前列腺素(PGE2)產生〈

雖然對痤瘡桿菌抗原成分尚未完全確定，在痤瘡桿菌的細胞壁所分泌的 peptido 多醣，也有被報導具有誘導 TLR2 和 TLR4 人類角質形成細胞表現的活

性 ¹³¹。由此可知，痤瘡桿菌所造成的發炎反應，不單只是藉由免疫細胞產生，

性 ¹³¹。由此可知，痤瘡桿菌所造成的發炎反應，不單只是藉由免疫細胞產生，